CN102539401A - 一种微生物的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物的快速检测方法，包括以下步骤：a、建模步骤：将标准微生物加入培养液中，标准微生物在培养液中生长，检测标准微生物生长过程中产生的信号，在标准微生物生长延迟期末，当检测信号下降时，记录标准微生物的检测时间；依据标准微生物的浓度和检测时间，得到微生物的浓度与检测时间的标准模型；b、检测步骤：将待测微生物加入培养液中，待测微生物在培养液中生长，检测待测微生物生长过程中产生的信号，在待测微生物生长延迟期末，当检测信号下降时，记录待测微生物的检测时间；依据所述待测微生物的检测时间和所述标准模型，得到待测微生物的浓度。本发明具有快速、准确、适用范围广等优点，能够有效排除背景干扰。
Description
技术领域
本发明涉及微生物的检测，特别涉及一种微生物的快速检测方法。
背景技术
微生物检测是环境或食品安全评估的重要内容，其中，细菌总数、大肠菌和致病微生物等作为国际公认的卫生检测指标，是判定环境或食品是否安全的重要科学依据。通过微生物检测可以正确评价环境或食品的微生物污染程度，为各项卫生管理工作提供科学依据，为相关疾病的针对性防治提供重要的科学指导，以确保人们的身体健康；同时，微生物检测对提高环境或食品质量、避免经济损失、保证出口等方面具有重要的意义。
传统的微生物检测方法为培养法，采用液体培养或膜过滤后固体培养的细菌扩增模式，在细菌浓度达到较高水平时进行形态观察或显微镜检；此类方法需要较长的培养时间，且步骤繁琐、工作量大，导致耗时较长，往往需要24-72小时甚至更久才能得到检测结果。目前，酶底物法已成为微生物检测的重要手段，此方法是利用微生物代谢产生的特异指示酶和相应发光底物水解反应后产生的光信号变化实现定性分析，再结合MPN计数法实现定量分析，可于18-24小时内获得检测结果，然而该方法的检测速度仍显滞后，检测结果也还不够准确。
为解决传统的酶底物法用时较长的问题，二十世纪初期，研究人员在自动化连续检测技术的基础上，利用酶底物反应信号与微生物浓度的关联性，结合阈值分析模式，展开了快速定性定量分析的研究。如图1所示，该方法主要是根据微生物生长曲线(即微生物生长产生的信号与检测时间的关系曲线)的特点，选择微生物指数增长期显著抬升段的酶底物反应的光信号绝对值或信号变化值作为检测终点阈值的判断依据，得到微生物的检测时间，建立微生物浓度与检测时间的标准模型，如图2所示；然后结合待测微生物的检测时间和标准模型可得待测微生物的浓度。该方法的检测时间由微生物的浓度决定，微生物的浓度越大，检测时间越短；与传统的微生物检测方法相比，可将检测时间缩短至4-18小时。
但是，此方法存在的问题是：
1、利用微生物生长指数期显著抬升段作为终点判定特征，100mL样品至少需要4小时方可得到检测结果。
2、由于样品中通常存在游离酶或其它化合物引起的背景干扰，使得检测得到的微生物生长曲线有漂移，而以信号绝对值或变化值判定阈值的方式无法克服漂移干扰，严重影响检测结果的准确性。
发明内容
为了解决现有技术中的上述不足，本发明提供了一种快速、准确、适用范围广的微生物检测方法。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种微生物的快速检测方法，包括以下步骤：
a、建模步骤
将标准微生物加入培养液中，标准微生物在培养液中生长，检测标准微生物在生长过程中产生的信号，在标准微生物生长延迟期末，当检测信号下降时，记录标准微生物的检测时间；
依据标准微生物的浓度和检测时间，得到微生物的浓度与检测时间的标准模型；
b、检测步骤
将待测微生物加入培养液中，待测微生物在培养液中生长，检测待测微生物在生长过程中产生的信号，在待测微生物生长延迟期末，当检测信号下降时，记录待测微生物的检测时间；
依据所述待测微生物的检测时间和所述标准模型，得到待测微生物的浓度。
进一步，所述标准微生物与所述待测微生物为相同类型的微生物。
进一步，所述培养液含有反应物质，所述反应物质与所述微生物的特征指示因子发生反应，产生信号。
优选地，所述信号为吸光度、荧光强度、电流量或电导率。
进一步，所述标准模型为：T＝algC+b，其中，C为微生物的浓度，T为微生物的检测时间，a和b为常数。
进一步，在所述步骤a和所述步骤b中，当所述信号下降到阈值时，记录所述微生物的检测时间。
优选地，所述阈值根据经验值设定。
优选地，所述阈值根据微生物生长延迟期末信号下降期的信号值或信号变化值设定。
优选地，当所述微生物的生长曲线的基线水平且所述微生物存在相同的检测基值时，所述阈值的大小等于所述信号下降期的信号值。
