CN104062416A - 一种造纸废水的毒性鉴别评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种造纸废水的毒性鉴别评价方法，属于造纸废水的毒性鉴别评价领域。其步骤为：(a)毒物特性评价，对造纸废水进行一系列物理化学处理，通过比较废水在各种处理前后的毒性变化确定毒物的理化特征，判定毒物类别，测试内容包括8种毒性：初始毒性测试、基线毒性测试、pH调节测试、pH调节/曝气测试、pH调节/过滤测试、pH调节/过滤/C18SPE测试、EDTA投加测试、Na2S2O3投加测试和梯度pH测试；(b)毒物鉴别阶段，(c)毒物确证阶段。本发明可以有效地鉴别出导致造纸废水毒性的关键污染物，该方法简化了废水的复杂性，减少了化学分析的工作量，提高了造纸废水毒性原因鉴别的可靠性。
Description
技术领域
本发明属于造纸废水的毒性鉴别评价领域，更具体地说，涉及一种对造纸废水进行毒性鉴别评价，寻找导致造纸废水毒性的关键毒物的方法。
背景技术
造纸废水是世人所瞩目的污染源，它能引起整个水体污染和生态环境的严重破坏，是世界范围的污染源。美国将造纸工业列为六大公害之一，其造纸工业的废水占工业废水总量的15％。日本造纸工业用水量占工业总用水量的60％，被列为五大公害之一。一些造纸发达国家如瑞典、芬兰的造纸工业对水源的有机负荷，均占全部工业的80％以上。由造纸废水的污染物控制可以看出各国造纸工业废水排放的监督和管理主要以理化监测为主，这虽能快速地定量测定某些造纸工业废水中污染物含量，但对于组份复杂的造纸工业废水来说，就难以用理化分析方法阐明其组份和对环境的影响。近几十年来，世界各国都广泛地开展了造纸工业废水及其组份的毒性评价和生物监测工作。造纸废水的污染性质可概括为以下几点：(1)造纸废水中COD、BOD负荷较大。主要是因为造纸废水中含有大量的溶解性有机物，它们在水体中消耗大量的氧，降低水中的溶解氧，危及鱼类及其它水生生物的生存。(2)毒性强，造纸废水中含有毒性较强的物质，主要为氯代有机物，它们对水生生物都有急性毒性。(3)“三致”作用。
控制造纸废水的毒物污染，必须有效控制并削减造纸废水的毒性，为此首先必须鉴别出导致这些造纸废水毒性的原因。而国内外的排放标准也只对COD、BOD、SS、AOX等理化指标进行测量与控制，无法确定导致造纸废水毒性的关键毒物，可能并未有效控制或削减废水的毒性。采用化学筛选法进行造纸废水的毒性鉴别评价，也存在多种缺陷。首先，化学筛选法假设有毒物质可被所使用的分析方法检测出来，但实际上分析仪器的选择是否适当和分析方法的灵敏度是否足以使毒物被检测出来并没有得到保证。第二，在使用化学筛选法时，必须确知被鉴别出的化学物质的毒性和多种共存化合物的联合毒性，但到目前为止可预测化学物质毒性的数据库、模型和评估多种共存化学物质联合毒性的方法是非常有限的，尤其对于被鉴别出的化学物质毒性的相互作用和基质效应更加难以评价。第三，化学筛选法的目标并不明确，对造纸废水中可能存在的优先控制污染物的选择性检测常常会导致一些不必要的分析，加大了工作量和资金投入，但废水中真正存在的毒物却因在检测范围以外而未能被检测出来。
而造纸废水的毒性鉴别评价方法可以有效地鉴别出导致造纸废水毒性的关键污染物，该方法简化了废水的复杂性，减少了化学分析的工作量，提高了造纸废水毒性原因鉴别的可靠性。
通过检索发现国内外文献没有关于采用相同方法对造纸废水进行毒性鉴别评价的报道。
发明内容
1、要解决的问题
针对由于造纸废水中含有大量的化学物质，但其中只有少量组分起着主要毒性贡献作用，而现有的化学筛选法难以查明造纸废水生态毒性真正原因的问题，本发明提供一种造纸废水的毒性鉴别评价方法，可以有效地鉴别出导致造纸废水毒性的关键污染物，该方法简化了废水的复杂性，减少了化学分析的工作量，提高了造纸废水毒性原因鉴别的可靠性。
2、技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种造纸废水的毒性鉴别评价方法，其步骤为：
(a)毒物特性评价，对造纸废水进行一系列物理化学处理，通过比较废水在各种处理前后的毒性变化确定毒物的理化特征，判定毒物类别，测试内容包括8种毒性：初始毒性测试、基线毒性测试、pH调节测试、pH调节/曝气测试、pH调节/过滤测试、pH调节/过滤/C18SPE测试、EDTA投加测试、Na2S2O3投加测试和梯度pH测试；
(b)毒物鉴别阶段，根据毒性特性评价阶段毒物特性测试判定出样品中存在毒物的类别，采用相应的分析技术，并跟踪样品在分析过程中的毒性变化，鉴别出导致样品毒性的可疑毒物；包括以下测试：非极性有机毒物的鉴别测试、极性有机毒物的鉴别测试、挥发性毒物的鉴别测试以及金属的鉴别测试
(c)毒物确证阶段，根据毒物特性评价阶段和毒性鉴别测试结果以及水样采集情况，选用相关分析方法、可疑毒物投加测试法、质量平衡法或可疑毒物去除测试法确证第二阶段鉴别出的可疑毒物是否确为导致样品毒性的主要毒物。
优选地，所述的步骤(a)中毒物特性评价前还包括准备阶段，准备好评价方法中所用生物大型溞：保持良好的培养条件，使大型溞的繁殖保持孤雌生殖，选用测试室条件下培养3代以上，大于6小时并且小于24小时龄的新生大型蚤。测试溞应是同一母体的后代。培养方法参照中国国家环保编制的《水生生物监测手册》。
