CN108120812A - 一种印染废水中成组生物毒性监测及鉴别评估方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种主要以印染废水为研究对象的成组生物毒性监测试验及鉴别评估方法，属于生物毒性识别领域。其步骤为：筛选发光菌、斑马鱼幼鱼、斑马鱼胚胎及小球藻作为供试生物，并采用成组生物毒性试验，结合毒性评价方法对印染废水进行风险及毒性削减评估，并根据废水污染特征及结果，结合TIE技术构建毒性鉴别评估体系。本发明涵盖了分解者、生产者、消费者3个营养级的成组生物毒性试验来表征印染废水的毒性，解决了单一生物毒性测试不具有代表性的问题，具有全面、简单、高效、从源头控制、安全性高等优点，可广泛应用于研究和评价有毒污染物对生态环境的影响，为生态风险评价评价提供一定的依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物毒性识别领域，尤其是一种印染废水中成组生物毒性监测及鉴别评估方法。
背景技术
近年来，随着中国纺织行业的迅速发展，印染废水的水生态安全问题引起了越来越多人的关注。而众多研究者也认识到了理化监测的不足，逐渐将生物毒性试验与理化分析结合起来对废水进行生态风险评价。然而，单一生物毒性测试结果不具有代表性，而成组生物毒性测试能够客观的反映废水的安全性。此外，为了直接的表征废水的毒性，需要进行开发全面而综合的毒性评价指标。最后，工业废水基质复杂，就亟需开发致毒物质的鉴定评估技术。但基于成组生物毒性试验，采用综合毒性评价及鉴定评估技术评价废水毒性的研究较少。
本研究印染废水为研究对象，结合常规理化指标，并在成组生物毒性试验(发光菌急性毒性、斑马鱼幼鱼急性毒性、斑马鱼胚胎发育毒性及小球藻急性毒性实验)的基础上，评价了两种废水的综合生物毒性，比较了毒性单位(Toxic Unit，简称TU)、平均毒性(Average Toxictiy，简称AvTx)、毒性指数(Toxic Print，简称TxPr)、最敏感的测试(MostSensitive Test，简称MST)及潜在毒性效应指数(Potential Ecotoxic Effects Probe，简称PEEP)五种毒性评价的方法，并对制革及印染废水处理不同工艺段进行了毒性削减评估。最后，对两种受试废水中出水存在发光菌急性毒性的废水，采用毒性鉴别评估(ToxicityIdentification Evaluation，简称TIE)法对其中的制毒物质进行了毒性鉴别评估。
发明内容
本发明针对单一生物毒性测试结果不具有代表性的问题，提出了成组生物毒性测试能够客观的反映废水的安全性，为了直接的表征废水的毒性，需要进行开发全面而综合的毒性评价指标。工业废水基质复杂，就亟需开发致毒物质的鉴定评估技术。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
1.筛选可表征水生生态系统污染程度的模式生物；
2.采用成组生物毒性试验；
3.结合综合毒性评价方法对印染废水进行风险评估；
4.并根据印染废水污染特征及结果；
5.结合TIE技术构建毒性鉴别评估体系。
本发明与其它方法相比，有益之处在于：