优选地，当所述微生物的生长曲线的基线水平且所述微生物存在相同或不同的检测基值时，所述阈值的大小等于所述信号下降期的信号变化值。
优选地，所述阈值根据微生物生长延迟期末信号下降期内生长曲线的切线的斜率值或斜率变化值设定。
优选地，当所述微生物的生长曲线的基线水平时，所述阈值的大小等于所述斜率值。
优选地，所述阈值的范围为[-100，-0.01]。
优选地，当所述微生物的生长曲线的基线水平或漂移时，所述阈值的大小等于所述斜率变化值。
优选地，所述阈值的范围为[-5，-1]。
进一步，微生物生长延迟期末信号下降期的数据采集频率≥0.04次/分钟。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、本发明选择微生物生长延迟期末的信号下降期为检测终点的判断依据，检测时间缩短2小时以上。
2、本发明以微生物生长曲线的切线的斜率值或斜率变化值作为检测终点的阈值判定依据，能够有效克服游离酶、氨基酸等产生的背景干扰，提高定性定量分析的准确性，提高方法的适用性。
附图说明
图1为背景技术中微生物的生长曲线；
图2为背景技术中微生物的标准模型；
图3为实施例1中各标样的生长曲线；
图4为实施例2中各标样的生长曲线；
图5为实施例3中各标样的生长曲线；
图6为实施例3中葡萄球菌的标准模型；；
图7为实施例4中粪大肠菌群的标准模型；
图8为实施例4中待测粪大肠菌群的生长曲线。
具体实施方式
实施例1
一种微生物的快速检测方法，用于检测水样中的大肠杆菌，包括以下步骤：
A、设定阈值和建模步骤
将4个大肠杆菌标样(标样a、标样b、标样c和标样d，其浓度C分别为95.30cfu、1.34×103cfu、1.22×104cfu和2.00×106cfu)分别加入到培养液中，各标样中的大肠杆菌分别在培养液中生长，培养液中含有反应底物4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖苷酸(MUG)，MUG分别与各大肠杆菌生长产生的代谢指示物β-D-葡糖醛酸糖苷酶发生特异性反应，产生荧光信号(激发波长为365nm，发射波长为450nm)，分别进行检测，得到各标样的生长曲线，如图3所示。
在各标样的生长延迟期末，荧光信号下降(此下降期内的数据采集频率为0.1次/分钟)，记录各标样信号下降期的荧光信号值范围，分别为5～15unit、0～15unit、5～15unit和5～15unit，共有的荧光信号值范围为5～15unit，可将阈值设置成该共有范围内的任一值，此处将阈值设置成6unit；
同样地，利用其它标准微生物或者待测微生物的生长延迟期末信号下降期的信号值设定阈值时，也使用相同的方法。
在各标样的生长延迟期末，当其荧光信号值分别下降到阈值6unit时，标样a、标样b、标样c和标样d的检测时间T分别为42428s、34971s、30857s和18000s；依据各大肠杆菌标样的浓度和检测时间，得到大肠杆菌的检测时间T与浓度C的标准模型，相应的函数表达式为T＝-5573.3lgC+53151，相关系数为0.9972。
B、检测步骤
将含有待测大肠杆菌的水样加入到培养液中，待测大肠杆菌在培养液中生长，培养液中含有反应底物MUG，MUG与待测大肠杆菌生长产生的代谢指示物β-D-葡糖醛酸糖苷酶发生特异性反应，产生荧光信号(激发波长为365nm，发射波长为450nm)，检测该荧光信号；在待测大肠杆菌的生长延迟期末，当荧光信号值下降到阈值6unit时，记录待测大肠杆菌的检测时间，为20974s，代入步骤A中的标准模型的函数表达式T＝-5573.3lgC+53151，得到待测大肠杆菌的浓度为5.93×105cfu。
本实施例中，根据信号值设定检测终点阈值的方法适用于生长曲线的基线水平且具有相同检测基值时微生物的检测，因为在生长曲线的基线稳定且具有相同的检测基值时，相同或不同浓度的同类微生物的生长延迟期的信号值基本一致；当存在背景值时，相同或不同浓度的同类微生物在不同背景下信号值会发生变化。
实施例2
一种微生物的快速检测方法，用于检测水样中的总大肠菌群，包括以下步骤：
A、设定阈值和建模步骤
将4个总大肠菌群标样(标样a、标样b、标样c和标样d，其浓度C分别为95.30cfu、1.34×103cfu、1.22×104cfu和2.00×106cfu)分别加入到培养液中，各标样中的总大肠菌群分别在培养液中生长，培养液中含有4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷酸(MUGal)，MUGal分别与各总大肠菌群生长产生的代谢指示物β-D-半乳糖苷酶发生特异性反应，产生荧光信号(激发波长为365nm，发射波长为450nm)，分别进行检测，得到各标样的生长曲线，如图4所示。