优选地，所述的步骤(a)中的测试要求为：造纸废水一经采集，应立即进行常规理化测试和初始急性毒性测试，以减小由于样品毒性降解而引起的混淆效应，废水的初始LC50值为第一阶段的其它毒性测试提供理想的暴露浓度，也作为初始及基线毒性测试相互区别的参考；其余水样则调至pH3(表示pH等于3，以此类推)，pH11，并进行过滤、曝气、C18SPE固相萃取，然后，再把处理后的废水调至原废水的pHi(说明，本专利中所有的pHi表示原来的pH值)，并在4℃下保存过夜，第二天，对上述处理废水的pH进行检测，准确调至pHi，进行相关毒性测试。
优选地，所述的步骤(a)中所述的具体测试分别为：
初始毒性测试：废水到达测试室当天，立即进行急性毒性测试，每个毒性测试设5个浓度组，1个平行组，暴露水平分别设置为100％、50％、25％、12.5％、6.25％，以便获得废水24h LC50值，若在24h时，100％的测试生物死亡率小于50％，废弃所有水样，重新采用新鲜水样，当初始LC50小于25％，第一阶段其它毒性测试的最高浓度组是样品LC50初始浓度的4倍；当初始LC50大于25％，其它毒性测试的最高浓度组为废水的100％初始浓度；
基线毒性测试：废水到达第二天，对未经处理的原废水进行毒性测试，注意存放期间是否发生了明显的物理变化，暴露水平基于第一天初始毒性的24h LC50，当初始LC50小于25％，第一阶段其它毒性测试的最高浓度组是样品LC50初始浓度的4倍；当初始LC50大于25％，其它毒性测试的最高浓度组为废水的100％初始浓度，应尽量在同一时间把测试生物放于测试溶液中，便于比较基线毒性测试和特征毒性测试的废水的毒性。在第一阶段初始毒性测试之后进行基线毒性测试，它作为决定由添加特征测试所产生影响的依据，也为废水毒性降解提供数据，若废水初始毒性很小，而基线毒性改变很大，则需另采集新鲜废水；如果测试两天之内没有完成，则必须每天做测试之前先做一次基线毒性测试；
pH调节测试：取900ml废水，分别分成3份，300ml一份，其中两份用NaOH和HCl分别调至pH3和pH11，另外一份保持原来的pH；放置一段时间后，从三份样品中各取60ml，并将改变了pH值的废水用NaOH和HCl重新调回原来的pHi(剩余样品暂不回调，供pH调节/曝气测试、pH调节/过滤测试、pH调节/C18固相提取测试使用)，然后第二天取出保存过夜的废水，检测pH值是否仍为pHi，如有漂移，再次调节pH值，然后再分别进行急性毒性测试；
pH调节/曝气测试：取pH3、pHi、pH11的样品和稀释水各一份，置于小烧杯中曝气1h(样品要淹没曝气头)，并不断监测曝气过程中样品pH值的变化，及时调节，以保证样品pH漂移不超过0.5，将曝气后的样品重新调回pHi，然后进行毒性测试，曝气的稀释水作为空白对照；
pH调节/过滤测试：取240ml pH3、pHi、pH11废水分别用孔径为0.45μm的滤膜过滤(如果废水中颗粒物比较多，则每次加30-40ml废水，每2h换一次膜)，其中各种处理废水60ml用于过滤毒性测试，剩余用于pH调节/C18固相提取测试；第一天，准备过滤器，然后分别过滤不同pH值的废水和稀释水，并收集，然后将各收集液调回pHi，在4℃以下保存过夜，空白对照也要进行过滤处理，第二天进行毒性测试之前，检查pH3、pH11稀释水及过滤废水的pH值是否仍为pHi，如有漂移，再次调节到原来的pH，然后进行毒性测试，在急性毒性测试过程中，至少每24h检测一次pH，记录下所有暴露浓度的pH值；
pH调节/C18SPE固相提取测试：新柱子使用前，先用甲醇、二氯甲烷、正己烷及高纯水依次冲洗容器及泵，然后用15ml甲醇淋洗柱，过柱液丢弃，再用调至pH3或pH9的高纯水淋洗，老化过程中避免柱干裂，同时也应注意使用前后两种过柱液的混合度达到最小，若柱子再用甲醇淋洗时干涸，那么应重新用甲醇调节，流速一般为5ml/分钟，根据废水的具体情况选择C18SPE柱容量，在第一阶段选择吸附剂量为6ml(100mg)的C18SPE柱，第一天，将30ml不同的稀释水分别过柱，收集最后的10ml柱后液，并将它们的pH调至pHi，在4℃以下保存过夜，在最后稀释水过柱时，准备好200ml废水过柱，在过柱25ml后收集30ml柱后液，过柱150ml后再收集30ml柱后液，要求过柱25ml后收集的原因是避免稀释水混进来，过柱150ml的收集液是判断C18SPE柱是否达到饱和，两份收集液均调至pHi，记录所用酸碱体积，在4℃下保存过夜，第二天，在毒性测试之前，检查pH3，pH11稀释水及过滤废水的pH是否仍未pHi，如有漂移，再次调节到原来的pH，然后进行毒性测试；
Na2S2O3还原测试：将废水分为三组，每组含三种不同稀释度的废水，分别向三组废水中加入Na2S2O3储备液，使三组废水中的Na2S2O3的浓度依次为0.5、0.25、0.125×Na2S2O3的24h LC50，然后分别进行毒性测试；
