CN111662950B - 重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用 - Google Patents

重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及重组发光铜绿假单胞菌PAO1‑lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用，其特征在于，采用重组发光菌株PAO1‑lux，M9培养基，37℃，pH6.2培养，发光值检测窗口期为6h‑24h，可应用于金属铝、金属锌、玻璃、PE手套、医用纱布、医用乳胶手套等医用材料粘附细菌的检测。例如：注射器针头、隐形眼镜、医用纱布、鼻氧管、乳胶手套、聚氯乙烯塑料管(EP管)等。针对传统检测材料表面细菌粘附能力的方法局限性多，误差大无法推广应用的缺陷，本发明提供的技术方案较传统方法具有灵敏、简便、可实时观测、可观测具体粘附位置等特点，具有良好的应用和市场前景。

Description

重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测 中的应用
技术领域
本发明属生物医药技术领域，具体的说，本发明涉及一种重组发光铜绿假单胞菌应用技术领域，更具体的本发明涉及重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用。
背景技术
医疗器械相关感染是一个重要的公共卫生问题，占医院获得性感染很大比例。在医院内获得性感染的危重症病人中，大约有60％到70％是由于医疗设备的细菌污染引起的，感染可引起并发症，导致术后发病率、死亡率、再手术率增加，延长治疗周期，危及患者生命，造成巨大的医疗和经济负担。据估计，与导管相关的尿路感染约占全球医院获得性感染的40％，仅在美国，每年约有90万例，消耗费用为2.96亿至23亿美元。导管相关的血液感染在欧洲每个国家平均每年造成1000多人死亡，相关费用为3500万至1.64亿欧元。细菌粘附是医疗器械/生物材料引发感染的第一步，它为细菌在介质表面的定植铺平了道路，细菌粘附于医疗器械/生物材料表面后生长繁殖到一定的密度后，可通过群体感应系统调控形成的生物膜等多种毒力因子，保护其在恶劣环境条件和抗生素作用下得以生存，并产生耐药性。
为了消除细菌粘附对医用器械的污染，最直接的防治策略是使用抗生素或杀菌剂，然而临床试验证明这种方法是存在问题的。研究发现长期在医疗器械表面大量使用抗生素或杀菌剂，可能会通过选择压力而导致多药耐药菌的出现，而事实证明，医院获得性感染往往也是由多药耐药菌引起的，特别是在重症监护病房，据统计，多药耐药菌引起医院获得性感染占所有耐药性感染的65％。预防病原菌对医用器械污染的另一个有效策略是抑制其在医用材料表面的粘附性，阻断病原菌污染医用器械的第一个环节，而非直接杀死。开发和利用抗病原菌粘附的涂层或材料，可通过降低细菌粘附性直接降低或延迟生物膜等致病因子的风险，从而降低植入器械感染的风险。据文献报道，包括纳米材料或多种聚合物在内的医用材料已被证实具有较好的抗细菌粘附作用，越来越多已研发或正在研发的、具有抗菌抗粘附性能的新型生物材料和医疗器械产品，也面临着材料筛选、质量控制、功能评估和产品改进的检测需求。如何正确而有效地评价细菌，尤其是多药耐药菌在医疗器械表面的粘附性就显得尤为重要。
目前虽然已有简化的体外系统和工业标准测试用以评估医疗和非医疗产品的抗粘附效果，但仍然缺乏公认的标准化测试和有效的方法来正确评估抗粘附材料的活性。最为传统且常用的检测方法是细菌定量检测的金标准——菌落形成单位计数法(CFU法)，但其存在的问题也是不言而喻的，例如：细菌需要进行多次培养，耗时耗力；菌落培养时聚集导致检测误差；不能直观检测细菌粘附部位，无法对异型材料进行整体评估；很大程度上依赖人工操作，无法进行高通量筛选等。因此多年来也发展出了一系列替代CFU的检测方法，其中运用广泛且较为突出的是三磷酸腺苷法(ATP法)。ATP法依赖活细胞中的ATP与荧光素发生氧化反应并发出荧光，通过发光强度与微生物数量的比例关系，间接测定粘附细菌的数量。该方法虽然具有快速、灵敏、易于操作的优势，但属于一种侵入性检测，染料需进入细胞内，而非微生物的ATP也会对检测造成干扰，因此该方法的准确性有待于提高。
