CN101705281A

CN101705281A - 检测沙门氏菌的实时荧光pcr试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN101705281A
Application number: CN200910154284A
Authority: CN
Inventors: 程苏云; 梅玲玲; 朱敏; 龚璞
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2009-11-19
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2029-11-19
Also published as: CN101705281B

Abstract

本发明提供了一种检测沙门氏菌(Salmonella)的实时荧光PCR试剂盒及其检测方法。所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′-TTG TCC AGT CRA CRGAYG AA-3′，下游引物：5′-TCG CGA CGG TTA CGR AAT TC-3′，荧光探针：5′-FAM-TGT CAG CGG CGC TG-MGB-3′，其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。本发明的有益效果主要体现在：靶细菌的检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对沙门氏菌进行快速、准确、特异检测。

Description

检测沙门氏菌的实时荧光PCR试剂盒及检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种检测沙门氏菌(Salmonella)的实时荧光PCR试剂盒及其检测方法。

(二)背景技术

沙门氏菌广泛存在于自然界，至今已经发现的血清型就有2500种以上，我国已发现216种。与人类疾病有关的血清型主要集中于A～E群，包括：伤寒沙门氏菌、甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌、新港沙门氏菌等，其中以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及猪霍乱沙门氏菌最为常见。沙门氏菌引起的食物中毒在日本、欧美占首位，亦是我国细菌性食物中毒的常见菌。在我国内陆地区，有70％～80％细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的，是对人类和动物健康有极大危害的一类食源性病原菌。

目前常用的沙门氏菌检测方法过程复杂，周期长，所需试剂繁多。80年代以来发展起来的沙门氏菌PCR检测技术，为沙门氏菌的快速诊断提供了可能，但PCR方法易产生假阳性，稳定性和重复性也较差，使其应用受到限制。最近，一种基于TaqMan-MGB探针的实时PCR检测技术成功应用到了转基因检测、药物疗效评价、基因表达研究、传染病诊断等诸多领域的检测上，相对于常规的PCR技术而言，TaqMan-MGB探针荧光PCR技术有着更高的敏感性、特异性和重复性，而且时间更缩短为2～3h以内，是一种较理想的方法。

(三)发明内容

本发明目的是根据沙门氏菌invE基因设计引物和TaqMan-MGB探针，提供一种检测沙门氏菌的实时荧光PCR试剂盒及检测方法，可实现对沙门氏菌快速、准确、特异检测。

一种检测沙门氏菌(Salmonella)的实时荧光PCR试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-TTGTCCAGTCRACRGAYGAA-3′

下游引物：5′-TCGCGACGGTTACGRAATTC-3′

荧光探针：5′-FAM-TGTCAGCGGCGCTG-MGB-3′

其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。

本发明关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计及检测方法，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作沙门氏菌的定性检测，也可加入标准菌株DNA标准品进行定量检测。

为达到定量检测的效果，所述试剂盒还可包括沙门氏菌重组质粒DNA标准品，所述DNA标准品序列如下：ttgtccagt cgacggacga aatgtcagcggcgctggccg aatttcgtaa ccgtcgcga.以梯度浓度的DNA标准品在与样品DNA相同条件下进行实时荧光定量PCR扩增反应，以DNA标准品浓度的对数值为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品中沙门氏菌的浓度.

本发明应用新型TaqMan-MGB探针，建立的沙门氏菌实时PCR方法，可直接检测疑似病人血液、食品和环境中沙门氏菌，为沙门氏菌食物中毒事件快速诊断及迅速采取相应措施，避免任何食品来源疾病的暴发提供可靠工具。

本发明还涉及一种检测沙门氏菌的荧光定量PCR方法，所述方法包括：

(1)提取待测样品DNA；通常可采用热裂解煮沸法：取菌液1.5ml，10000rpm离心3min，弃上清，加1ml TE，10000rpm离心3min，倒去上清，再加蒸馏水50uL，混匀，在恒温金属浴仪中100℃作用10min，10000rpm离心5min，取上清。

(2)以待测样品DNA为模板，与特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶混合配制PCR反应体系，进行PCR反应，反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测；

所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-TTGTCCAGTCRACRGAYGAA-3′

下游引物：5′-TCGCGACGGTTACGRAATTC-3′

荧光探针：5′-FAM-TGTCAGCGGCGCTG-MGB-3′

其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团；

(3)择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，而且CT值小于35，则判断为阳性，即样本中存在沙门氏菌。