EDTA螯合测试：EDTA投加测试在水样到达测试室第二天进行，EDTA的投加有两种方法：浓度梯度法和稀释法；浓度梯度法，在100％初始浓度的废水中依次加入0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125和0.0ml的EDTA储备液，然后分别放入大型溞，进行毒性测试；稀释法，将废水分为三组，每组含有三种不同稀释度的造纸废水，分别向三组废水中加入0.2ml的EDTA储备液，然后分别进行急性毒性测试；
梯度pH测试：将样品分别调至pH6、pH7、pH8，然后进行毒性测试。
优选地，所述的步骤(b)中具体的测试如下：
非极性有机毒物的鉴别测试：采取化学分级分离技术和毒性测试来评价样品通过C18SPE柱后洗脱组分是否具有急性毒性，并采用GC/MS分析仪定性定量分析出可疑毒物，具体步骤如下：C18SPE柱提取一定量样品，样品中的非极性有机化合物被吸附在C18SPE柱上，用少量的25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％和100％的甲醇溶液依次洗脱C18SPE柱，以分离和浓缩吸附在C18SPE柱上的非极性有机化合物，得到的洗脱液称SPE组分；分别用稀释水稀释这八个SPE组分至4×100％初始样品浓度，然后对其进行毒性测试，根据毒性测试结果确定出有毒的SPE组分，合并有毒的SPE组分，再用另一个C18SPE柱富集浓缩这一有毒的SPE组分于甲醇中，稀释浓缩液至8或4×100％初始样品浓度后进行毒性测试；根据毒性回收率＝浓缩液TU÷全样品TU×100％，计算C18SPE柱浓缩样品的毒性回收率，色质联用(GC/MS)定性定量分析浓缩液所含的非极性有机组分，根据GC/MS定性定量分析结果和毒性回收率计算出这些非极性有机化合物在样品中的浓度，并与它们的测试或文献报道的毒性值相比较，鉴别出样品中的可疑毒物；
极性有机毒物的鉴别测试：用C18SPE柱固相提取一定量废水，废水中的极性化合物被部分吸附在C18SPE柱上，100％甲醇洗脱C18SPE柱，可将少量被吸附的极性有机化合物洗脱下来，然后对100％甲醇洗脱液进行GC/MS定性分析，可初步了解废水中存在极性有机化合物的种类；对于这一步只是定性分析，因此只要废水中存在的极性有机化合物在洗脱中的含量可被GC/MS检测出即可，而不需要化合物在洗脱液中有很高的回收率。以被检测出的极性有机化合物的标准样品为标准物，用高效液相色谱(HPLC)分析这些极性有机化合物在废水中的浓度，并与它们的测试或文献报道的毒性值相比较，鉴别出废水中存在的极性可疑毒物；
挥发性毒物的鉴别测试：测试氨和氰化物，采用纳氏剂光度法，测定样品中总氨氮的浓度，计算出非离子氨的浓度，计算根据国家环保局1994年12月26日颁布的《地面水环境质量标准非离子氨换算方法》，对氨进行单一化合物的毒性测试，根据氨的毒性值判定氨在样品中存在浓度能否导致样品毒性，采用硝酸银滴定法，测定样品中氰化物的浓度，对氰化物进行单一化合物的毒性测试，根据氰化物的毒性值判定氰化物在样品中的存在浓度能否导致样品毒性；
金属的鉴别测试：采用原子吸收光谱法或电感耦合等离子发射光谱法分析样品中所含金属的种类和浓度，并对分析出的金属进行单一化合物毒性测试或查找相关文献以获得它们的毒性值，然后对金属在样品中的浓度和它的测试或文献报道的毒性值进行比较，鉴别出样品中存在的可疑毒物。
优选地，所述的步骤(c)中包括的测试的具体内容为：
质量平衡法：质量平衡法适用于可疑毒物为非极性有机化合物的样品的毒物确证，具体步骤如下：对第二阶段毒物鉴别测试中已经确定毒性的八个SPE组份进行有毒SPE组份、无毒SPE组份和全部SPE组份的毒性测试，有毒SPE组份的毒性测试：各取一定量有毒的SPE组份一起加入适量稀释水中，配置成100％初始浓度的样品，进行毒性测试；无毒SPE组份毒性测试：各取一定量无毒的SPE组份一起加入稀释水中，配置成100％初始浓度的样品，进行毒性测试；全部SPE组分毒性测试：各取一定量的八个SPE组份一起加入适量稀释水中，配置成100％初始浓度的样品，进行毒性测试；若无毒SPE组份没有毒性，而有毒SPE组份的全部SPE组份毒性与被C18SPE柱从样品中去除的毒性基本相同，则说明导致样品毒性的主要毒物确被洗脱在有毒SPE组份中，因此第二阶段从有毒SPE组份中鉴别出的可疑毒物确为导致样品毒性的主要毒物；
相关分析法：在不同时间采集同种样品的几个水样，分别对这些样品水样进行毒性测试。得到它们的实测毒性单位(OBTU)，采用第二阶段的分析方法分析可疑毒物在这些样品中的浓度，并根据毒性值计算它们的毒性单位，成为预测毒性单位(PRTU)，对这种样品的实测毒性单位和预测毒性单位进行相关分析；若相关分析曲线的相关系数r2≥0.8，则表明样品的实测毒性单位和预测毒性单位进行相关性好，第二阶段鉴别出的可疑毒物确为导致样品毒性的主要毒物；
可疑毒物投加测试法：在经过处理毒性已经基本去除的样品中以不同浓度投加可疑毒物，配置成一系列浓度不同的模拟样品；分别对每个模拟样品进行毒性测试，并对模拟样品的实测毒性单位(OBTU)和投加的可疑毒物浓度进行相关分析；若相关分析曲线相关系数r2≥0.8，则表明样品的实测毒性单位和投加的可疑毒物浓度进行相关性好，样品与可疑毒物浓度成正比，第二阶段鉴别出的可疑毒物确为导致样品毒性的主要毒物；
