CN102213721A - 一种发光菌毒性测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于环境污染检测技术领域，公开了一种发光菌毒性的测定方法，该方法包括以下步骤：1)菌种活化：将明亮发光杆菌的冻干粉溶解，接种到斜面上传代3次后可用；2)菌种的培养：将传代好的菌种用接种环接种到液体培养基，20℃，180rpm培养12h；3)菌液的平衡：移取适量菌液到20mL3％ NaCl溶液中，控制光值测定范围在50-500万之间，20℃条件下搅拌40min；4)加样及发光强度检测：将搅拌了40min的菌液用连续进样器加入200μL到800μL的3％ NaCl空白及800μL浓度梯度的3％ NaCl污染液，加样后立即在旋涡混匀器上混匀2min，20℃条件下，静置15min后将样品管置入荧光检测器中测定发光强度；5)双交错对照法计算样品对发光强度的抑制率。本发明方法具有便捷、精度高的特点。

Description

一种发光菌毒性测定方法
技术领域
本发明属于环境污染检测技术领域，具体涉及一种发光菌毒性的测定方法。
背景技术
随着人们对生活质量和环境质量要求的提高，对环境中的污染物也日益关注。由于环境中污染物大都具有低浓度、复合型等特点。因此，以往仪器的灵敏度不高导致很多低浓度的污染物被忽略，而其中包含某些毒性较强的污染物。以POPs(Persistent Organic Pollutants)为例，它是一类具有长期残留性、生物累积性、半挥发性和高毒性的有机污染物。然而它具有低水溶性、高脂溶性的特点，如监测仪器灵敏度不高则该类物质在水体中不易被检测。因此，为了适应新时期人们对环境质量的要求，需要建立更灵敏、准确的检测方法对污染物实施监测，为制定更合理的环境保护政策提供科学依据。
目前已有许多其他生物学方法应用于环境毒性的检测，如浮游生物、鱼类、藻类等。但这些方法均存在着周期长，操作繁琐等缺陷。发光菌属于革兰氏阴性菌，一定条件下其发光强度是恒定的。与外界污染物接触后，发光强度与污染物毒性大小呈线性关系(Curtis C，Lima A，Lozano S，Veith G(1982) Evaluation of a bacterial bioluminescence bioassay as a method for predicting acute toxicity of orga
1)实验结果重现性差  检测方法存在细胞发光强度本底差异大、检测期间发光变化幅度宽等缺陷，导致实验结果的重现性大约在±13％～±26％之间(Curtis，1982)。DuktaB J等(Dukta B J，K wan K K，1981)采用MICROTOX仪测定五氯酚钠的毒性，也发现明亮发光杆菌毒性实验再现性欠佳的现象。而毒性测定数据是环境中污染物毒性的判定指标，具有重要的指示作用。
2)检测限太窄  现阶段，国内大部分科研机构及环境监测站点使用的监测及测定仪器为中科院南京土壤所开发的DXY-2型荧光检测器，该仪器研制于上世纪90年代，灵敏度欠佳，对于低浓度的污染物对发光菌的毒性影响检测能力有限。
发明内容
本发明的目的是提供一种发光菌毒性的测定方法，该方法采用免疫荧光检测技术，创造性建立“双交错对照法”对发光菌毒性进行测定。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种发光菌毒性的测定方法，该方法包括以下步骤：
1)菌种活化：将明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)的冻干粉溶解，接种到斜面上传代3次后可用；
2)菌种的培养：将传代好的菌种用接种环接种到液体培养基，20℃，180rpm培养12h；
3)菌液的平衡：移取200μL菌液到20mL3％ NaCl溶液中，控制光值测定范围在50-500万之间，20℃条件下搅拌40min；
4)加样及发光强度检测  将搅拌了40min的菌液用连续进样器加入200μL到800μL的3％ NaCl空白及800μL浓度梯度的3％ NaCl污染液，加样后立即在旋涡混匀器上混匀2min，20℃条件下，静置15min后将样品管置入荧光检测器中测定发光强度；
5)采用双交错对照法计算样品对发光强度的抑制率
抑制率(％)＝100％×(对照抑制率-样品抑制率)/对照抑制率。
所述的对照抑制率指的是样品前后的空白平均抑制率，即双交错对照法。
所述的光值测定范围优选为100-300万。
所述的液体培养基成分为：胰蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，甘油0.3％，KH2PO4 0.1％，Na2HPO4 0.5％，NaCl 3％，琼脂2％，pH7.0。
操作原则：采取间隔设置空白的方法，避免由于菌体测定过程中发光强度的变化导致的测定误差。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
1、本发明方法测定的发光菌毒性结果数据稳定、重现性好；同时由于采用了最新的荧光检测仪器，检出限范围比原有技术更广。
2、本发明方法可准确地测定水体中的有机化合物、农药、呼吸抑制剂等污染物的水质毒性，从而对生活用水及采矿、冶炼、印染等各类工业废水进行有效监测。
3、本发明方法具有便捷、精度高的特点，因此，本发明方法可很好地应用于污染区域的环境生态风险评价。
4、本发明方法同采用动物、植物毒性测定方法(周期长、费用高)相比，在建立和完善污染物毒性数据库方面，具有耗时短、费用低廉、灵敏度高的特点。
