CN105137055A - 一种基于大型溞毒性的非甾体抗炎药类新型污染物的毒性预测与评估方法 - Google Patents

一种基于大型溞毒性的非甾体抗炎药类新型污染物的毒性预测与评估方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于大型溞毒性的非甾体抗炎药类新型污染物的毒性预测与评估方法。本发明通过将大型溞暴露于呈等对数间距浓度的非甾体抗炎药类新型污染物中，分别记录其暴露24h、48h、72h的大型溞的存活率和暴露21d的大型溞的存活率、体长、脱壳、怀卵总次数和产溞总数；然后利用SPSS软件计算得到对应的24h？LC50、48h？LC50、72h？LC50用于评价急性毒性，得到对应的21d？LC50、体长EC50、脱壳EC50、怀卵EC50和产溞EC50用于评价慢性毒性；从而实现对非甾体抗炎药类新型污染物的毒性特征和毒性水平进行分析测试和定量描述，同时可作为非甾体抗炎药污水生物毒性监测和评价的指标，可为水体中这类污染物的潜在生态毒性风险预测与评估提供参考。

Description

一种基于大型溞毒性的非甾体抗炎药类新型污染物的毒性预测与评估方法
技术领域
本发明属于环境毒理学技术领域，具体涉及一种基于大型溞毒性的非甾体抗炎药类新型污染物的毒性预测与评估方法。
背景技术
广泛使用的非甾体抗炎药在为人类减轻病痛的同时，也带来诸多环境污染和危害，较低浓度暴露即会对水生生物造成不良影响，潜在风险不容忽视。然而，目前有关非甾体抗炎药的毒理研究仍主要集中在实验室内模拟的短期高剂量暴露下的急性毒性方面，对其实际环境水平暴露时所可能引起的慢性则研究较少，但非甾体抗炎药的急性毒性数据往往远高于其实际检出浓度(100-1000倍)，因此，为了避免高估甚至低估非甾体抗炎药的毒害风险，提高准确度和有效性，应重点加强对这类污染物的低剂量慢性毒性研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中常规理化指标不能反映实际环境中低剂量非甾体抗炎药类新型污染物慢性毒性的问题，提供一种基于大型溞毒性的非甾体抗炎药类新型污染物的毒性预测与评估方法，从而实现对非甾体抗炎药类新型污染物的毒性特征和毒性水平进行分析测试和定量描述。
本发明的基于大型溞毒性的非甾体抗炎药类新型污染物的毒性预测与评估方法，包括以下步骤：
a.将待测的非甾体抗炎药类新型污染物配制成呈等对数间距浓度的试验溶液，将大型溞暴露于试验溶液中；
b.急性毒性测定：记录暴露24h、48h、72h的大型溞的存活率；
慢性毒性测定：定期喂食并定期更换试验溶液，记录暴露21d的大型溞的存活率、体长、脱壳总次数、怀卵总次数和产溞总数；
c.根据急性毒性测定得到的数据计算得到24hLC50、48hLC50、72hLC50，根据慢性毒性测定数据计算得到21dLC50、EC50(体长)、EC50(脱壳)、EC50(怀卵)、EC50(产溞)。
所述的非甾体抗炎药类新型污染物为双氯芬酸、醋氨酚和/或布洛芬。
所述的步骤a的大型溞为龄期6～24小时的大型溞。
所述的步骤b的急性毒性测定，暴露期间不换水不喂食。
所述的步骤b的记录大型溞的存活率，是以心脏停止跳动计为死亡。
所述的步骤b的定期喂食并定期更换试验溶液，是每天每只大型溞喂0.15mg斜格栅藻液一次，并且每隔三天更换一次试验溶液。
本发明方法采用大型溞体内试验方法，分别利用短期即24、48、72小时和长期即21天的暴露方式描述非甾体抗炎药类新型污染物对大型溞的急性毒性、慢性毒性，判断非甾体抗炎药类新型污染物对大型溞是否具有毒性的判据为：
1、利用短期暴露方式，测定得到非甾体抗炎药类新型污染物对大型溞的急性毒性，急性毒性测定得到24h、48h、72hLC50，以24h、48h、72hLC50描述急性毒性；
2、利用长期暴露方式，慢性毒性以大型溞21天暴露后的致死性和半致死性效应参数来表征，具体包括半数致死浓度(21dLC50，mg/L)、半数生长情况受抑制浓度(体长、脱壳)和半数繁殖情况受抑制浓度(怀卵、产溞)；