可疑毒物去除测试法：采用适当的处理操作从样品中去除可疑毒物，并对处理后的样品进行毒性测试，若样品的毒性明显降低，则证明第二阶段鉴别出的可以毒物确为导致样品毒性的主要毒物。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明可以有效地鉴别出导致造纸废水毒性的关键污染物，可有效的进行造纸废水毒性鉴别评价；
(2)本发明该方法简化了废水的复杂性，减少了化学分析的工作量，提高了造纸废水毒性原因鉴别的可靠性，克服了现有的化学筛选法难以查明造纸废水生态毒性真正原因的一些缺点；
(3)本发明可有效的进行造纸废水毒性鉴别评价。
附图说明
图1为毒物特性测试程序示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
采取某造纸废水进行毒性鉴别评价，其步骤为：
如图1所示，先对实验进行准备，准备好评价方法中所用生物大型溞：保持良好的培养条件，使大型溞的繁殖保持孤雌生殖，选用测试室条件下培养3代以上，大于6小时并且小于24小时龄的新生大型蚤。测试溞应是同一母体的后代。培养方法参照中国国家环保编制的《水生生物监测手册》。
造纸废水一经采集，应立即进行常规理化测试和初始急性毒性测试，以减小由于样品毒性降解而引起的混淆效应，废水的初始LC50值为第一阶段的其它毒性测试提供理想的暴露浓度，也作为初始及基线毒性测试相互区别的参考；其余水样则调至pH3(，pH11，并进行过滤、曝气、C18SPE固相萃取，然后，再把处理后的废水调至原废水的pHi，并在4℃下保存过夜，第二天，对上述处理废水的pH进行检测，准确调至pHi，进行相关毒性测试。
(a)毒物特性评价，对造纸废水进行一系列物理化学处理，通过比较废水在各种处理前后的毒性变化确定毒物的理化特征，判定毒物类别，测试内容包括8种毒性：初始毒性测试、基线毒性测试、pH调节测试、pH调节/曝气测试、pH调节/过滤测试、pH调节/过滤/C18SPE测试、EDTA投加测试、Na2S2O3投加测试和梯度pH测试；
具体测试分别为：
初始毒性测试：废水到达测试室当天，立即进行急性毒性测试，每个毒性测试设5个浓度组，1个平行组，暴露水平分别设置为100％、50％、25％、12.5％、6.25％，以便获得废水24h LC50值，若在24h时，100％的测试生物死亡率小于50％，废弃所有水样，重新采用新鲜水样，当初始LC50小于25％，第一阶段其它毒性测试的最高浓度组是样品LC50初始浓度的4倍；当初始LC50大于25％，其它毒性测试的最高浓度组为废水的100％初始浓度；
基线毒性测试：废水到达第二天，对未经处理的原废水进行毒性测试，注意存放期间是否发生了明显的物理变化，暴露水平基于第一天初始毒性的24h LC50，当初始LC50小于25％，第一阶段其它毒性测试的最高浓度组是样品LC50初始浓度的4倍；当初始LC50大于25％，其它毒性测试的最高浓度组为废水的100％初始浓度，应尽量在同一时间把测试生物放于测试溶液中，便于比较基线毒性测试和特征毒性测试的废水的毒性。在第一阶段初始毒性测试之后进行基线毒性测试，它作为决定由添加特征测试所产生影响的依据，也为废水毒性降解提供数据，若废水初始毒性很小，而基线毒性改变很大，则需另采集新鲜废水；如果测试两天之内没有完成，则必须每天做测试之前先做一次基线毒性测试；
pH调节测试：取900ml废水，分别分成3份，300ml一份，其中两份用NaOH和HCl分别调至pH3和pH11，另外一份保持原来的pH；放置一段时间后，从三份样品中各取60ml，并将改变了pH值的废水用NaOH和HCl重新调回原来的pHi，剩余样品暂不回调，供pH调节/曝气测试、pH调节/过滤测试、pH调节/C18固相提取测试使用，然后第二天取出保存过夜的废水，检测pH值是否仍为pHi，如有漂移，再次调节pH值，然后再分别进行急性毒性测试；
pH调节/曝气测试：取pH3、pHi、pH11的样品和稀释水各一份，置于小烧杯中曝气1h(样品要淹没曝气头)，并不断监测曝气过程中样品pH值的变化，及时调节，以保证样品pH漂移不超过0.5，将曝气后的样品重新调回pHi，然后进行毒性测试，曝气的稀释水作为空白对照；
pH调节/过滤测试：取240ml pH3、pHi、pH11废水分别用孔径为0.45μm的滤膜过滤，其中各种处理废水60ml用于过滤毒性测试，剩余用于pH调节/C18固相提取测试；第一天，准备过滤器，然后分别过滤不同pH值的废水和稀释水，并收集，然后将各收集液调回pHi，在4℃以下保存过夜，空白对照也要进行过滤处理，第二天进行毒性测试之前，检查pH3、pH11稀释水及过滤废水的pH值是否仍为pHi，如有漂移，再次调节到原来的pH，然后进行毒性测试，在急性毒性测试过程中，至少每24h检测一次pH，记录下所有暴露浓度的pH值；
