CN102827919A - 一种水质物质对大型蚤慢性毒性的早期预警方法 - Google Patents

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张薛
李福志
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Abstract

本发明公开了属于水污染控制技术领域的一种水质物质对大型蚤慢性毒性的早期预警方法。本发明针对低毒性的水质状况，筛选出大型蚤体内对毒性响应灵敏的标志酶，通过检测大型蚤染毒短期内标志酶活性变化率，预测其21天的慢性毒性潜能。检测标志酶均有标准方法或商用试剂盒，检测方便、迅速、准确，满足快速预警的检测要求，该方法适用于低浓度水平的单一物质水样，或再生水、地表水等含有多种成分的、低毒性的复杂水样，能快速反映其生物毒性水平。

Description

一种水质物质对大型蚤慢性毒性的早期预警方法
技术领域
本发明属于水污染控制技术领域，具体涉及一种水质物质对大型蚤慢性毒性的早期预警方法。
背景技术
大型蚤作为国际公认的毒性测试标准生物，其急性毒性和慢性毒性测试已形成国际标准方法，并被广泛应用于农药、化学品、工业废水、生活污水及饮用水水源等的毒性评价。急性毒性通常在24 h或48 h内给出检测结果，但其毒性检出限较高，对于一些毒性物质浓度较低的样品（如城市污水厂二级出水）的响应不灵敏；慢性毒性的检出限较低，相对急性毒性更为灵敏，但其试验耗时较长（21 d），不能及时反映水质状况。因此，需要在现有毒性评价方法的基础上，开发一种快速、灵敏的检测方法，这将对快速检测低毒性水样的水质风险具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述技术的不足提出一种水质物质对大型蚤慢性毒性的早期预警方法。
一种水质物质对大型蚤慢性毒性的早期预警方法，此方法针对低毒性水平的水质状况，筛选出大型蚤体内对毒性敏感的标志酶，将短期培养的大型蚤标志酶活性变化率与同样浓度下大型蚤慢性毒性终端指标进行对比，确定与大型蚤慢性毒性终端指标具有线性相关性的标志酶活性指标，形成快速预警水质物质对大型蚤慢性毒性的检测方法，其包含以下具体步骤：
（1）大型蚤的培养及挑选：大型蚤为Daphnia magna, 食物为新鲜培养的绿藻，培养基为曝气脱氯的自来水，培养条件为温度25℃，光照强度10~20 μmol/(m2·s)，光暗比为16:8；选取培养3代以上、出生6-24 h的幼蚤；
（2）大型蚤慢性毒性终端指标获得：首先参照OECD202方法进行大型蚤急性毒性的实验，获得水样对大型蚤48h的半数致死浓度LC50；然后在0.01~0.5倍LC50水样浓度范围内设置4-5个浓度梯度，每个浓度设置10个平行，以曝气脱氯的自来水为空白对照，参照OECD 211方法进行21 d大型蚤慢性毒性试验：在20 mL水样或自来水中，放入1只大型蚤，于光暗比为16:8、25℃的培养箱内连续培养21 d，每两天换水喂食一次；每天详细记录大型蚤的生存、怀卵、繁殖情况，并移除幼蚤；实验结束时，以空白对照中大型蚤死亡率不超过10%视为实验有效；在21 d的培养过程中，计算大型蚤的平均首次产蚤时间、平均产幼蚤数量和产幼蚤胎数，与对照组相比，获得实验组中大型蚤生长及繁殖的变化率，得到大型蚤慢性毒性终端指标；
