CN101915759A - 基于青海弧菌q67的环境污染物长期微板毒性分析法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于青海弧菌Q67的环境污染物长期微板毒性分析法，本发明在微板毒性分析法基础上，以青海弧菌Q67为受试生物，在传统化合物毒性浓度-效应关系中引入时间因素，建立了长期微板毒性分析法，该方法特点在于采用特殊的微板设计与加样方案、适宜青海弧菌生长的微板培养基，测定环境污染物对青海弧菌的长期毒性效应，并且多板重复测定同一污染物的毒性，确保实验结果的统计学显著性。经测定部分环境污染物对青海弧菌的长期毒性，与短期毒性对比，发现测试污染物的长期毒性显著性高于其短期毒性，其中以抗生素的短、长期毒性差异最为显著，能实际反映对化合物有特异性作用位点化合物的毒性，可以更为合理的评价污染物的毒性。
Description
技术领域
本发明涉及环境污染物毒性检测领域，具体地说，涉及一种检测环境污染物对青海弧菌Q67的长期毒性分析方法。
背景技术
随着现代工业的不断发展，环境污染日趋严重，其中以化学品的污染尤为突出。水体环境是各类污染物最终汇集地点，大量具有不良生态效应化学品的介入，影响水体的正常功能，严重破坏了生态平衡，也直接或间接地威胁人类的健康。为了保护水资源和水生生态系统，控制污染，必须对水环境中污染物进行监督和评价，并由此建立基于化学分析和生物检测的水质评判标准。
化学分析法可对水环境中污染物进行定性与定量分析，却不能直接反映污染物对环境和生物的影响(Lee，C.M.，Allen，H.E.The ecological risk assessment of copper differs from that ofhydrophobic organic chemicals.Hum Ecol Risk Assess[J]；1998；4：605-617)。污染物对生物体的毒性，并非完全取决于其环境含量，一些变化的环境因素如pH值、氧化还原状态等在很大程度上影响污染物生物效应。化学分析数据并不能从整体上反映水质的优劣，或反映污染物对生物体和生态系统的影响。
生物毒性测试法可以弥补化学分析法在评价污染物毒性中的不足之处。生物评价标准中规定利用敏感生物测试污染物的毒性效应，化学品急性毒性测试中常用的受试生物有藻类、水蚤、鱼类、小鼠等。这些评价体系的不足之处是实验周期长、操作复杂，不宜用做常规检测。针对上述生物毒性评价体系的不足，以发光细菌为受试生物的毒性测试法，因快速、简便、灵敏、稳定、经济而受到关注。大量实验表明，发光细菌毒性实验与鱼类毒性实验对化合物毒性评价上有良好的相关性(黄正，王家玲.发光细菌的生理特性及其在环境监测中的应用.环境科学[J]；1995；16：87-90)。
青海弧菌Q67(vibrio qinghaiensis sp.-Q67)属于淡水发光细菌，从青海湖裸鲤体内分离得到(马梅，童中华，王子健，杨笃才，朱文杰.新型淡水发光菌(vibrio qinghaiensis sp.-Q67)应用于环境样品毒性测试的初步研究.环境科学学报[J]；1998；18：86-91)。它属革兰氏阴性、兼性厌氧菌，最适生长温度20～30℃，最适生长pH为6.0～9.0。
国内许多研究采用青海弧菌Q67作为污染物毒性测试的受试生物。如利用青海弧菌Q67测定天然水体中不同形态的铜的毒性作用(黄圣彪，王子健.天然水体中铜的形态及其对Q67淡水发光菌的毒性作用.环境科学研究[J]；2003；16：43-46)，研究2-氯酚、2，4-二氯酚和2，3，4-三氯酚及其混合物发光抑制毒性(刘征涛，李兆利，李政.氯酚类化合物对淡水发光菌Q67的联合毒性.环境科学研究[J]；2008；21：115-119)，测试水中砷铬铅镉汞的急性毒性(周世明，赵清，舒为群.青海弧菌Q67新鲜培养菌液测试水中砷铬铅镉汞的急性毒性.预防医学情报杂志[J]；2008；24：403-406)。