pH调节/C18SPE固相提取测试：新柱子使用前，先用甲醇、二氯甲烷、正己烷及高纯水依次冲洗容器及泵，然后用15ml甲醇淋洗柱，过柱液丢弃，再用调至pH3或pH9的高纯水淋洗，老化过程中避免柱干裂，同时也应注意使用前后两种过柱液的混合度达到最小，若柱子再用甲醇淋洗时干涸，那么应重新用甲醇调节，流速一般为5ml/分钟，根据废水的具体情况选择C18SPE柱容量，在第一阶段选择吸附剂量为6ml(100mg)的C18SPE柱，第一天，将30ml不同的稀释水分别过柱，收集最后的10ml柱后液，并将它们的pH调至pHi，在4℃以下保存过夜，在最后稀释水过柱时，准备好200ml废水过柱，在过柱25ml后收集30ml柱后液，过柱150ml后再收集30ml柱后液，要求过柱25ml后收集的原因是避免稀释水混进来，过柱150ml的收集液是判断C18SPE柱是否达到饱和，两份收集液均调至pHi，记录所用酸碱体积，在4℃下保存过夜，第二天，在毒性测试之前，检查pH3，pH11稀释水及过滤废水的pH是否仍未pHi，如有漂移，再次调节到原来的pH，然后进行毒性测试；
Na2S2O3还原测试：将废水分为三组，每组含三种不同稀释度的废水，分别向三组废水中加入Na2S2O3储备液，使三组废水中的Na2S2O3的浓度依次为0.5、0.25、0.125×Na2S2O3的24h LC50，然后分别进行毒性测试；
EDTA螯合测试：EDTA投加测试在水样到达测试室第二天进行，EDTA的投加有两种方法：浓度梯度法和稀释法；浓度梯度法，在100％初始浓度的废水中依次加入0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125和0.0ml的EDTA储备液，然后分别放入大型溞，进行毒性测试；稀释法，将废水分为三组，每组含有三种不同稀释度的造纸废水，分别向三组废水中加入0.2ml的EDTA储备液，然后分别进行急性毒性测试；
梯度pH测试：将样品分别调至pH6、pH7、pH8，然后进行毒性测试。
(b)毒物鉴别阶段，根据毒性特性评价阶段毒物特性测试判定出样品中存在毒物的类别，采用相应的分析技术，并跟踪样品在分析过程中的毒性变化，鉴别出导致样品毒性的可疑毒物；包括以下测试：非极性有机毒物的鉴别测试、极性有机毒物的鉴别测试、挥发性毒物的鉴别测试以及金属的鉴别测试；
具体的测试如下：
非极性有机毒物的鉴别测试：采取化学分级分离技术和毒性测试来评价样品通过C18SPE柱后洗脱组分是否具有急性毒性，并采用GC/MS分析仪定性定量分析出可疑毒物，具体步骤如下：C18SPE柱提取一定量样品，样品中的非极性有机化合物被吸附在C18SPE柱上，用少量的25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％和100％的甲醇溶液依次洗脱C18SPE柱，以分离和浓缩吸附在C18SPE柱上的非极性有机化合物，得到的洗脱液称SPE组分；分别用稀释水稀释这八个SPE组分至4×100％初始样品浓度，然后对其进行毒性测试，根据毒性测试结果确定出有毒的SPE组分，合并有毒的SPE组分，再用另一个C18SPE柱富集浓缩这一有毒的SPE组分于甲醇中，稀释浓缩液至8或4×100％初始样品浓度后进行毒性测试；根据毒性回收率＝浓缩液TU÷全样品TU×100％，计算C18SPE柱浓缩样品的毒性回收率，色质联用(GC/MS)定性定量分析浓缩液所含的非极性有机组分，根据GC/MS定性定量分析结果和毒性回收率计算出这些非极性有机化合物在样品中的浓度，并与它们的测试或文献报道的毒性值相比较，鉴别出样品中的可疑毒物；
极性有机毒物的鉴别测试：用C18SPE柱固相提取一定量废水，废水中的极性化合物被部分吸附在C18SPE柱上，100％甲醇洗脱C18SPE柱，可将少量被吸附的极性有机化合物洗脱下来，然后对100％甲醇洗脱液进行GC/MS定性分析，可初步了解废水中存在极性有机化合物的种类；对于这一步只是定性分析，因此只要废水中存在的极性有机化合物在洗脱中的含量可被GC/MS检测出即可，而不需要化合物在洗脱液中有很高的回收率。以被检测出的极性有机化合物的标准样品为标准物，用高效液相色谱(HPLC)分析这些极性有机化合物在废水中的浓度，并与它们的测试或文献报道的毒性值相比较，鉴别出废水中存在的极性可疑毒物；
挥发性毒物的鉴别测试：测试氨和氰化物，采用纳氏剂光度法，测定样品中总氨氮的浓度，计算出非离子氨的浓度，计算根据国家环保局1994年12月26日颁布的《地面水环境质量标准非离子氨换算方法》，对氨进行单一化合物的毒性测试，根据氨的毒性值判定氨在样品中存在浓度能否导致样品毒性，采用硝酸银滴定法，测定样品中氰化物的浓度，对氰化物进行单一化合物的毒性测试，根据氰化物的毒性值判定氰化物在样品中的存在浓度能否导致样品毒性；
金属的鉴别测试：采用原子吸收光谱法或电感耦合等离子发射光谱法分析样品中所含金属的种类和浓度，并对分析出的金属进行单一化合物毒性测试或查找相关文献以获得它们的毒性值，然后对金属在样品中的浓度和它的测试或文献报道的毒性值进行比较，鉴别出样品中存在的可疑毒物。
(c)毒物确证阶段，根据毒物特性评价阶段和毒性鉴别测试结果以及水样采集情况，选用相关分析方法、可疑毒物投加测试法、质量平衡法或可疑毒物去除测试法确证第二阶段鉴别出的可疑毒物是否确为导致样品毒性的主要毒物。
测试的具体内容为：