在医用材料或器械细菌粘附性检测方面，已有报道证明lux标记的发光铜绿假单胞菌可用于体外伤口敷料抗菌活性的评估，也可用于导管相关感染的小鼠模型的研究。但作为研究细菌粘附性的有效工具，利用该发光菌株建立体外标准检测方法的报道较少。多数研究仅利用了生物发光法直观、快速的优势，将其作为传统方法的补充手段，并未对其进行系统的方法学研究。
发明内容
针对细菌粘附在食品和医疗领域造成的严重危害，目前微生物粘附性检测方法的研究中尚未形成完善的评价体系和有效的检测平台。本发明从铜绿假单胞菌在医疗领域的重要地位出发，结合lux发光基因在体外检测中的优势，借助现代分子生物学手段重组构建发光菌种，旨在建立一套细菌粘附性检测的应用工具和方法体系，为完善材料表面细菌粘附性的标准评价方法提供研究基础，对于研发抗菌材料、防治细菌粘附及细菌粘附机制研究均具有重要的实际意义。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供一种重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用，具体的，重组发光铜绿假单胞菌为将luxCDABE基因整合至标准菌株PAO1的细菌染色体中，通过PIA选择培养基筛选获得的重组发光菌株PAO1-lux。
所述的重组发光菌株PAO1-lux培养基接种pH为6.2或7.2或8.2。
优选的，重组发光菌株PAO1-lux培养基接种pH为6.2。
所述的重组发光菌株PAO1-lux接种培养基可选用常规LB培养基或M9培养基或PBS缓冲液。
优选的，重组发光菌株PAO1-lux接种培养基选用常规M9培养基。
所述的重组发光菌株PAO1-lux发光值检测窗口期设定为0h-24h较为适宜。
优选的，重组发光菌株PAO1-lux发光值检测窗口期设定为6h-24h较为适宜。
重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用，具体的，所述的应用包括：金属铝、金属锌、玻璃、PE手套、医用纱布、医用乳胶手套材料粘附细菌的检测。
优选的，所述的应用医疗器械相关材料包括但不限于：注射器针头、隐形眼镜、医用纱布、鼻氧管、乳胶手套、聚氯乙烯塑料管(EP管)6种医疗器械相关材料。
本发明针对目前体外细菌粘附评价方法不能满足多种材料的检测需求，且缺乏标准化的问题，旨在建立一套以发光铜绿假单胞菌为检测工具，可用于同时检测不同医用材料表面初始细菌粘附的体外标准评价程序。该生物发光法通过对体外环境因素及检测窗口期的优化，选用不同材质的医用材料进行测试比较；并使用已证实对细菌粘附有抑制作用的表面活性剂(Triton-X)，对所建立方法的有效性进行验证。此外，还将新方法与传统平板计数法的测试结果与等效性进行了对比分析。新方法的建立为医用材料和器械的体外细菌粘附测试提供了一套已优化验证的、并可标准化的、可取代传统方法的测试模型，在生物发光技术用于微生物快速定量分析、实时监测成像的应用领域提供了数据支持。
本发明选用的铜绿假单胞菌PAO1(Pseudomonas aeruginosa)为常见的公众熟知菌种，本领域普通技术人员可以通过公众渠道购买获得，三种菌的培养条件及培养方式都可采用本领域常见报道获得。
通过实施本发明的技术方案，可以达到以下有益效果：
本发明提供一种重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用，与现有技术相比较，本发明提供的重组型发光菌株PAO1-lux荧光报告子自表达底物，无需外源添加；能够稳定遗传；发光定量检测准确，结果重复性强；发光，无需激发光，检测方便快捷，对材料的细菌粘附性进行定性或定量、直观或数据化地测定。本发明提供的技术方案解决了传统传统检测材料表面细菌粘附能力的方法局限性多，误差大无法推广应用的缺陷，本研究所采用的方法较传统方法具有灵敏、简便、可实时观测、可观测具体粘附位置等特点，具有良好的应用和市场前景。
附图说明
图1所示为PAO1-lux菌株构建过程示意图。
图2所示为SEM观察PAO1与PAO1-lux菌株表面结构的差异图。
图3所示为PAO1-lux菌株0d、1d、3d、7d发光稳定性检测图。
图4所示为PAO1-lux菌株P1-P10代发光强度值与菌液OD值相关性检测图。
图5所示为不同接种浓度PAO1-lux菌株生长曲线及发光属性检测图。
图6所示为不同pH的培养条件对PAO1-lux菌株粘附生长的影响图。
图7所示为LB培养基条件下PAO1-lux与PAO1菌株粘附性生长及发光曲线图。
图8所示为M9培养基条件下PAO1-lux与PAO1菌株粘附性生长及发光曲线图。