5、本发明方法可简便、灵敏地对环境中污染物进行监测。
6、本发明方法可对污染物进行有效筛选及生态毒理进行准确评价。
附图说明
图1表示样品设置示意图。
图2表示采用直线法对测定结果拟合得到EC50 1标准曲线。
图3表示采用直线法对测定结果拟合得到EC50 2标准曲线。
图4表示采用直线法对测定结果拟合得到EC50 3标准曲线。
具体实施方式
以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。
所用仪器：生化培养箱、摇床、旋涡振荡器、空调。
所用菌种：明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)冻干粉，购自中科院南京土壤所。
液体培养基配方：胰蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，甘油0.3％，KH2PO4 0.1％，Na2HPO4 0.5％，NaCl 3％，琼脂2％，pH7.0。
实施步骤：
1)取冷藏的发光菌冻干粉，置冰浴中，加入0.5ml冷的3％ NaCl溶液，充分摇匀，复苏2min，使菌液具有微微绿光，无菌操作，将菌液迅速转入50ml培养液中，20℃恒温培养，每24h后转接一次斜面，将培养好的第三代斜面置4℃冰箱中备用。
2)将传代好的菌种用接种环接种到液体培养基，20℃，180rpm培养12h。
3)移取200μL菌液到20mL3％ NaCl溶液中，控制光值大约300万，20℃条件下搅拌40min。
4)将搅拌了40min的菌液用连续进样器加入200μL到800μL的3％ NaCl(空白)及800μL浓度梯度的3％ NaCl污染液。加样后立即在旋涡混匀器上混匀2min。20℃条件下，静置15min后将样品管置入荧光检测器中测定发光强度(默认参数)。
5)双交错对照法：
所谓双交错对照法，是针对在传统的发光菌毒性测定方法中，由于外界条件的改变对发光菌的荧光值影响偏大，导致发光菌毒性测定结果的可重现性差的缺陷而专门设计的一种方法。具体操作为：在空白组(即不加污染物，添加相应体积的3％NaCl)后的每个样品组必须同时设置一组空白对照组(图1为样品设置示意图。)。
对于浓度
Figure BDA0000054703380000031
Figure BDA0000054703380000041
(式1)
对于浓度
Figure BDA0000054703380000042
Figure BDA0000054703380000043
(式2)
对于浓度
Figure BDA0000054703380000045
(式3)
其它浓度以此类推，所以，对于浓度C1，其对
Figure BDA0000054703380000046
通常用发光细菌光抑制50％的受试化合物浓度来表征其毒性效应(EC50)，将计算的抑制率与受试化合物的浓度进行回归分析，根据所得回归方程可求出相应的EC值。
实施例
测定丙酮对发光菌的毒性
由于丙酮具有挥发性，研究表明该物质的生物毒性数据稳定性不佳。采用本方法，用3％NaCl配置0.034、0.061、0.872、0.109、0.195、0.347mol/L的丙酮溶液按上述方法加入到测定体系，每个浓度梯度设3组平行，每组重复测定3次。
A)第一次试验结果及抑制率列于表1中。
表1
  试验组   发光值   抑制率(％)   平均抑制率
  空白   3346754
  0.034mol/L   3027646   9.374979
  空白   3334946   7.704
  0.034mol/L   3130054   6.033632
  空白   3447466
  0.061mol/L   2799357   18.9069
  空白   3456591   18.306
  0.061mol/L   2845577   17.70553
  空白   3327127
  0.872mol/L   2665007   22.01844
  空白   3507840   22.245
  0.872mol/L   2696191   22.47096
  空白   3459006
  0.109mol/L   2078887   39.45795
  空白   3408574   39.374
  0.109mol/L   2072061   39.29012
  空白  3417534
  0.195mol/L  942451   72.55997
  空白  3451636   72.854
  0.195mol/L  925949   73.14798
  空白  3445044
  0.347mol/L  304021   91.209
  空白  3471601   90.982
  0.347mol/L  323963   90.75594
  空白  3537507
采用直线法对测定结果拟合得到标准曲线，如图2所示。
图2中，横坐标为丙酮浓度(mol/L)的负对数(-log C)，纵坐标为双交错法计算的发光抑制率，R2(相关系数)表明两者有很好的线性关系，经计算，丙酮EC50 1＝0.1292mol/L。
B)第二次试验结果及抑制率列于表2中。
表2
  试验组   发光值   抑制率(％)   平均抑制率
  空白   3203491
  0.034mol/L   3042741   2.995365
  空白   3069902   2.575317
  0.034mol/L   3071191   2.15527
  空白   3207781