所述阴性对照品可按本领域常规方法选择，通常选择不含靶基因的非靶细菌，如副溶血性弧菌、单增李氏菌、志贺菌、空肠弯曲菌等。进一步，所述方法同时以梯度浓度的沙门氏菌标准菌株(ATCC 50079)的重组质粒DNA标准品在与样品DNA相同条件下进行实时荧光定量PCR扩增反应，以沙门氏菌(ATCC 50079)DNA标准品浓度的对数值为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品中沙门氏菌的浓度。所述DNA标准品序列如下：ttgtccagt cgacggacgaaatgtcagcg gcgctggccg aatttcgtaa ccgtcgcga。

所述PCR反应体系组成及反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，具体的，步骤(3)中PCR体系终浓度组成如下：

PCR缓冲液终浓度为1×

脱氧三磷酸核苷混合物各 0.1～0.5mmol/L

上、下游引物各 1.0μmol/L

荧光探针 0.4μmol/L

DNA聚合酶 0.5～5U/反应

模板DNA 10～103ng/μL

溶剂为ddH₂O。

所述PCR缓冲液为one step PCR缓冲液，其终浓度为1×，是指缓冲液各组分在反应体系中的终浓度与1×one step PCR缓冲液中各组分的浓度相同。1×one step PCR缓冲液的组成参见Takara公司的one stepPCR，Code：DRR039S。

实际使用中，通常选用将DNA聚合酶、反应用Buffer、dNTP等试剂预混在一起的Premix Type试剂(如Premix Ex Taq TM(2×))，TaKaRa，DRR039S)，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。

步骤(3)中PCR反应条件如下：95℃预变性10S，95℃变性5S，57.5℃退火40S，40个循环。

发明建立了利用TaqMan-MGB荧光定量PCR技术检测沙门氏菌的方法，并经检测食品污染样本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了PCR扩增技术，使得细菌的检测敏感性大大提高，而且由于荧光探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率。

在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会对结果分析带来影响，从而影响定量这一目的。

随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。

本发明的有益效果主要体现在：靶细菌的检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对沙门氏菌进行快速、准确、特异检测和鉴定。

(四)附图说明

图1为实时荧光定量PCR标准重组质粒检测；图中从左至右分别为7.1×10²拷贝数/μl、7.1×10¹拷贝数/μl、7.1拷贝数/μl、7.1×10^-1拷贝数/μl、7.1×10^-2拷贝数/μl、7.1×10^-3拷贝数/μl标准品。

图2为实时荧光定量PCR标准曲线。标准曲线为Y＝-3.895×lgX+17.43：对应的CT值；X：细菌的CFU；

图3为荧光定量PCR检测特异性结果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：特异性引物、荧光探针的获得

1、材料：

Premix Ex Taq TM(2×)购自TaKaRa公司(TaKaRa，DRR039S)；

MX3000P型定量PCR仪为美国STRATAGNE公司产品。

2、引物及探针设计与合成：

以沙门氏菌invE基因序列(注册号为U43253)为模板，使用PrimerExpress^TM(V2.0，美国ABI公司)软件分析TaqMan-MGB引物和探针位点，从中选择最佳组合：

上游引物：5′-TTGTCCAGTCRACRGAYGAA-3′

下游引物：5′-TCGCGACGGTTACGRAATTC-3′

荧光探针：5′-FAM-TGTCAGCGGCGCTG-MGB-3′

其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。

均由大连宝生物工程有限公司合成。

实施例2：沙门氏菌荧光定量PCR法特异性评价

1、菌株检测：

伤寒沙门菌(ATCC 50079)、鼠伤寒沙门菌(ATCC 50013)、甲型副伤寒沙门菌(ATCC 50002)、鸭沙门菌(ATCC 50083)、痢疾志贺菌(ATCC51570)、宋内氏志贺菌(ATCC 51334)、福氏志贺菌(ATCC 51573)、副溶血性弧菌(ATCC 33847)、大肠杆菌(ATCC 25922)、单增李斯特菌(CMCC 54001)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、腊样芽孢杆菌(CMCC63301)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)、奇异变形杆菌(ATCC 43071)购自中国生物制品检定所和中国微生物菌种保藏中心；乙型溶血性链球菌(ATCC 33152)购自上海汉尼公司提供；吉伟沙门菌、布伦登卢普沙门菌、科瓦利斯沙门菌、海德堡沙门菌、曼彻斯特沙门菌、姆班达长沙门菌由世界卫生组织沙门氏耐药性监测网提供。65株沙门菌、20株副溶血性弧菌、35株金黄色葡萄球菌分离自食物和中毒事件。20株志贺菌分离自腹泻病人。