本发明通过以发光菌、斑马鱼幼鱼、斑马鱼胚胎及小球藻作为供试生物，并采用发光菌急性毒性、斑马鱼幼鱼急性毒性、斑马鱼胚胎发育毒性及小球藻急性毒性试验，通过涵盖了分解者(发光菌)、生产者(小球藻)、消费者(斑马鱼幼鱼和胚胎，其中胚胎为细胞水平上的受试生物)3个营养级的成组生物毒性试验来表征印染废水的毒性，具有全面、简单、高效、从源头控制、安全性高等优点，解决了单一生物毒性测试不有代表性的问题，可广泛应用于研究和评价有毒污染物对生态环境的影响，化学分析法及全废水毒性实验(WholeEffluent Toxicity，简称WET)都可用于评价工业废水的毒性。但单独通过化学分析法，仅仅只能得到废水中单一化合物的浓度，而不能评价有毒物质的生态效应；仅通过WET试验，只能监测废水的整体毒性，而不依靠化学分析法，很难鉴定出有毒物质。因此，就需要一种方法，这种方法可将化学分析与生物毒性试验结合起来，来评价不同工业废水的毒性。而TIE技术将这两者结合起来，可以对引起毒性的有毒物质进行定性定量分析。TIE技术因其高效、准确的诊断和严谨的科学思路被应用，从而对出水进行综合毒性的评价，为生态风险评价评价提供一定的依据。
具体实施方式
一种印染废水中成组生物毒性监测及鉴别评估方法，其步骤包括：
(1)选择受试生物：筛选明亮发光杆菌T3小种，实验室制作的发光细菌冻干粉，初始发光强度高于200万光子数的发光菌、运用实验室长期稳定培养的达到性成熟斑马鱼，按照雌雄比1:2的比例置于孵化盒中，并在黑暗条件下形成受精卵的斑马鱼幼鱼以及斑马鱼胚胎、BG11(见表1-1)液体培养基培养的小球藻作为试验对象，并建立成组生物毒性试验。
表1-1 BG11培养基成分
Table 1-1 Composition of BG11 medium
注：上述试剂均为分析纯
(2)菌悬液的配制
将4℃保存下的明亮发光杆菌冻干粉，于4℃保存的1mL 2.5％NaCl溶液中复苏3min，菌体即发光，加入于4℃保存下的9mL 3％NaCl溶液到，混匀后20℃恒温振荡20min，用3％NaCl制成所需浓度的菌悬液，使用微孔板多功能检测仪测定初始发光强度。
(3)确定最大吸收峰及小球藻初始接种浓度
参考一些研究，得到藻液的最大吸收波长为685nm，确定了藻液的初始接种吸光度应在0.06～0.07之间最为合适。
(4)对受试体生物进行染毒处理
发光菌染毒：将细胞板每一排微孔的前5个孔，各孔总体积200μL，其中菌液和试样各100μL，加入菌液15min后，然后使用微孔板型多功能检测仪测定受试样品中发光菌的发光强度。
斑马鱼幼鱼染毒：染毒试验用鱼为孵化后1小时的正常斑马鱼幼鱼。向每个培养皿中加入15mL待测溶液后，在加入10条幼鱼。每隔24h观察和记录斑马鱼幼鱼的死亡情况，并及时清除死亡的幼鱼及其代谢物。
斑马鱼胚胎染毒：选用24孔细胞培养板进行试验，每个培养板的第一列4个孔加入2mL标准稀释水作为组内空白对照，其余20个孔加入2mL待测液，然后分别放入2枚正常发育的斑马鱼胚胎，置于28±0.5℃的培养箱中。
小球藻染毒：根据取生长至对数期的藻液，用贮备的无菌培养基将其稀释至吸光度在0.06-0.07之间，即为藻测试液。取50mL藻测试液及不同浓度待测废水混合于锥形瓶中暴露120h，在每天光照期间进行摇瓶2-3次。
(5)废水毒性表征
发光菌：通过15min相对发光抑制率、EC50及TU来表征废水毒性。
斑马鱼幼鱼：以96h致死率、96h LC50及TU来表征废水毒性。
斑马鱼胚胎：废水毒性以72h-ELC50、72h-HEC50、MEC50和TU来表征，ELC50、HEC50和MEC50分别表示使斑马鱼胚胎死亡率、孵化率及畸形率达到50％时所对应的废水浓度。
小球藻：在染毒后0h、24h、48h、72h、96h及120h时，用紫外分光光度计测定不同处理组及空白对照组的藻液吸光度，根据公式计算每24h的小球藻生长抑制率，最后废水毒性以每个时间段小球藻生长抑制率、IC50及TU表示。