在各标样的生长延迟期末，荧光信号下降(此下降期内的数据采集频率为0.04次/分钟)，记录各标样信号下降期的信号值相对于基值的变化值范围，分别为-10～0unit、-15～0unit、-10～0unit和-10～0unit，共有的信号变化值范围为-10～0unit，可将阈值设置成此共有范围内的任一值，此处将阈值设置成-5unit；
同样地，利用其它标准微生物或者待测微生物的生长延迟期末信号下降期的信号变化值设定阈值时，也使用相同的方法。
在各标样的生长延迟期末，当各标样信号下降期的信号相对于基值的变化值分别达到阈值-5unit时，标样a、标样b、标样c和标样d的检测时间分别T为40114s、33428s、27257s和14914s；依据各总大肠菌群标样的浓度和检测时间，得到总大肠菌群的检测时间T与浓度C的标准模型，相应的函数表达式为T＝-5843.3lgC+51562，相关系数为0.9993。
B、检测步骤
将含有待测总大肠菌群的水样加入到培养液中，待测总大肠菌群在培养液中生长，培养液中含有反应底物MUGal，MUGal与待测总大肠菌群生长产生的代谢指示物β-D-半乳糖苷酶发生特异性反应，产生荧光信号(激发波长为365nm，发射波长为450nm)，检测该荧光信号；在待测总大肠菌群的生长延迟期末，当其信号下降期的信号相对于基值的变化值达到阈值-5unit时，记录待测总大肠菌群的检测时间，为30400s，代入步骤A中的标准模型的函数表达式T＝-5843.3lgC+51562，得到待测总大肠菌群的浓度为4.19×103cfu。
本实施例中，根据信号变化值设定检测终点阈值的方法适用于生长曲线的基线水平且具有相同或不同检测基值时微生物的检测，因为在这种情况下，相同或不同浓度的同类微生物的生长延迟期末信号下降期的信号值相对于基值的变化值基本一致；当由背景差异引起基线漂移时，微生物的生长延迟期末信号下降期的信号变化值有一定的随机性，相同或不同浓度的同类微生物的所述变化值不一定相同。
在实施例1和实施2中，选择微生物生长延迟期末的信号下降期作为检测终点的判断依据，与传统的选择微生物指数生长期的显著上升段为检测终点的判断依据相比，检测时间缩短2h以上，能够保证更快地得到检测结果，更好地实现微生物的实时分析。
实施例3
一种微生物的快速检测方法，用于检测食物样品中的葡萄球菌，包括以下步骤：
A、设定阈值和建模步骤
将7个葡萄球菌标样(标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6和标样7，其浓度C分别为24.36cfu、198.48cfu、2001cfu、14506cfu、15742cfu、16668cfu和1986045cfu)分别加入到培养液中，各标样中的葡萄球菌分别在培养液中生长，培养液中含有反应底物Boc-le和u-Gly-Arp-p，分别与各标样中的葡萄球菌生长产生的代谢指示物凝固酶发生特异性反应，产生有色的对硝基苯胺(nitroa-niline，PNA)，分别检测各标样在405nm波长处的吸光度信号，得到各标样的生长曲线，如图5所示。
根据各标样生长延迟期末信号下降期内生长曲线的切线的斜率值设置阈值，所述阈值的大小等于所述斜率值，此处将阈值设定为-0.01、-30、-70或-100。
在各标样的生长延迟期末，当各标样生长曲线上的点的切线斜率值分别下降到阈值-0.01时，分别记录各标样的检测时间，并依据各葡萄球菌标样的浓度和检测时间，得到葡萄球菌的检测时间T与浓度C的标准模型，如图6所示，相应的函数表达式见表1；
同样地，将阈值设置为-30、-70或-100时，采用上述相同方法得到的标准模型见图6，相应的函数表达式和相关系数见表1，图6中的标准模型自上而下所对应的阈值依次为-100、-70、-30和-0.01。
| 阈值 | 函数表达式 | 相关系数 |
| -0.01 | T＝-100.90104lgC+1040.74526 | 0.98704 |
| -30 | T＝-100.85466lgC+1050.31676 | 0.98665 |
| -70 | T＝-101.12036lgC+1060.38416 | 0.98584 |
| -100 | T＝-101.61351lgC+1068.93490 | 0.98550 |
表1
B、检测步骤