  0.061mol/L   2801318   12.06007
  空白   3163200   9.483176
  0.061mol/L   2911360   6.906278
  空白   3091486
  0.872mol/L   2225588   29.15656
  空白   3191631   28.17715
  0.872mol/L   2302355   27.19774
  空白   3133324
  0.109mol/L   1784127   43.29459
  空白   3159293   42.17499
  0.109mol/L   1857527   41.05539
  空白   3143326
  0.195mol/L   881938.2   72.31279
  空白   3227401   73.11049
  0.195mol/L   870614.2   73.9082
  空白   3446068
  0.347mol/L   350994.6   89.46816
  空白   3219333   90.08334
  0.347mol/L   301883.4   90.69852
  空白   3271751
对测定体系中丙酮实际浓度(即原始浓度×80％)取对数，利用直线法得到标准曲线后求解EC50 2，如图3所示。
经计算，丙酮EC50 2＝0.1306mol/L；
C)第三次试验结果及抑制率列于表3中。
表3
  试验组   发光值   抑制率(％)   平均抑制率
  空白   3023736
  0.034mol/L   2960320   3.928479
  空白   3139006   4.626777
  0.034mol/L   2959087   5.325076
  空白   3112041
  0.061mol/L   2593377   16.59813
  空白   3106949   15.9077
  0.061mol/L   2649111   15.21727
  空白   3142227
  0.872mol/L   2364086   23.473
  空白   3036209   22.4928
  0.872mol/L   2393759   21.5126
  空白   3063519
  0.109mol/L   1873450   39.57002
  空白   3136880   37.49363
  0.109mol/L   2029814   35.41724
  空白   3149051
  0.195mol/L   1008817   68.08814
  空白   3173469   68.3487
  0.195mol/L   1003177   68.60927
  空白   3218081
  0.347mol/L   331616   89.5206
  空白   3110833   89.27762
  0.347mol/L   344426   89.03465
  空白   3171244
对测定体系结果直线拟合，得到计算曲线如图4所示。
经计算，丙酮EC50 3＝0.1368mol/L；
将上述丙酮EC50与文献值(董玉瑛，等.化工学报.2006，57(3)：636-639)，结果如表4所示。
表4
Figure BDA0000054703380000061
由表4可知，采用本专利测定的结果与文献报道值差别非常小，其RSD仅为0.034；另外一方面，三组测定数据间其差异也非常小，其RSD仅为0.031；由此可知，本发明所建立的方法稳定、可靠，其可能原因1)本发明采用的检测仪器先进；2)双交错法试验设计与计算增加了实验的稳定性；因而，本发明在环境领域的科研、污染物监测、检疫等部门有较好的应用前景。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种发光菌毒性的测定方法，其特征在于：该方法包括以下步骤，
1)菌种活化：将明亮发光杆菌的冻干粉溶解，接种到斜面上传代3次后可用；
2)菌种的培养：将传代好的菌种用接种环接种到液体培养基，20℃，180rpm培养12h；
3)菌液的平衡：移取适量菌液到20mL3％ NaCl溶液中，控制光值测定范围在50-500万之间，20℃条件下搅拌40min；
4)加样及发光强度检测：将搅拌了40min的菌液用连续进样器加入200μL到800μL的3％ NaCl空白及800μL浓度梯度的3％ NaCl污染液，加样后立即在旋涡混匀器上混匀2min，20℃条件下，静置15min后将样品管置入荧光检测器中测定发光强度；
5)采用双交错对照法计算样品对发光强度的抑制率：
抑制率(％)＝100％×(对照抑制率-样品抑制率)/对照抑制率。
2.根据权利要求1所述的发光菌毒性的测定方法，其特征在于：所述的对照抑制率指的是样品前后的空白平均抑制率，即双交错对照法。
3.根据权利要求1所述的发光菌毒性的测定方法，其特征在于：所述的光值测定范围为100-300万。
4.根据权利要求1所述的发光菌毒性的测定方法，其特征在于：所述的液体培养基成分为：胰蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，甘油0.3％，KH2PO4 0.1％，Na2HPO4 0.5％，NaCl 3％，琼脂2％，pH7.0。
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