（3）对水质物质敏感的大型蚤标志酶的筛选：以曝气脱氯的自来水为空白对照，根据步骤（2）中得出的半数致死浓度LC50，实验组在0.3~0.5倍LC50水样浓度范围内设置1-2个测试水样浓度，在步骤（2）中相同的培养条件下对大型蚤进行2-7天的短期培养，培养过程中，检测乙酰胆碱酯酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、ATP酶、羧酸酯酶和碱性磷酸酯酶的活性，选择在和对照组中酶活性有显著差异的酶为检测该水质物质的标志酶；
（4）水质物质对短期培养大型蚤标志酶活性的影响试验：按步骤（2）中的浓度梯度，以曝气脱氯的自来水为空白对照，在800 mL水样或自来水中放入120只大型蚤，于光暗比为16:8、25℃的培养箱内培养，每两天换水喂食一次；分别在培养第2、4或7 d收集实验组和对照组的大型蚤各30只，采用标准方法或商用试剂盒测定步骤（3）中选择的标志酶活性；与对照组相比，计算实验组中大型蚤标志酶活性变化率；
（5）数据相关性分析：将在相同浓度的水样下，将短期培养的大型蚤标志酶活性变化率与21天培养的大型蚤慢性毒性终端指标生长或繁殖的变化率进行线性拟合，确定两者是否具有相关性。
所述低毒性水平对大型蚤急性毒性测试无明显响应的毒性水平。
所述短期培养为2-7天。
其中大型蚤的食物绿藻的培养和收集为：绿藻采用SE或BG11培养基，置于温度25℃、光照强度40~60 μmol/(m2·s)、光照比14:10的人工气候箱中培养，培养7-10 d，离心收集藻细胞，用于喂食大型蚤。
大型蚤体内标志酶提取和活性检测方法为：将大型蚤依次用高纯水和0.05 mol/L Tris-HCl（pH=7.5）缓冲溶液清洗后放入玻璃匀浆器中，在冰浴中加入1 mL Tris-HCl缓冲溶液和10μL苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）充分匀浆，匀浆液在4℃、8000 rpm条件下离心15 min，取上清液并保持在冰浴环境下，采用标准方法或商用试剂盒测定标志酶活性。
本发明的有益效果为：采用大型蚤的生化指标——标志酶活性检测水质物质在低浓度和低毒性水平条件下的生物毒性，用以解决急性毒性检测灵敏性差和慢性毒性检测周期长的问题，具有检测迅速、灵敏的优势；该方法适用于单一物质在低浓度水平下的毒性检测，也适合再生水、地表水等含有多种成分的、低毒性的复杂水样，能快速反映其生物毒性水平。
附图说明
图1为大型蚤21 d产幼蚤抑制率与4 d碱性磷酸酯酶抑制率的相关性。
图2为大型蚤21 d产幼蚤抑制率和4 d过氧化氢酶促进率的相关性。
图3为大型蚤首次产蚤时间提前率和2 d碱性磷酸酯酶抑制率的相关性。
具体实施方式
实施例1
取污水厂A的二级出水，采用定性滤纸过滤去除悬浮颗粒物后，作为水样用于大型蚤的急性毒性、慢性毒性和酶活性检测实验。
首先参照OECD202方法进行大型蚤急性毒性实验，该水样在1倍浓度下对大型蚤48h的急性致死率为30%，由此选择慢性毒性和酶活性检测实验的二级出水测试浓度为50%、75%和1倍，采用曝气脱氯后的自来水进行相应稀释，每个浓度设置10个平行，同时设置自来水为对照，OECD211方法进行21 d大型蚤慢性毒性试验：在20 mL水样或自来水中，放入1只大型蚤，于光暗比为16:8、25℃的培养箱内连续培养21 d，每两天换水喂食一次；每天详细记录大型蚤的生存、怀卵、繁殖情况，并移除幼蚤；实验结束时，以空白对照中大型蚤死亡率不超过10%视为实验有效；在21 d的培养过程中，计算大型蚤的平均首次产蚤时间、平均产幼蚤数量和产幼蚤胎数，与对照组相比，获得实验组中大型蚤生长及繁殖的变化率，得到大型蚤慢性毒性终端指标。