将含有待测葡萄球菌的样品加入到培养液中，待测葡萄球菌在培养液中生长，培养液中含有反应底物Boc-le和u-Gly-Arp-p，与待测葡萄球菌生长产生的代谢指示物凝固酶发生特异性反应，产生有色的对硝基苯胺(nitroa-niline，PNA)，检测在405nm波长处的吸光度信号；在待测葡萄球菌的生长延迟期末，当待测葡萄球菌生长曲线上的点的切线斜率值下降到阈值-0.01时，记录相应的检测时间，为459min，代入利用阈值-0.01得到的标准模型所对应的函数表达式T＝-100.90104lgC+1040.74526，得到待测葡萄球菌的浓度为5.83×105cfu。
采用相同的方法，将阈值设置为-30、-70或-100时，得到待测葡萄球菌不同的检测时间，依据此检测时间和不同阈值所对应的标准模型，得到待测葡萄球菌的浓度。
在本实施例中，以微生物生长曲线的切线的斜率值为检测终点阈值的判断依据，适用于微生物生长曲线的基线水平时微生物的检测。所述斜率值能够实时、准确地反映信号的变化率，能够准确判断微生物生长延迟期末的信号下降期，提高了分析结果的准确性。
实施例4
一种微生物的快速检测方法，用于检测水样中的粪大肠菌群，包括以下步骤：
A、设定阈值和建模步骤
将4个粪大肠菌群标样(标样a、标样b、标样c和标样d，其浓度C分别为95.30cfu、1.34×103cfu、1.22×104cfu和2.00×106cfu)分别加入到培养液中，各标样中的粪大肠菌群分别在培养液中生长，培养液中含有反应底物4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷酸(MUGal)，MUGal分别与粪大肠菌群生长产生的代谢指示物β-D-半乳糖苷酶发生特异性反应，产生荧光信号(激发波长为365nm，发射波长为450nm)，分别进行检测。
根据各标样生长延迟期末信号下降期内生长曲线的切线斜率值相对于基线的平均切线斜率值的变化值设置阈值，所述阈值的大小等于所述斜率变化值，此处将阈值设定为-1、-2、-3、-4或-5。
在各标样的生长延迟期末，当所述斜率变化值分别下降到阈值-1时，分别记录各标样的检测时间，依据各粪大肠菌群标样的浓度和检测时间，得到粪大肠菌群的检测时间T与浓度C的标准模型，如图7所示，相应的函数表达式和相关系数见表2；
同样地，将阈值设置为-2、-3、-4或-5，采用上述相同方法得到的标准模型见图7，相应的函数表达式见表2，图7中的标准模型自上而下所对应的阈值依次为-5、-4、-3、-2和-1。
| 阈值 | 函数表达式 | 相关系数 |
| -1 | T＝-5668.30162lgC+57457.21277 | 0.99840 |
| -2 | T＝-5683.25294lgC+58171.99209 | 0.99828 |
| -3 | T＝-5706.52271lgC+58839.25829 | 0.99818 |
| -4 | T＝-5708.91299lgC+59370.68667 | 0.99791 |
| -5 | T＝-5738.46612lgC+59961.86530 | 0.99777 |
表2
由表2得知，在本实施例的方法下，当阈值为-1、-2、-3、-4或-5时，各标准模型的线性相关系数均在0.997以上，最大差异为0.0013，具有较好的一致性，表明在[-5，-1]区间选择阈值有助于得到稳定、准确的结果，能够保证定量结果的准确率达85％以上。
B、检测步骤
将含有待测粪大肠菌群的水样加入到培养液中，待测粪大肠菌群在培养液中生长，培养液中含有反应底物MUGal，MUGal与待测粪大肠菌群生长产生的代谢指示物β-D-半乳糖苷酶发生特异性反应，产生荧光信号(激发波长为365nm，发射波长为450nm)，检测该荧光信号，得到待测粪大肠菌群的生长曲线，如图8所示；在待测粪大肠菌群的生长延迟期末，，当所述斜率变化值下降到阈值-1时，记录待测粪大肠菌群的检测时间，为426min(25560s)，代入利用阈值-1得到的标准模型所对应的函数表达式T＝-5668.30162lgC+57457.21277，得到待测粪大肠菌群的浓度为4.24×105cfu。
采用相同的方法，将阈值设置为-2、-3、-4或-5时，得到待测粪大肠菌群不同的检测时间，根据此检测时间与不同阈值所对应的标准模型，得到待测粪大肠菌群的浓度。
在本实施例中，以微生物生长曲线的切线的斜率变化值为检测终点阈值的判断依据，适用于微生物生长曲线的基线水平或漂移时微生物的检测，即适用于存在或不存在背景干扰的任何情况下的微生物检测，有效克服了游离酶或其它化合物对待测微生物的背景干扰，提高了方法的适用性。
实施例5
一种微生物的快速检测方法，与实施例1不同的是：