3、参照欧盟委员会所划分的污染物对于水生生物的风险等级(EUDirective93/67/EEC，1996)：EC50<1mg/L表示非常有毒；1mg/L<EC50<10mg/L表示有毒；11mg/L<EC50<100mg/L表示有害)进一步对比评估非甾体抗炎药类新型污染物对大型溞的致毒级别。
本发明具有的优点：
本发明以大型溞为毒性测试的模式生物，将其暴露于典型非甾体抗炎药污水中，通过分析非甾体抗炎药类新型污染物在单独暴露时对大型溞的急性毒性、慢性毒性，定量地测定这类污染物对大型溞的短期或长期毒性效应，急性毒性以24、48和72小时的半数致死浓度(24h、48h、72hLC50，mg/L)描述，慢性毒性以大型溞21天暴露后的致死性和半致死性效应参数来表征，具体包括半数致死浓度(21dLC50，mg/L)、半数生长情况受抑制浓度(体长、脱壳)和半数繁殖情况受抑制浓度(怀卵、产溞)。采用该方法可以对非甾体抗炎药类新型污染物的毒性特征和毒性水平进行分析测试和定量描述，解决常规理化指标不能反映的典型非甾体抗炎药污水生物毒性，同时可作为非甾体抗炎药污水生物毒性监测和评价的指标，可为水体中这类污染物的潜在生态毒性风险预测与评估提供参考。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
实施例1：三种典型非甾体抗炎药类新型污染物(双氯芬酸、醋氨酚和布洛芬)对大型溞的急慢性毒性效应评估
(1)预试验确定暴露浓度和效应参数
在150mL的玻璃烧杯中，盛放50mL试验溶液，分为6个暴露组(空白对照与5个浓度加标样品组)，暴露组浓度以试验溶液中含非甾体抗炎药类新型污染物的体积质量浓度(mg/L)表示。三种非甾体抗炎药类新型污染物加标样品组分别设置如下：双氯芬酸暴露浓度为0.50、1.50、4.50、13.5和40.5mg/L；醋氨酚暴露浓度为0.08、0.24、0.72、2.16和6.48mg/L；布洛芬暴露浓度组0.40、1.20、3.60、10.8和32.4mg/L；空白对照的试验溶液为不含任何非甾体抗炎药类新型污染物的蒸馏水；不设平行组。每个暴露组放10只大型溞，其中慢性毒性试验中使用的大型溞全部为雌性，急性毒性试验连续暴露24、48、72小时，慢性毒性试验连续暴露21天，每天喂一次斜格栅藻液(0.15mg/d·溞)，并且每隔三天更换一次实验溶液，以尽量确保目标物浓度一致。每天观察记录大型溞的致死性和半致死性效应终点参数(表1)。当母溞开始繁殖后，及时将新生幼溞移出。试验结束时将大型溞取出，在显微镜下测量其体长(从头盔至壳刺部的长度，不含尾刺)。毒理试验开展前后及各个时间点均保存部分水样用于目标化合物的实际浓度测定。
表1预实验所选用的致死性和半致死性效应参数
对获得的各效应终点参数结果进行统计分析，如果加标样品组与空白对照组差异显著，即0.01<P<0.05或者P<0.01时，则认为该种非甾体抗炎药类新型污染物污水具有亚急性生物毒性，该对应的效应终点参数可以用于评价急慢性毒性；若加标样品组与空白对照组差异不显著，则认为该非甾体抗炎药类新型污染物污水无亚急性生物毒性，则该对应的效应终点参数不用于评价急慢性毒性。由此，筛选得到可用于评价急慢性毒性的效应终点参数为：致死性(存活率)、半致死性(生长情况：体长、脱壳总次数，繁殖情况：怀卵总次数，产溞总数)。
对获得的存活率结果进行分析处理，得到以下结果。双氯芬酸预实验结果：最低的24h绝对致死浓度和最高的72h无死亡浓度分别为59.9mg/L和0.228mg/L；醋氨酚预实验结果：最低的24h绝对致死浓度和最高的72h无死亡浓度分别为1.552mg/L和0.1mg/L；布洛芬预实验结果：最低的24h绝对致死浓度和最高的72h无死亡浓度分别为100mg/L和0.323mg/L。
(2)急慢性毒性效应评估评估