式中，Atn―处理组第n h测定的含藻液试样的吸光度；At0―处理组0h测定的含去离子水的藻液吸光度；Acn―对照组第n h测定的含藻液试样藻液吸光度；Ac0―对照组0h测定的去离子水的藻液吸光度。
(6)毒性单位计算
TU＝RE×0.02×100
RE是经受试废水染毒后，发光菌相对抑制发光强度、斑马鱼幼鱼和胚胎的死亡率及小球藻的生长抑制率(％)。
(7)印染废水的毒性鉴别评估
建立发光菌、斑马鱼胚胎、斑马鱼幼鱼及小球藻4种生物毒性试验的基础上，比较了采用毒性单位及AvTx、TxPr、MST及PEEP四种综合评价指标来评价印染废水毒性大小的评价方法。
本研究基于国内外相关方法研究的基础上，以印染废水为研究对象，筛选可表征水生生态系统污染程度的模式生物，并采用成组生物毒性试验，结合综合毒性评价方法对制革及印染废水进行了风险及毒性削减评估，并根据制革及印染废水污染特征及结果，结合TIE技术构建毒性鉴别评估体系。
实施例1：
(1)以发光菌，斑马鱼幼鱼，斑马鱼胚胎以及小球藻为受试体生物。
(2)以四种生物为受试体做成组生物毒性试验。
(3)配制菌悬液：将4℃保存下的明亮发光杆菌冻干粉，于4℃保存的1mL 2.5％NaCl溶液中复苏3min，菌体即发光，加入于4℃保存下的9mL 3％NaCl溶液到，混匀后20℃恒温振荡20min，用3％NaCl制成所需浓度的菌悬液，使用微孔板多功能检测仪测定初始发光强度。
(4)最大吸收峰及小球藻初始接种浓度：藻液的最大吸收波长为685nm，藻液的初始接种吸光度为0.06。
(5)对受试生物体染毒：
发光菌染毒：将细胞板每一排微孔的前5个孔，各孔总体积200μL，其中菌液和试样各100μL，加入菌液15min后，然后使用微孔板型多功能检测仪测定受试样品中发光菌的发光强度。
斑马鱼幼鱼染毒：染毒试验用鱼为孵化后1小时的正常斑马鱼幼鱼。向每个培养皿中加入15mL待测溶液后，在加入10条幼鱼。每隔24h观察和记录斑马鱼幼鱼的死亡情况，并及时清除死亡的幼鱼及其代谢物。
斑马鱼胚胎染毒：选用24孔细胞培养板进行试验，每个培养板的第一列4个孔加入2mL标准稀释水作为组内空白对照，其余20个孔加入2mL待测液，然后分别放入2枚正常发育的斑马鱼胚胎，置于28±0.5℃的培养箱中。
小球藻染毒：根据取生长至对数期的藻液，用贮备的无菌培养基将其稀释至吸光度0.06，即为藻测试液。取50mL藻测试液及不同浓度待测废水混合于锥形瓶中暴露120h，在每天光照期间进行摇瓶2-3次。
(6)废水毒性表征
发光菌：通过15min相对发光抑制率、EC50及TU来表征废水毒性。
斑马鱼幼鱼：以96h致死率、96h LC50及TU来表征废水毒性。
斑马鱼胚胎：废水毒性以72h-ELC50、72h-HEC50、MEC50和TU来表征，ELC50、HEC50和MEC50分别表示使斑马鱼胚胎死亡率、孵化率及畸形率达到50％时所对应的废水浓度。
小球藻：在染毒后0h、24h、48h、72h、96h及120h时，用紫外分光光度计测定不同处理组及空白对照组的藻液吸光度，根据公式计算每24h的小球藻生长抑制率，最后废水毒性以每个时间段小球藻生长抑制率、IC50及TU表示。
(7)毒性单位计算
TU＝RE×0.02×100
RE是经受试废水染毒后，发光菌相对抑制发光强度、斑马鱼幼鱼和胚胎的死亡率及小球藻的生长抑制率(％)。
(8)印染废水的毒性鉴别评估
建立发光菌、斑马鱼胚胎、斑马鱼幼鱼及小球藻4种生物毒性试验的基础上，比较了采用毒性单位及AvTx、TxPr、MST及PEEP四种综合评价指标来评价印染废水毒性大小的评价方法。
实施例2：
(1)以发光菌，斑马鱼幼鱼，斑马鱼胚胎以及小球藻为受试体生物。