1、阈值的设定方式不同：
根据经验值设定阈值，所述阈值的大小等于所述经验值；
所述经验值为微生物生长延迟期末信号下降期的信号值或信号变化值，或者所述经验值为微生物生长延迟期末信号下降期内生长曲线的切线的斜率值或斜率变化值。
2、信号的检测方法不同：
所述信号为利用伏安法检测得到的电流量，或者所述信号为利用电导率法检测得到的电导率。
上述实施方式不应理解为对本发明保护范围的限制。本发明的关键是：选择微生物生长延迟期末的信号下降期作为检测终点的判断依据，缩短检测时间；选择微生物生长曲线上的切线的斜率值或斜率变化值作为检测终点阈值的判断依据，有效克服背景干扰，提高方法适用性。在不脱离本发明精神的情况下，对本发明做出的任何形式的改变均应落入本发明的保护范围之内。
Claims (16)
1.一种微生物的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、建模步骤
将标准微生物加入培养液中，标准微生物在培养液中生长，检测标准微生物在生长过程中产生的信号，在标准微生物生长延迟期末，当检测信号下降时，记录标准微生物的检测时间；
依据标准微生物的浓度和检测时间，得到微生物的浓度与检测时间的标准模型；
b、检测步骤
将待测微生物加入培养液中，待测微生物在培养液中生长，检测待测微生物在生长过程中产生的信号，在待测微生物生长延迟期末，当检测信号下降时，记录待测微生物的检测时间；
依据所述待测微生物的检测时间和所述标准模型，得到待测微生物的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准微生物与所述待测微生物为相同类型的微生物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养液含有反应物质，所述反应物质与所述微生物的特征指示因子发生反应，产生信号。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述信号为吸光度、荧光强度、电流量或电导率。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准模型为：T＝algC+b，其中，C为微生物的浓度，T为微生物的检测时间，a和b为常数。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述步骤a和所述步骤b中，当所述信号下降到阈值时，记录所述微生物的检测时间。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述阈值根据经验值设定。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述阈值根据微生物生长延迟期末信号下降期的信号值或信号变化值设定。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：当所述微生物的生长曲线的基线水平且所述微生物存在相同的检测基值时，所述阈值的大小等于所述信号下降期的信号值。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：当所述微生物的生长曲线的基线水平且所述微生物存在相同或不同的检测基值时，所述阈值的大小等于所述信号下降期的信号变化值。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述阈值根据微生物生长延迟期末信号下降期内生长曲线的切线的斜率值或斜率变化值设定。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：当所述微生物的生长曲线的基线水平时，所述阈值的大小等于所述斜率值。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述阈值的范围为[-100，-0.01]。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：当所述微生物的生长曲线的基线水平或漂移时，所述阈值的大小等于所述斜率变化值。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述阈值的范围为[-5，-1]。
16.根据权利要求1～15任一所述的方法，其特征在于：微生物生长延迟期末信号下降期的数据采集频率≥0.04次/分钟。
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