质量平衡法：质量平衡法适用于可疑毒物为非极性有机化合物的样品的毒物确证，具体步骤如下：对第二阶段毒物鉴别测试中已经确定毒性的八个SPE组份进行有毒SPE组份、无毒SPE组份和全部SPE组份的毒性测试，有毒SPE组份的毒性测试：各取一定量有毒的SPE组份一起加入适量稀释水中，配置成100％初始浓度的样品，进行毒性测试；无毒SPE组份毒性测试：各取一定量无毒的SPE组份一起加入稀释水中，配置成100％初始浓度的样品，进行毒性测试；全部SPE组分毒性测试：各取一定量的八个SPE组份一起加入适量稀释水中，配置成100％初始浓度的样品，进行毒性测试；若无毒SPE组份没有毒性，而有毒SPE组份的全部SPE组份毒性与被C18SPE柱从样品中去除的毒性基本相同，则说明导致样品毒性的主要毒物确被洗脱在有毒SPE组份中，因此第二阶段从有毒SPE组份中鉴别出的可疑毒物确为导致样品毒性的主要毒物；
相关分析法：在不同时间采集同种样品的几个水样，分别对这些样品水样进行毒性测试。得到它们的实测毒性单位(OBTU)，采用第二阶段的分析方法分析可疑毒物在这些样品中的浓度，并根据毒性值计算它们的毒性单位，成为预测毒性单位(PRTU)，对这种样品的实测毒性单位和预测毒性单位进行相关分析；若相关分析曲线的相关系数r2≥0.8，则表明样品的实测毒性单位和预测毒性单位进行相关性好，第二阶段鉴别出的可疑毒物确为导致样品毒性的主要毒物；
可疑毒物投加测试法：在经过处理毒性已经基本去除的样品中以不同浓度投加可疑毒物，配置成一系列浓度不同的模拟样品；分别对每个模拟样品进行毒性测试，并对模拟样品的实测毒性单位(OBTU)和投加的可疑毒物浓度进行相关分析；若相关分析曲线相关系数r2≥0.8，则表明样品的实测毒性单位和投加的可疑毒物浓度进行相关性好，样品与可疑毒物浓度成正比，第二阶段鉴别出的可疑毒物确为导致样品毒性的主要毒物；
可疑毒物去除测试法：采用适当的处理操作从样品中去除可疑毒物，并对处理后的样品进行毒性测试，若样品的毒性明显降低，则证明第二阶段鉴别出的可以毒物确为导致样品毒性的主要毒物。
水环处总进水第一阶段毒性试验结果见表1。
表1 造纸废水第一阶段毒性特性试验结果
根据初试毒性试验结果，确定最高试验浓度为100％全废水。在第二天进行的基线毒性试验中，24h LC50为29％，说明该废水比较稳定，毒性随时间的变化小。由表1可以看出，为处理废水对大型溞的24h LC50为0.29，毒性单位TU为3.45。废水经pH调节后，游离态氯气有所减少，废水的毒性略有下降，TU从3.45降到2.27至2.63；而经过pH调节/曝气后，毒性下降明显，降到1.75至1.83，怀疑是废水中含有可挥发的氯气，由于氯气的逃逸降低了废水的毒性。在Na2S2O3投入以后废水毒性下降明显，降至1.75至2.27，说明废水中有毒物质被Na2S2O3还原成低毒的物质，可判断废水中的毒物为氧化性物质。根据废水的来源，可以判断出废水中的有毒物质可能是具有氧化性的氯化物。
毒物鉴别阶段：从毒性特性评价阶段的试验结果看，废水中可以测出氯气和1价氧化态的氯化物，它们的存在和去除，可以引起废水毒性的大幅度变化。氯气在水中可以产生次氯酸和次氯酸根，若废水中存在有机胺类化合物，还将产生1价氧化态的有机氯化物，如C6H5NHCl或C6H5NHCl2等，它们均属于总残余氯。它们均属于总残余氯，可被DPD比色法测定出来。另外，从第一阶段中C18SPE柱后液毒性降低的现象来看，废水中可能存在有机化合物。于是，将第二阶段的八个分级分离组分进行了48h大型溞毒性试验，结果发现8个组份均无毒。这说明废水中含导致造纸废水毒性的有机氯化物几乎不起毒性贡献作用。氯气及1价氧化态氯化物，即次氯酸和次氯酸根被怀疑是引起废水毒性的主要物质。
毒物确证阶段：根据前面试验结果，可以推断造纸废水中可疑有毒物质为氯气、次氯酸和次氯酸根。为了确证这一事实，采用毒物删除试验，在原废水中投加了不同量的Na2S2O3，分析其总残余氯量，同时观察48h大型溞毒性效应.结果表明，随着Na2S2O3浓度的增加，废水中总残余氯迅速减少，废水的毒性也锐减。这一结果充分说明废水中氯气、次氯酸和次氯酸根为该废水的关键有毒物质。当废水的总残余氯减少时，废水的毒性也逐渐减小，并呈现出较好的相关性。由此可见，废水的毒性直接受总残余氯的控制，这为上述毒物鉴定的结果又提供了一个佐证。
总结：通过造纸废水的毒性鉴别评价方法可以确定导致纸厂废水生态毒性的关键毒物是氯气、次氯酸和次氯酸根。这说明国内的漂白技术还需要发展和进步，特别是在减轻环境污染的强大压力下，寻找少污染和无污染的漂白方法和漂白药品。
Claims (6)
1.一种造纸废水的毒性鉴别评价方法，其步骤为：
(a)毒物特性评价，对造纸废水进行一系列物理化学处理，通过比较废水在各种处理前后的毒性变化确定毒物的理化特征，判定毒物类别，测试内容包括8种毒性：初始毒性测试、基线毒性测试、pH调节测试、pH调节/曝气测试、pH调节/过滤测试、pH调节/过滤/C18SPE测试、EDTA投加测试、Na2S2O3投加测试和梯度pH测试；
(b)毒物鉴别阶段，根据毒性特性评价阶段毒物特性测试判定出样品中存在毒物的类别，采用相应的分析技术，并跟踪样品在分析过程中的毒性变化，鉴别出导致样品毒性的可疑毒物；包括以下测试：非极性有机毒物的鉴别测试、极性有机毒物的鉴别测试、挥发性毒物的鉴别测试以及金属的鉴别测试；