以曝气脱氯的自来水为空白对照，根据急性实验中得出的半数致死浓度，设置75%水样浓度，在上述相同的培养条件下对大型蚤进行4天的短期培养，培养过程中，检测乙酰胆碱酯酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、ATP酶、羧酸酯酶和碱性磷酸酯酶的活性，筛选出对二级出水的响应敏感的碱性磷酸酯酶和过氧化氢酶为标志酶。
采用与慢性毒性实验相同的浓度，依照酶活性检测的试验方法，在800 mL水样或自来水中放入120只大型蚤，于光暗比为16:8、25℃的培养箱内培养，每两天换水喂食一次；分别在培养第4d收集实验组和对照组的大型蚤各30只，并提取其标志酶，采用标准方法或商用试剂盒测定其酶活性。
在二级出水作用下，大型蚤的繁殖能力受到明显的影响，21d培养过程中，实验组大型蚤平均每只母蚤产幼蚤数为15.6-27.8只，比对照组的56.8只有显著降低，幼蚤出产抑制率为51%-72%，且该抑制率与二级出水浓度成正相关。
在标志酶活性测定中，碱性磷酸酯酶和过氧化氢酶对二级出水的响应敏感。培养4 d后，实验组中大型蚤碱性磷酸酯酶的比活力较对照组降低了48%-70%，而实验组中大型蚤过氧化氢酶的比活力较对照组增强了16%-36%，酶活的变化率与二级出水的浓度成正相关。将标志酶活性变化率与大型蚤产幼蚤抑制率进行线性相关性分析，如图1和图2所示大型蚤21 d产蚤抑制率分别与4 d的碱性磷酸酯酶抑制率以及过氧化氢酶促进率均呈显著线性相关性，R2分别为0.99、0.93，可知采用4d的磷酸酯酶抑制率和过氧化氢酶促进率，能在一定程度上反映该水样对大型蚤的慢性毒性潜力。
实施例2
取污水厂B的再生水，采用定性滤纸过滤去除悬浮颗粒物后，采用固相萃取将水中有机物进行浓缩，获得相当于再生水200倍浓度的浓缩水样，用于大型蚤的急性毒性、慢性毒性和酶活性检测实验。
首先参照OECD202方法进行大型蚤急性毒性实验，该水样对大型蚤48小时LC50为24倍，由此选择慢性毒性和酶活性检测实验的再生水测试浓度为1、2、5和10倍，每个浓度设置10个平行，同时设置自来水为对照，OECD 211方法进行21 d大型蚤慢性毒性试验：在20 mL水样或自来水中，放入1只大型蚤，于光暗比为16:8、25℃的培养箱内连续培养21 d，每两天换水喂食一次；每天详细记录大型蚤的生存、怀卵、繁殖情况，并移除幼蚤；实验结束时，以空白对照中大型蚤死亡率不超过10%视为实验有效；在21 d的培养过程中，计算大型蚤的平均首次产蚤时间、平均产幼蚤数量和产幼蚤胎数，与对照组相比，获得实验组中大型蚤生长及繁殖的变化率，得到大型蚤慢性毒性终端指标。
以曝气脱氯的自来水为空白对照，根据急性实验中得出的半数致死浓度，设置5和10倍水样浓度，在上述相同的培养条件下对大型蚤进行2天的短期培养，培养过程中，检测乙酰胆碱酯酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、ATP酶、羧酸酯酶和碱性磷酸酯酶的活性，筛选出对再生水的响应敏感的碱性磷酸酯酶为标志酶。
采用与慢性毒性实验相同的测试浓度，依照酶活性检测的试验方法，在800 mL水样或自来水中放入120只大型蚤，于光暗比为16:8、25℃的培养箱内培养，分别在培养第2d收集实验组和对照组的大型蚤各30只，并提取其标志酶，采用标准方法或商用试剂盒测定其酶活性。
加入再生水的实验组中，大型蚤首次产蚤时间明显提前，实验组中大型蚤的首次产蚤时间为7.4-8.6 d，相比对照组中的10.1 d提前了15%-26%，且提前率随着再生水浓度的提高而增大。