图9所示为PBS缓冲液条件下PAO1-lux与PAO1菌株粘附性生长及发光曲线图。
图7、8、9中图A所示为发光菌株和不发光菌株，生长曲线对比图，图B所示为发光菌株不同pH条件下的发光曲线比较图。虚线为发光曲线，实线为生长曲线。
图10所示为发光法测定6种材料的细菌粘附性图。
图中A为6h测定结果；B为24h测定结果
图11所示为菌落计数法测定6种材料的细菌粘附性图。
图中A为6h测定结果；B为24h测定结果
图12所示为发光法测定表面活性剂处理后6种医用材料PAO1-lux细菌粘附性的变化图。
图中A为：注射针头PAO1-lux细菌粘附性的变化图；B为隐形眼镜PAO1-lux细菌粘附性的变化图；C为医用手套PAO1-lux细菌粘附性的变化图；D为鼻氧管PAO1-lux细菌粘附性的变化图；E为乳胶手套PAO1-lux细菌粘附性的变化图；F为EP管PAO1-lux细菌粘附性的变化图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明所用试剂：PAO1标准菌株(Department of Medical Microbiology,University of Manitoba,Canada)，LB培养基，M9培养基，PBS溶液，生理盐水。
本发明所用仪器：多功能酶标仪(SynergyHTX，Biotek)，化学发光凝胶成像系统(ChemiDoc XRS+，Bio-Rad)，生物安全柜，恒温培养箱，摇床，离心机。
本发明所用实验材料：96孔板(聚苯乙烯，Polystyrene,PS)，Eppendorf管(聚丙烯，Polypropylene,PP)，注射器针头(Syringe needle)，隐形眼镜(Contact lenses)，医用纱布(Medical gauze)，鼻氧管(Nasal oxygen tube)，乳胶手套(Latex glove)，金属锌，铝。
本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用
本发明提供一种重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用，具体的，重组发光铜绿假单胞菌为将luxCD ABE基因整合至标准菌株PAO1的细菌染色体中，通过PIA选择培养基筛选获得的重组发光菌株PAO1-lux。
所述的重组发光菌株PAO1-lux培养基接种pH为6.2或7.2或8.2。
所述的重组发光菌株PAO1-lux接种培养基可选用常规LB培养基或M9培养基或PBS缓冲液。
所述的重组发光菌株PAO1-lux发光值检测窗口期设定为0h-24h较为适宜。
同时，所述的重组发光菌株PAO1-lux培养基中加入体积百分比为0.1％-0.0125％的TritonX-100表面活性剂。
重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用，具体的，所述的应用包括：金属铝、金属锌、玻璃、PE手套、医用纱布、医用乳胶手套材料粘附细菌的检测。
实施例二：重组发光菌株PAO1-lux的构建
PCR获得含酶切位点的PalgU-lux启动子序列，酶切连接至pMS402质粒，转化至大肠杆菌，获得含有PalgU-lux启动子的报告基因载体；其次，将CTX6.1质粒与荧光素报告载体经酶切、连接、转化，获得CTX-lux菌株；最终经野生型PAO1、CTX-lux、PRK2013三亲株杂交，将荧光素酶基因整合至PAO1染色体上，筛选发光单克隆，获得重组PAO1-lux菌株。构建过程示意图如附图1所示。
通过Bio-Rad成像系统检测PAO1-lux菌落形态及发光属性，白光模式下野生型菌株PAO1及重组型发光菌株PAO1-lux均可见，发光模式下PAO1不可见，PAO1-lux发光可检测。对菌液稀释后涂布，PAO1-lux发光菌落清晰可见。
通过扫描电子显微镜观察PAO1-lux与PAO1菌株表面结构的差异，结果表明，重组型发光菌株PAO1-lux在菌体的表面结构上与野生型菌株PAO1并无显著差异。PAO1-lux菌体表面结构的完整性提示，lux基因的导入对菌体的粘附性无不良影响，如附图2所示。
实施例三：PAO1-lux菌株发光稳定性研究
在LB及PIA平板上分别接种构建的重组型发光菌株PAO1-lux和野生型菌株PAO1，采用Bio-Rad成像系统分别在白光(White light)和发光(Luminescence)模式下对接种平板进行拍照，间隔1d、3d、7d进行连续观察，监测PAO1-lux随时间变化的发光稳定性。对PAO1-lux进行常规培养，连续传代10次，每代菌株进行保种；同时活化不同代次的菌种，过夜培养菌液进行倍比稀释后加入96孔板进行发光属性及发光强度的定性及定量检测。