(c)毒物确证阶段，根据毒物特性评价阶段和毒性鉴别测试结果以及水样采集情况，选用相关分析方法、可疑毒物投加测试法、质量平衡法或可疑毒物去除测试法确证第二阶段鉴别出的可疑毒物是否确为导致样品毒性的主要毒物。
2.根据权利要求1所述的一种造纸废水的毒性鉴别评价方法，其特征在于：所述的步骤(a)中毒物特性评价前还包括准备阶段，准备好评价方法中所用生物大型溞：保持良好的培养条件，使大型溞的繁殖保持孤雌生殖，选用测试室条件下培养3代以上，大于6小时并且小于24小时龄的新生大型蚤。
3.根据权利要求2所述的一种造纸废水的毒性鉴别评价方法，其特征在于：所述的步骤(a)中的测试要求为：造纸废水一经采集，应立即进行常规理化测试和初始急性毒性测试，以减小由于样品毒性降解而引起的混淆效应，废水的初始LC50值为第一阶段的其它毒性测试提供理想的暴露浓度，也作为初始及基线毒性测试相互区别的参考；其余水样分别有一组调至pH3和pH11，并进行过滤、曝气、C18SPE固相萃取，然后，再把处理后的废水调至原废水的pHi，并在4℃下保存过夜，第二天，对上述处理废水的pH进行检测，准确调至pHi，进行相关毒性测试。
4.根据权利要求3所述的一种造纸废水的毒性鉴别评价方法，其特征在于：所述的步骤(a)中所述的具体测试分别为：
初始毒性测试：废水到达测试室当天，立即进行急性毒性测试，每个毒性测试设5个浓度组，1个平行组，暴露水平分别设置为100％、50％、25％、12.5％、6.25％，以便获得废水24h LC50值，若在24h时，100％的测试生物死亡率小于50％，废弃所有水样，重新采用新鲜水样，当初始LC50小于25％，第一阶段其它毒性测试的最高浓度组是样品LC50初始浓度的4倍；当初始LC50大于25％，其它毒性测试的最高浓度组为废水的100％初始浓度；
基线毒性测试：废水到达第二天，对未经处理的原废水进行毒性测试，注意存放期间是否发生了明显的物理变化，暴露水平基于第一天初始毒性的24h LC50，当初始LC50小于25％，第一阶段其它毒性测试的最高浓度组是样品LC50初始浓度的4倍；当初始LC50大于25％，其它毒性测试的最高浓度组为废水的100％初始浓度，应尽量在同一时间把测试生物放于测试溶液中，便于比较基线毒性测试和特征毒性测试的废水的毒性。在第一阶段初始毒性测试之后进行基线毒性测试，它作为决定由添加特征测试所产生影响的依据，也为废水毒性降解提供数据，若废水初始毒性很小，而基线毒性改变很大，则需另采集新鲜废水；
pH调节测试：取900ml废水，分别分成3份，300ml一份，其中两份用NaOH和HCl分别调至pH3和pH11，另外一份保持原来的pH；放置一段时间后，从三份样品中各取60ml，并将改变了pH值的废水用NaOH和HCl重新调回原来的pHi，然后第二天取出保存过夜的废水，检测pH值是否仍为pHi，如有漂移，再次调节pH值，然后再分别进行急性毒性测试；
pH调节/曝气测试：取pH3、pHi、pH11的样品和稀释水各一份，置于小烧杯中曝气1h，并不断监测曝气过程中样品pH值的变化，及时调节，以保证样品pH漂移不超过0.5，将曝气后的样品重新调回pHi，然后进行毒性测试，曝气的稀释水作为空白对照；
pH调节/过滤测试：取240ml pH3、pHi、pH11废水分别用孔径为0.45μm的滤膜过滤，其中各种处理废水60ml用于过滤毒性测试，剩余用于pH调节/C18固相提取测试；第一天，准备过滤器，然后分别过滤不同pH值的废水和稀释水，并收集，然后将各收集液调回pHi，在4℃以下保存过夜，空白对照也要进行过滤处理，第二天进行毒性测试之前，检查pH3、pH11稀释水及过滤废水的pH值是否仍为pHi，如有漂移，再次调节到原来的pH，然后进行毒性测试，在急性毒性测试过程中，至少每24h检测一次pH，记录下所有暴露浓度的pH值；
pH调节/C18SPE固相提取测试：新柱子使用前，先用甲醇、二氯甲烷、正己烷及高纯水依次冲洗容器及泵，然后用15ml甲醇淋洗柱，过柱液丢弃，再用调至pH3或pH9的高纯水淋洗，在第一阶段选择吸附剂量为6ml(100mg)的C18SPE柱，第一天，将30ml不同的稀释水分别过柱，收集最后的10ml柱后液，并将它们的pH调至pHi，在4℃以下保存过夜，在最后稀释水过柱时，准备好200ml废水过柱，在过柱25ml后收集30ml柱后液，过柱150ml后再收集30ml柱后液，两份收集液均调至pHi，记录所用酸碱体积，在4℃下保存过夜，第二天，在毒性测试之前，检查pH3，pH11稀释水及过滤废水的pH是否仍未pHi，如有漂移，再次调节到原来的pH，然后进行毒性测试；
Na2S2O3还原测试：将废水分为三组，每组含三种不同稀释度的废水，分别向三组废水中加入Na2S2O3储备液，使三组废水中的Na2S2O3的浓度依次为0.5、0.25、0.125×Na2S2O3的24h LC50，然后分别进行毒性测试；
EDTA螯合测试：EDTA投加测试在水样到达测试室第二天进行，EDTA的投加有两种方法：浓度梯度法和稀释法；浓度梯度法，在100％初始浓度的废水中依次加入0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125和0.0ml的EDTA储备液，然后分别放入大型溞，进行毒性测试；稀释法，将废水分为三组，每组含有三种不同稀释度的造纸废水，分别向三组废水中加入0.2ml的EDTA储备液，然后分别进行急性毒性测试；