(2)以四种生物为受试体做成组生物毒性试验。
(3)配制菌悬液：将4℃保存下的明亮发光杆菌冻干粉，于4℃保存的1mL 2.5％NaCl溶液中复苏3min，菌体即发光，加入于4℃保存下的9mL 4.5％NaCl溶液到，混匀后20℃恒温振荡20min，用3％NaCl制成所需浓度的菌悬液，使用微孔板多功能检测仪测定初始发光强度。
(4)最大吸收峰及小球藻初始接种浓度：藻液的最大吸收波长为685nm，藻液的初始接种吸光度为0.065。
(5)对受试生物体染毒：
发光菌染毒：将细胞板每一排微孔的前5个孔，各孔总体积200μL，其中菌液和试样各100μL，加入菌液10min后，然后使用微孔板型多功能检测仪测定受试样品中发光菌的发光强度。
斑马鱼幼鱼染毒：染毒试验用鱼为孵化后1小时的正常斑马鱼幼鱼。向每个培养皿中加入15mL待测溶液后，在加入10条幼鱼。每隔24h观察和记录斑马鱼幼鱼的死亡情况，并及时清除死亡的幼鱼及其代谢物。
斑马鱼胚胎染毒：选用24孔细胞培养板进行试验，每个培养板的第一列4个孔加入2mL标准稀释水作为组内空白对照，其余20个孔加入2mL待测液，然后分别放入2枚正常发育的斑马鱼胚胎，置于28±0.5℃的培养箱中。
小球藻染毒：根据取生长至对数期的藻液，用贮备的无菌培养基将其稀释至吸光度0.065，即为藻测试液。取50mL藻测试液及不同浓度待测废水混合于锥形瓶中暴露120h，在每天光照期间进行摇瓶2-3次。
(6)废水毒性表征
发光菌：通过15min相对发光抑制率、EC50及TU来表征废水毒性。
斑马鱼幼鱼：以96h致死率、96h LC50及TU来表征废水毒性。
斑马鱼胚胎：废水毒性以72h-ELC50、72h-HEC50、MEC50和TU来表征，ELC50、HEC50和MEC50分别表示使斑马鱼胚胎死亡率、孵化率及畸形率达到50％时所对应的废水浓度。
小球藻：在染毒后0h、24h、48h、72h、96h及120h时，用紫外分光光度计测定不同处理组及空白对照组的藻液吸光度，根据公式计算每24h的小球藻生长抑制率，最后废水毒性以每个时间段小球藻生长抑制率、IC50及TU表示。
(7)毒性单位计算
TU＝RE×0.02×100
RE是经受试废水染毒后，发光菌相对抑制发光强度、斑马鱼幼鱼和胚胎的死亡率及小球藻的生长抑制率(％)。
(8)印染废水的毒性鉴别评估
建立发光菌、斑马鱼胚胎、斑马鱼幼鱼及小球藻4种生物毒性试验的基础上，比较了采用毒性单位及AvTx、TxPr、MST及PEEP四种综合评价指标来评价印染废水毒性大小的评价方法。
实施例3：
(1)以发光菌，斑马鱼幼鱼，斑马鱼胚胎以及小球藻为受试体生物。
(2)以四种生物为受试体做成组生物毒性试验。
(3)配制菌悬液：将4℃保存下的明亮发光杆菌冻干粉，于4℃保存的1mL 2.5％NaCl溶液中复苏3min，菌体即发光，加入于4℃保存下的9mL 5％NaCl溶液到，混匀后20℃恒温振荡20min，用3％NaCl制成所需浓度的菌悬液，使用微孔板多功能检测仪测定初始发光强度。
(4)最大吸收峰及小球藻初始接种浓度：藻液的最大吸收波长为685nm，藻液的初始接种吸光度为0.07。
(5)对受试生物体染毒：
发光菌染毒：将细胞板每一排微孔的前5个孔，各孔总体积200μL，其中菌液和试样各100μL，加入菌液10min后，然后使用微孔板型多功能检测仪测定受试样品中发光菌的发光强度。
斑马鱼幼鱼染毒：染毒试验用鱼为孵化后1小时的正常斑马鱼幼鱼。向每个培养皿中加入15mL待测溶液后，在加入10条幼鱼。每隔24h观察和记录斑马鱼幼鱼的死亡情况，并及时清除死亡的幼鱼及其代谢物。