将PAO1-lux菌株常规培养至对数期(OD＝0.5-0.6)，倍比稀释菌液10次，取稀释16-512倍的菌液接种至96孔板，37℃连续培养24h，采用多功能酶标仪每隔0.5h检测600nm处吸光值(OD)及菌液的发光强度值(Lum)，监测菌株生长曲线与发光强度的对应关系。
将PAO1-lux和PAO1菌株培养至对数生长期，以2倍梯度连续稀释10次，接种至96孔板，采用Bio-Rad成像系统分别在白光(White light)和发光(Luminescence)模式下对96孔板进行拍照，间隔1d、3d、7d进行连续观察，并采用BioTek HTX型酶标仪同时检测600nm处吸光值(OD)及菌液的发光强度值(Lum)，结果显示，PAO1-lux均能够维持发光属性，如附图3所示。
对PAO1-lux进行常规培养，连续传代10次，每代菌株进行保种；同时活化不同代次的菌种，过夜培养菌液进行倍比稀释后加入96孔板进行发光属性及发光强度的定性及定量检测。实验结果显示，在传代10次后，PAO1-lux菌株仍能维持与初始代次发光属性一致的状态，菌液在600nm的吸光值与发光强度值线性关系良好，R2＝0.9852。如附图4所示。
PAO1-lux菌株常规培养至对数期(OD＝0.5-0.6)，倍比稀释菌液10次，取稀释16-512倍的菌液接种至96孔板，37℃连续培养24h，每隔0.5h检测600nm处吸光值(OD)及菌液的发光强度值(Lum)，实验结果显示，在培养期4-7h的过程中，菌体发光强度达到最大值，起始菌液稀释倍数增加一倍，菌液达到最大发光强度的时间大约滞后0.5h，如附图5所示。
实施例四：PAO1-lux与PAO1菌株在不同培养条件下粘附性生长属性研究
常规培养PAO1-lux及PAO1菌株至对数生长期(OD＝0.5-0.6)，离心收集细菌，分别用不同pH(pH＝5-10)的培养基稀释100倍后接种于96孔板，37℃连续培养24h，每隔0.5h检测孔板菌液在600nm的OD值及发光Lum值。
常规培养PAO1-lux及PAO1菌株至对数生长期(OD＝0.5-0.6)，离心收集细菌，分别用不同pH的LB液体培养基(富营养条件)、M9培养基(寡营养条件)和PBS缓冲液(无营养条件)稀释100倍后接种于96孔板，37℃连续培养24h，每隔0.5h检测孔板菌液在600nm的OD值及发光Lum值。
(1)不同培养时间及pH条件对PAO1-lux菌株粘附生长的影响
PAO1-lux菌株常规培养至对数期(OD＝0.5-0.6)，稀释100倍后接种于96孔板，每隔1h进行成像拍照，连续观察6h，实验结果显示，在一定时间内，菌体发光强度随时间逐渐增大。用不同pH(pH＝6.2，7.2，8.2)的培养基接种PAO1-lux菌株，培养2h和4h后进行拍照及发光检测，实验结果显示，PAO1-lux在pH＝6.2时，发光强度达到最大，如附图6所示。
(2)富营养条件下(LB培养基)粘附性生长及发光曲线
常规培养PAO1-lux及PAO1菌株至对数生长期(OD＝0.5-0.6)，离心收集细菌，分别用pH＝6.2±0.1和pH＝7.2±0.1的LB液体培养基稀释100倍后接种于96孔板，37℃连续培养24h，每隔0.5h检测孔板菌液在600nm的OD值及发光Lum值。如附图7所示，在相同培养条件下，OD值检测PAO1-lux与PAO1菌株生长趋势一致，PAO1-lux菌株由于携带发光基因，在生长过程中持续检测到强烈的发光信号，PAO1菌株不携带发光基因，仅检测到极弱的发光信号。
在两种pH培养条件下，OD值显示PAO1-lux菌株生长趋势相当，发光曲线均在4-5h后达到最高值。
(3)寡营养条件下(M9培养基)粘附性生长及发光曲线
常规培养PAO1-lux及PAO1菌株至对数生长期(OD＝0.5-0.6)，离心收集细菌，分别用pH＝6.2±0.1和pH＝7.2±0.1的M9液体培养基稀释100倍后接种于96孔板，37℃连续培养24h，每隔0.5h检测孔板菌液在600nm的OD值及发光Lum值。如附图8所示，在相同培养条件下，OD值检测PAO1-lux与PAO1菌株生长趋势一致，PAO1-lux菌株由于携带发光基因，在生长过程中持续检测到强烈的发光信号，PAO1菌株不携带发光基因，仅检测到极弱的发光信号。