酶活性检测实验中，实验组大型蚤培养2 d后的碱性磷酸酯酶的活性比对照组减弱了37%-50%，且抑制率随着再生水浓度的升高而增大。图3为酶活性变化率与首次产蚤时间提前率所作的相关性分析，大型蚤首次产蚤时间提前率与2 d的磷酸酯酶抑制率有显著的线性相关系，R2=0.91，可知采用2 d的磷酸酯酶抑制率，能在一定程度上反映该水样对大型蚤的慢性毒性潜力。

Claims (3)

1.一种水质物质对大型蚤慢性毒性的早期预警方法，其特征在于，此方法针对低毒性水平的水质状况，筛选出大型蚤体内对毒性敏感的标志酶，将短期培养的大型蚤标志酶活性变化率与同样浓度下大型蚤慢性毒性终端指标进行对比，确定与大型蚤慢性毒性终端指标具有线性相关性的标志酶活性指标，形成快速预警水质物质对大型蚤慢性毒性的检测方法，其包含以下具体步骤：
（1）大型蚤的培养及挑选：大型蚤为Daphnia magna, 食物为新鲜培养的绿藻，培养基为曝气脱氯的自来水，培养条件为温度25℃，光照强度10~20 μmol/(m2·s)，光暗比为16:8；选取培养3代以上、出生6-24 h的幼蚤；
（2）大型蚤慢性毒性终端指标获得：首先参照OECD202方法进行大型蚤急性毒性的实验，获得水样对大型蚤48h的半数致死浓度LC50；然后在0.01~0.5倍LC50水样浓度范围内设置4-5个浓度梯度，每个浓度设置10个平行，以曝气脱氯的自来水为空白对照，参照OECD 211方法进行21 d大型蚤慢性毒性试验：在20 mL水样或自来水中，放入1只大型蚤，于光暗比为16:8、25℃的培养箱内连续培养21 d，每两天换水喂食一次；每天详细记录大型蚤的生存、怀卵、繁殖情况，并移除幼蚤；实验结束时，以空白对照中大型蚤死亡率不超过10%视为实验有效；在21 d的培养过程中，计算大型蚤的平均首次产蚤时间、平均产幼蚤数量和产幼蚤胎数，与对照组相比，获得实验组中大型蚤生长及繁殖的变化率，得到大型蚤慢性毒性终端指标；
（3）对水质物质敏感的大型蚤标志酶的筛选：以曝气脱氯的自来水为空白对照，根据步骤（2）中得出的半数致死浓度LC50，实验组在0.3~0.5倍LC50水样浓度范围内设置1-2个测试水样浓度，在步骤（2）中相同的培养条件下对大型蚤进行2-7天的短期培养，培养过程中，检测乙酰胆碱酯酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、ATP酶、羧酸酯酶和碱性磷酸酯酶的活性，选择在和对照组中酶活性有显著差异的酶为检测该水质物质的标志酶；
（4）水质物质对短期培养大型蚤标志酶活性的影响试验：按步骤（2）中的浓度梯度，以曝气脱氯的自来水为空白对照，在800 mL水样或自来水中放入120只大型蚤，于光暗比为16:8、25℃的培养箱内培养，每两天换水喂食一次；分别在培养第2、4或7 d收集实验组和对照组的大型蚤各30只，采用标准方法或商用试剂盒测定步骤（3）中选择的标志酶的活性；与对照组相比，计算实验组中大型蚤标志酶活性变化率；
（5）数据相关性分析：将在相同浓度的水样下，将短期培养的大型蚤标志酶活性变化率与21天培养的大型蚤慢性毒性终端指标生长或繁殖的变化率进行线性拟合，确定两者是否具有相关性。
2.根据权利要求1所述的一种水质物质对大型蚤慢性毒性的早期预警方法，其特征在于，所述低毒性水平对大型蚤急性毒性测试无明显响应的毒性水平。
3.根据权利要求1所述的一种水质物质对大型蚤慢性毒性的早期预警方法，其特征在于，所述短期培养为2-7天。
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