斑马鱼胚胎染毒：选用24孔细胞培养板进行试验，每个培养板的第一列4个孔加入2mL标准稀释水作为组内空白对照，其余20个孔加入2mL待测液，然后分别放入2枚正常发育的斑马鱼胚胎，置于28±0.5℃的培养箱中。
小球藻染毒：根据取生长至对数期的藻液，用贮备的无菌培养基将其稀释至吸光度0.07，即为藻测试液。取50mL藻测试液及不同浓度待测废水混合于锥形瓶中暴露120h，在每天光照期间进行摇瓶2-3次。
(6)废水毒性表征
发光菌：通过15min相对发光抑制率、EC50及TU来表征废水毒性。
斑马鱼幼鱼：以96h致死率、96h LC50及TU来表征废水毒性。
斑马鱼胚胎：废水毒性以72h-ELC50、72h-HEC50、MEC50和TU来表征，ELC50、HEC50和MEC50分别表示使斑马鱼胚胎死亡率、孵化率及畸形率达到50％时所对应的废水浓度。
小球藻：在染毒后0h、24h、48h、72h、96h及120h时，用紫外分光光度计测定不同处理组及空白对照组的藻液吸光度，根据公式计算每24h的小球藻生长抑制率，最后废水毒性以每个时间段小球藻生长抑制率、IC50及TU表示。
(7)毒性单位计算
TU＝RE×0.02×100
RE是经受试废水染毒后，发光菌相对抑制发光强度、斑马鱼幼鱼和胚胎的死亡率及小球藻的生长抑制率(％)。
(8)印染废水的毒性鉴别评估
建立发光菌、斑马鱼胚胎、斑马鱼幼鱼及小球藻4种生物毒性试验的基础上，比较了采用毒性单位及AvTx、TxPr、MST及PEEP四种综合评价指标来评价印染废水毒性大小的评价方法。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明的设计精神的前提下，本领域普通工程的技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种印染废水中成组生物毒性监测及鉴别评估方法，其特征在于具有如下实施步骤：
(1)选择受试生物：筛选明亮发光杆菌T3小种，实验室制作的发光细菌冻干粉，初始发光强度高于200万光子数的发光菌、运用实验室长期稳定培养的达到性成熟斑马鱼，按照雌雄比1:2的比例置于孵化盒中，并在黑暗条件下形成受精卵的斑马鱼幼鱼以及斑马鱼胚胎、BG11(见表1-1)液体培养基培养的小球藻作为试验对象，并建立成组生物毒性试验。
表1-1BG11培养基成分Table 1-1 Composition of BG 11 medium
注：上述试剂均为分析纯
(2)菌悬液的配制
将4℃保存下的明亮发光杆菌冻干粉，于4℃保存的1mL 2.5％NaCl溶液中复苏3min，菌体即发光，加入于4℃保存下的9mL 3％NaCl溶液到，混匀后20℃恒温振荡20min，用3％NaCl制成所需浓度的菌悬液，使用微孔板多功能检测仪测定初始发光强度。
(3)确定最大吸收峰及小球藻初始接种浓度
参考一些研究，得到藻液的最大吸收波长为685nm，确定了藻液的初始接种吸光度应在0.06～0.07之间最为合适。
(4)对受试体生物进行染毒处理
发光菌染毒：将细胞板每一排微孔的前5个孔，各孔总体积200μL，其中菌液和试样各100μL，加入菌液15min后，然后使用微孔板型多功能检测仪测定受试样品中发光菌的发光强度。
斑马鱼幼鱼染毒：染毒试验用鱼为孵化后1小时的正常斑马鱼幼鱼。向每个培养皿中加入15mL待测溶液后，在加入10条幼鱼。每隔24h观察和记录斑马鱼幼鱼的死亡情况，并及时清除死亡的幼鱼及其代谢物。