在pH＝6.2的培养条件下，PAO1-lux菌株生长及发光趋势强于pH＝7.2的培养条件，菌株在粘附生长6h-12h时，发光强度达到较高水平。
(4)无营养条件下(PBS缓冲液)粘附性生长及发光曲线
实验操作同上。常规培养PAO1-lux及PAO1菌株至对数生长期(OD＝0.5-0.6)，离心收集细菌，分别用pH＝6.2±0.1和pH＝7.2±0.1的PBS缓冲液稀释100倍后接种于96孔板，37℃连续培养24h，每隔0.5h检测孔板菌液在600nm的OD值及发光Lum值。如附图9所示，无营养条件下，24h内PAO1-lux发光强度随生长发生变化，发光值与OD值存在对应关系。
以上实验结果提示，PAO1-lux菌株在96孔板粘附生长过程中，选择对数期生长的菌液稀释100倍，并采用pH＝6.2的M9培养基作为培养条件更有利于菌体粘附，发光值检测窗口期设定为6h-24h较为适宜。
实施例五：利用发光法检测不同材料细菌粘附性的研究
(1)利用发光法及菌落计数法检测不同材料(相同规格2cm×2cm)细菌粘附性的差异
基于上述实施例一至实施例四。将不同材质的材料(如金属铝、金属锌、玻璃、PE手套、医用纱布、医用乳胶手套)裁剪为2cm×2cm大小的薄片，将培养至对数生长期的PAO1-lux用M9培养基稀释100倍后加于材料表面，37℃孵育6h和24h后，用PBS清洗材料3次，洗去悬浮菌体，再用超声波清洗机清洗10min，将粘附细菌清洗下来，取菌液加于96孔板中直接进行发光强度测定。
如附图10、附图11所示，相同规格的6种材料，细菌粘附性的大小排序为：医用乳胶手套＞PE手套＞医用纱布＞玻璃、金属铝＞金属锌，发光法检测结果与菌落计数法检测结果一致。以上实验结果表明，发光法可用于检测医用器材表面细菌的粘附性，与传统方法(CFU菌落计数法)具有较好的对应关系。
(2)表面活性剂预处理后不同医疗器械材料细菌粘附性的测定
基于上述实施例一至实施例四。同种材料不同处理：将医疗器械相关材料，如注射器针头、隐形眼镜、医用纱布、鼻氧管、乳胶手套、聚氯乙烯塑料管(EP管)用含有0.1％TritonX-100的PBS预处理后，将培养至对数生长期的PAO1-lux用M9培养基稀释100倍后覆于材料表面，37℃孵育6h，用PBS清洗材料3次，洗去悬浮菌体，再用超声波清洗机清洗10min，将粘附细菌清洗下来，取菌液加于96孔板中直接进行发光强度测定。如附图12所示，相比于未经表面活性剂处理的材料，通过发光法测定，6种医用材料的细菌粘附性均呈显著性下降。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (5)

1.重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用，其特征在于，所述的重组发光铜绿假单胞菌为将luxCDA BE基因整合至标准菌株PAO1的细菌染色体中，通过PIA选择培养基筛选获得的重组发光菌株PAO1-lux；
所述的重组发光菌株PAO1-lux接种培养基选用常规LB培养基或M9培养基或PBS缓冲液；
所述的重组发光菌株PAO1-lux培养基接种pH为6.2或7.2或8.2；
所述的重组发光菌株PAO1-lux发光值检测窗口期设定为0h-24h；
所述的应用包括：对医用材料金属铝、金属锌、玻璃、PE手套、医用纱布、医用乳胶手套材料粘附细菌的检测。
2.如权利要求1所述的重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用，其特征在于，所述的重组发光菌株PAO1-lux培养基接种pH为6.2。
3.如权利要求1所述的重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用，其特征在于，所述的重组发光菌株PAO1-lux接种培养基选用常规M9培养基。
4.如权利要求1所述的重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用，其特征在于，所述的重组发光菌株PAO1-lux发光值检测窗口期设定为6h-24h。
5.如权利要求1所述的重组发光铜绿假单胞菌PAO1-lux在医用材料细菌粘附性检测中的应用，其特征在于，所述的应用包括但不限于：注射器针头、隐形眼镜、医用纱布、鼻氧管、乳胶手套、聚氯乙烯塑料管6种医疗器械相关材料。
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