双氯芬酸、醋氨酚和布洛芬分别设置5个不同浓度组(按等对数间距设计)，具体为：急性毒性试验中，双氯芬酸2、6、18、54、162mg/L，醋氨酚4、12、36、108、324mg/L，布洛芬1、3、9、27、81mg/L；慢性毒性试验中，双氯芬酸0.5、1.5、4.5、13.5、40.5mg/L，醋氨酚0.08、0.24、0.72、2.16、6.48mg/L，布洛芬0.4、1.2、3.6、10.8、32.4mg/L。另设一个蒸馏水空白对照，每组4平行，每日监测pH、溶解氧、电导率等参数。急性毒性实验期间不换水不喂食，每个烧杯10只大型溞幼溞(龄期6～24h)；21天慢性毒性实验每天喂一次斜格栅藻液(0.15mg/d·溞)，每个烧杯1只大型溞雌性幼溞(龄期6～24h)，并且每隔三天更换一次实验溶液，以尽量确保目标物浓度一致。每天观察记录大型溞的效应终点参数(由步骤(1)筛选确定的效应终点参数，表1)。母溞开始繁殖后及时移出新生幼溞。实验结束时测量大型溞体长(从头盔至壳刺，不含尾刺)，并利用SPSS软件计算不同毒性终点对应的半致死性(50％Lethalconcentration，LC50)和半数效应(50％Effectconcentration，EC50)浓度，结果如表2所示。
表2双氯芬酸、醋氨酚和布洛芬对大型溞的急慢性毒性效应参数
分析结果显示三种化合物单独暴露时均对大型溞产生明显的急、慢性毒性作用(P<0.05)，并且随着暴露时间的延长和浓度的升高，对幼溞存活率、体长、脱壳、怀卵和产溞总数等产生不同程度的抑制作用，各效应终点参数敏感性强弱表现出一致趋势(繁殖情况最敏感，生长情况次之，存活情况最不敏感)，具体为EC50(产溞)<EC50(怀卵)<EC50(脱壳)<EC50(体长)<21dLC50<72hLC50<48hLC50<24hLC50，如表2所示。说明所选用的各效应终点参数能够比较稳定的反应不同种类的非甾体抗炎药类新型污染物的急慢性毒性效应。
因结构和理化性质等方面差异，导致双氯芬酸对大型溞的毒性要远高于醋氨酚，部分效应终点浓度甚至相差1个数量级，如EC50(产溞)和EC50(怀卵)，三种化合物毒性强弱依次为：双氯芬酸>布洛芬>醋氨酚。毒性实验结果与理论相符，进一步说明了大型溞上述各效应终点参数用于非甾体抗炎药类新型污染物急慢性毒性效应评估的可靠性。而且，所得的急慢性毒性效应结果可以定量的描述不同种类非甾体抗炎药类新型污染物的毒性及进行相对比较。
根据表2所得结果，参照欧盟委员会划分的污染物对水生生物的风险等级(EUDirective93/67/EEC，1996)：EC50<1mg/L表示非常有毒；1mg/L<EC50<10mg/L表示有毒；11mg/L<EC50<100mg/L表示有害)，三种化合物基本都对大型溞有毒，部分甚至非常有毒。暴露时间延长时，效应浓度也会相应降低，可推测这类污染物即便低水平暴露，但极有可能由于生物累积等效应而对水生生物的毒害性增强，生态风险不容忽视。

Claims (6)

1.一种基于大型溞毒性的非甾体抗炎药类新型污染物的毒性预测与评估方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将待测的非甾体抗炎药类新型污染物配制成呈等对数间距浓度的试验溶液，将大型溞暴露于试验溶液中；
b.急性毒性测定：记录暴露24h、48h、72h的大型溞的存活率；
慢性毒性测定：定期喂食并定期更换试验溶液，记录暴露21d的大型溞的存活率、体长、脱壳总次数、怀卵总次数和产溞总数；
c.根据急性毒性测定得到的数据计算得到24hLC50、48hLC50、72hLC50，根据慢性毒性测定数据计算得到21dLC50、体长EC50、脱壳EC50、怀卵EC50、产溞EC50。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a的大型溞为龄期为6～24小时的大型溞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b的急性毒性测定中暴露期间不换水不喂食。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b的记录大型溞的存活率，是以心脏停止跳动计为死亡。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b的定期喂食并定期更换试验溶液，是每天每只大型溞喂0.15mg斜格栅藻液一次，并且每隔三天更换一次试验溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非甾体抗炎药类新型污染物为双氯芬酸、醋氨酚和/或布洛芬。
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