梯度pH测试：将样品分别调至pH6、pH7、pH8，然后进行毒性测试。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的一种造纸废水的毒性鉴别评价方法，其特征在于：所述的步骤(b)中具体的测试如下：
非极性有机毒物的鉴别测试：采取化学分级分离技术和毒性测试来评价样品通过C18SPE柱后洗脱组分是否具有急性毒性，并采用GC/MS分析仪定性定量分析出可疑毒物，具体步骤如下：C18SPE柱提取一定量样品，样品中的非极性有机化合物被吸附在C18SPE柱上，用少量的25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％和100％的甲醇溶液依次洗脱C18SPE柱，以分离和浓缩吸附在C18SPE柱上的非极性有机化合物，得到的洗脱液称SPE组分；分别用稀释水稀释这八个SPE组分至4×100％初始样品浓度，然后对其进行毒性测试，根据毒性测试结果确定出有毒的SPE组分，合并有毒的SPE组分，再用另一个C18SPE柱富集浓缩这一有毒的SPE组分于甲醇中，稀释浓缩液至8或4×100％初始样品浓度后进行毒性测试；根据毒性回收率＝浓缩液TU÷全样品TU×100％，计算C18SPE柱浓缩样品的毒性回收率，色质联用定性定量分析浓缩液所含的非极性有机组分，根据GC/MS定性定量分析结果和毒性回收率计算出这些非极性有机化合物在样品中的浓度，并与它们的测试或文献报道的毒性值相比较，鉴别出样品中的可疑毒物；
极性有机毒物的鉴别测试：用C18SPE柱固相提取一定量废水，废水中的极性化合物被部分吸附在C18SPE柱上，100％甲醇洗脱C18SPE柱，可将少量被吸附的极性有机化合物洗脱下来，然后对100％甲醇洗脱液进行GC/MS定性分析，可初步了解废水中存在极性有机化合物的种类；以被检测出的极性有机化合物的标准样品为标准物，用高效液相色谱分析这些极性有机化合物在废水中的浓度，并与它们的测试或文献报道的毒性值相比较，鉴别出废水中存在的极性可疑毒物；
挥发性毒物的鉴别测试：测试氨和氰化物，采用纳氏剂光度法，测定样品中总氨氮的浓度，计算出非离子氨的浓度，对氨进行单一化合物的毒性测试，根据氨的毒性值判定氨在样品中存在浓度能否导致样品毒性，采用硝酸银滴定法，测定样品中氰化物的浓度，对氰化物进行单一化合物的毒性测试，根据氰化物的毒性值判定氰化物在样品中的存在浓度能否导致样品毒性；
金属的鉴别测试：采用原子吸收光谱法或电感耦合等离子发射光谱法分析样品中所含金属的种类和浓度，并对分析出的金属进行单一化合物毒性测试或查找相关文献以获得它们的毒性值，然后对金属在样品中的浓度和它的测试或文献报道的毒性值进行比较，鉴别出样品中存在的可疑毒物。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的一种造纸废水的毒性鉴别评价方法，其特征在于：所述的步骤(c)中包括的测试的具体内容为：
质量平衡法：具体步骤如下：对第二阶段毒物鉴别测试中已经确定毒性的八个SPE组份进行有毒SPE组份、无毒SPE组份和全部SPE组份的毒性测试，有毒SPE组份的毒性测试：各取一定量有毒的SPE组份一起加入适量稀释水中，配置成100％初始浓度的样品，进行毒性测试；无毒SPE组份毒性测试：各取一定量无毒的SPE组份一起加入稀释水中，配置成100％初始浓度的样品，进行毒性测试；全部SPE组分毒性测试：各取一定量的八个SPE组份一起加入适量稀释水中，配置成100％初始浓度的样品，进行毒性测试；若无毒SPE组份没有毒性，而有毒SPE组份的全部SPE组份毒性与被C18SPE柱从样品中去除的毒性基本相同，则说明导致样品毒性的主要毒物确被洗脱在有毒SPE组份中，因此第二阶段从有毒SPE组份中鉴别出的可疑毒物确为导致样品毒性的主要毒物；
相关分析法：在不同时间采集同种样品的几个水样，分别对这些样品水样进行毒性测试。得到它们的实测毒性单位，采用第二阶段的分析方法分析可疑毒物在这些样品中的浓度，并根据毒性值计算它们的毒性单位，成为预测毒性单位，对这种样品的实测毒性单位和预测毒性单位进行相关分析；若相关分析曲线的相关系数r2≥0.8，则表明样品的实测毒性单位和预测毒性单位进行相关性好，第二阶段鉴别出的可疑毒物确为导致样品毒性的主要毒物；
可疑毒物投加测试法：在经过处理毒性已经基本去除的样品中以不同浓度投加可疑毒物，配置成一系列浓度不同的模拟样品；分别对每个模拟样品进行毒性测试，并对模拟样品的实测毒性单位和投加的可疑毒物浓度进行相关分析；若相关分析曲线相关系数r2≥0.8，则表明样品的实测毒性单位和投加的可疑毒物浓度进行相关性好，样品与可疑毒物浓度成正比，第二阶段鉴别出的可疑毒物确为导致样品毒性的主要毒物；
可疑毒物去除测试法：采用适当的处理操作从样品中去除可疑毒物，并对处理后的样品进行毒性测试，若样品的毒性明显降低，则证明第二阶段鉴别出的可以毒物确为导致样品毒性的主要毒物。
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