斑马鱼胚胎染毒：选用24孔细胞培养板进行试验，每个培养板的第一列4个孔加入2mL标准稀释水作为组内空白对照，其余20个孔加入2mL待测液，然后分别放入2枚正常发育的斑马鱼胚胎，置于28±0.5℃的培养箱中。
小球藻染毒：根据取生长至对数期的藻液，用贮备的无菌培养基将其稀释至吸光度在0.06-0.07之间，即为藻测试液。取50mL藻测试液及不同浓度待测废水混合于锥形瓶中暴露120h，在每天光照期间进行摇瓶2-3次。
(5)废水毒性表征
发光菌：通过15min相对发光抑制率、EC50及TU来表征废水毒性。
斑马鱼幼鱼：以96h致死率、96h LC50及TU来表征废水毒性。
斑马鱼胚胎：废水毒性以72h-ELC50、72h-HEC50、MEC50和TU来表征，ELC50、HEC50和MEC50分别表示使斑马鱼胚胎死亡率、孵化率及畸形率达到50％时所对应的废水浓度。
小球藻：在染毒后0h、24h、48h、72h、96h及120h时，用紫外分光光度计测定不同处理组及空白对照组的藻液吸光度，根据公式计算每24h的小球藻生长抑制率，最后废水毒性以每个时间段小球藻生长抑制率、IC50及TU表示。
式中，Atn―处理组第n h测定的含藻液试样的吸光度；At0―处理组0h测定的含去离子水的藻液吸光度；Acn―对照组第n h测定的含藻液试样藻液吸光度；Ac0―对照组0h测定的去离子水的藻液吸光度。
(6)毒性单位计算
<mrow>
<mi>T</mi>
<mi>U</mi>
<mo>=</mo>
<mfrac>
<mrow>
<mn>100</mn>
<mi>%</mi>
</mrow>
<mrow>
<msub>
<mi>LC</mi>
<mn>50</mn>
</msub>
<mrow>
<mo>(</mo>
<msub>
<mi>EC</mi>
<mn>50</mn>
</msub>
<mo>,</mo>
<msub>
<mi>IC</mi>
<mn>50</mn>
</msub>
<mo>)</mo>
</mrow>
</mrow>
</mfrac>
</mrow>
TU＝RE×0.02×100
RE是经受试废水染毒后，发光菌相对抑制发光强度、斑马鱼幼鱼和胚胎的死亡率及小球藻的生长抑制率(％)。
(7)印染废水的毒性鉴别评估
建立发光菌、斑马鱼胚胎、斑马鱼幼鱼及小球藻4种生物毒性试验的基础上，比较了采用毒性单位及AvTx、TxPr、MST及PEEP四种综合评价指标来评价印染废水毒性大小的评价方法。
2.根据权利要求1所述的一种印染废水中成组生物毒性监测及鉴别评估方法，其特征在于：本研究基于国内外相关方法研究的基础上，以印染废水为研究对象，筛选可表征水生生态系统污染程度的模式生物，并采用成组生物毒性试验，结合综合毒性评价方法对制革及印染废水进行了风险及毒性削减评估，并根据制革及印染废水污染特征及结果，结合TIE技术构建毒性鉴别评估体系。
3.根据权利要求1所述的一种印染废水中成组生物毒性监测及鉴别评估方法，其特征在于：化学分析法及全废水毒性实验(Whole Effluent Toxicity，简称WET)都可用于评价工业废水的毒性。但单独通过化学分析法，仅仅只能得到废水中单一化合物的浓度，而不能评价有毒物质的生态效应；仅通过WET试验，只能监测废水的整体毒性，而不依靠化学分析法，很难鉴定出有毒物质。因此，就需要一种方法，这种方法可将化学分析与生物毒性试验结合起来，来评价不同工业废水的毒性。而TIE技术将这两者结合起来，可以对引起毒性的有毒物质进行定性定量分析。TIE技术因其高效、准确的诊断和严谨的科学思路被应用。
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