上述各菌株分别用热裂解法提取DNA，然后用检测用上下游引物及探针在美国STRATAGNE公司MX3000P型定量PCR仪上进行PCR扩增。

(1)热裂解煮沸法：取菌液1.5ml，10000rpm离心3min，弃上清，加1ml TE，10000rpm离心3min，倒去上清，再加蒸馏水50uL，混匀，在恒温金属浴仪中100℃作用10min，10000rpm离心5min，取上清。

(2)总反应体系包括Premix Ex Taq TM(2×)(TaKaRa，DRR039S)12.5μL，上、下游引物(20μmol/L)各1.0μL，探针(20μmol/L)0.4μL，模板DNA量为6.0μL(约100ng/μL)，用ddH₂O补足25μL。反应管置于定量PCR仪进行荧光检测；

反应条件：95℃预变性10S，95℃变性5S，57.5℃退火40S，40个循环。

以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测菌株荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，CT值小于35，则判断为阳性。

PCR反应扩增包含上、下引物和探针序列在内的沙门氏菌相关DNA片断，长度为80bp，将纯化的扩增片段克隆到pMD18-T载体上构建扩增产物的重组质粒，并转化至大肠杆菌JM109内。大肠杆菌JM109经营养肉汤培养37℃18h后，抽提质粒DNA，将此抽提的DNA(具体序列为：ttgtccagt cgacggacga aatgtcagcg gcgctggccg aatttcgtaa ccgtcgcga)作为实时PCR检测沙门氏菌试验阳参。经OD值测定和拷贝数换算，本试验获得的阳参浓度为7.1×10⁹拷贝数/μl。经过10倍梯度稀释得到一系列标准品，分别相同条件下以不同浓度重组质粒标准品进行检测，并绘制标准曲线。

待测样本的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样本中的沙门氏菌的拷贝数。

2、样品检测结果

重组质粒标准品的检测结果参见图1，标准曲线参见图2。

特异性结果显示显示75株沙门氏菌的Ct值均小于35，而86株非沙门氏菌的Ct值大于35或扩增曲线成一平滑直线.

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCELISTING

<110>浙江省疾病预防控制中心

<120>检测沙门氏菌的实时荧光PCR试剂盒及检测方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

ttgtccagtc racrgaygaa 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

tcgcgacggt tacgraattc 20

<210>3

<211>14

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

tgtcagcggc gctg 14

<210>4

<211>58

<212>DNA

<213>Salmonella sp.

<400>4

ttgtccagtc gacggacgaa atgtcagcgg cgctggccga atttcgtaac cgtcgcga 58

Claims

1.一种检测沙门氏菌(Salmonella)的实时荧光PCR试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-TTGTCCAGTCRACRGAYGAA-3′

下游引物：5′-TCGCGACGGTTACGRAATTC-3′

荧光探针：5′-FAM-TGTCAGCGGCGCTG-MGB-3′

其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还含有沙门氏菌重组质粒DNA标准品，所述DNA标准品序列如下：ttgtccagtcgacggacga aatgtcagcg gcgctggccg aatttcgtaa ccgtcgcga。

3.一种检测沙门氏菌的荧光定量PCR方法，所述方法包括：

(1)提取待测样品DNA；

(2)以待测样品DNA为模板，与特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶混合配制PCR反应体系，进行PCR反应，反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测；所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-TTGTCCAGTCRACRGAYGAA-3′

下游引物：5′-TCGCGACGGTTACGRAATTC-3′

荧光探针：5′-FAM-TGTCAGCGGCGCTG-MGB-3′

其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同时以梯度浓度的重组质粒DNA标准品在与样品DNA相同条件下进行实时荧光定量PCR扩增反应，以DNA标准品浓度的对数值为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品中沙门氏菌的浓度；所述DNA标准品序列如下：ttgtccagt cgacggacga aatgtcagcggcgctggccg aatttcgtaa ccgtcgcga。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(3)中PCR体系终浓度组成如下：

PCR缓冲液终浓度为1×

脱氧三磷酸核苷混合物各0.1～0.5mmol/L

上、下游引物各1.0μmol/L

荧光探针 0.4μmol/L

DNA聚合酶 0.5～5U/反应

模板DNA 10～10³ng/μL

溶剂为ddH₂O。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(3)中PCR反应条件如下：95℃预变性10S，95℃变性5S，57.5℃退火40S，40个循环。