此前发光细菌毒性测试多采用比色管法，测试仪器不能同时测定大量平行样品，而且试液用量大，浪费昂贵的化学试剂，污染环境。因此，刘保奇等以多功能酶标仪为检测仪器，建立了基于96孔板的微板毒性分析法，暴露时间为15分钟(刘保奇，葛会林，刘树深.测定环境污染物对青海弧菌发光强度抑制的微板发光法研究.生态毒理学报[J]；2006；1：186-191)。微板毒性分析法能多次平行测定样品毒性，使之具有统计有效性。利用这一测试体系，研究了有大批化合物及其混合物的毒性，包括酚类化合物(莫凌云，刘海玲，刘树深，张天生，刘保奇，葛会林.5种取代酚化合物对淡水发光菌的联合毒性.生态毒理学报[J]；2006；1：259-264)、苯胺类化合物(葛会林，刘树深，刘芳.多组分苯胺类混合物对发光菌的抑制毒性.生态毒理学报[J]；2006；1：295-302)、水溶性有机溶剂(刘树深，刘芳，刘海玲.20种水溶性有机溶剂对发光菌的毒性效应.中国环境科学[J]；2008；27：371-376)、苯酚与苯胺衍生物(莫凌云，刘树深，刘海玲.苯酚与苯胺衍生物对发光菌的联合毒性.中国环境科学[J]；2008；28：334-339)、硝基苯衍生物(肖菊，刘树深，高音旋，张亚雷.均匀设计用于研究硝基苯衍生物对青海弧菌Q67的联合毒性.环境科学研究[J]；2008；21：120-124)等，获得了大量化合物毒性的浓度-效应毒性信息。上述研究表明，微板毒性分析测试法具有操作简单、灵敏度高、重复性好及环境友好等优点。
1995年，国家环保部颁布的测定水质急性毒性的发光细菌法国家标准中，规定的污染物暴露时间为15分钟国家环保部(GB/T 15441-1995水质急性毒性的测定发光细菌法[S]；1995)。短期微板毒性分析法中设定了暴露时间也是15分钟。然而，人类活动产生的污染物持续不断的进入环境，这些具有持久性及生物富集性的污染物，对生态环境和生物体会产生长期持久的危害。因此，污染物毒性的检测不仅要关注其短期效应，也应该着眼于它们的长期效应。
大量研究报道，短期毒性测试会低估具有特定作用机制化合物的毒性(Newman，M.C.，McCloskey，J.T.Time-to-event analyses of ecotoxicity data.Ecotoxicology[J]；1996；5：187-196)。1997年，Backhaus等研究了化学品对海洋发光菌费氏弧菌的24小时的毒性，与欧盟规定化学品毒性标准测试毒性法(测试时间为30分钟)相比，发现抗生素类化学品的毒性显著性增加，其中氯霉素和四环素对费氏弧菌的毒性分别增加1135倍和825倍(Backhaus，T.，Froehner，K.，Altenburger，R.，Grimme，L.H.Toxicity testing with Vibrio fischeri：A comparison between thelong term(24h)and the short term(30min)bioassay.Chemosphere[J]；1997；35：2925-2938)。此后，Backhaus进一步研究了抑制蛋白质合成、细胞壁合成、叶酸合成及DNA转录过程的几类抗生素的24小时长期毒性，发现费氏弧菌对抑制蛋白质合成、DNA转录过程的抗生素的敏感性最强。如萘啶酸对费氏弧菌几乎没有短期毒性，而24h后的长期毒性的EC50却达到0.21mg/L(Backhaus，T.，Grimme，L.H.The toxicity of antibiotic agents to the luminescentbacterium Vibrio fischeri.Chemosphere[J]；1999；38：3291-3301)。Froehner等人研究也表明，该长期毒性分析法更适合检测对费氏弧菌具有特定作用位点的化学品的毒性，例如抗生素(Froehner，K.，Backhaus，T.，Grimme，L.H.Bioassays with Vibrio fischeri for the assessment ofdelayed toxicity.Chemosphere[J]；2000；40：821-828)。
上述以海洋发光细菌费氏弧菌为受试生物的研究表明，发光细菌短期毒性测试法会低估抗生素类物质的毒性，延长测试时间可以合理的评估具有特定作用机制的化合物的生态毒性。然而，对于淡水中水体污染物毒性测试尚无相对应的基于发光菌的长期毒性测试方法。为此，本方法用青海弧菌Q67为测试菌株，在其短期毒性测试方法的基础上建立长期微板毒性分析方法。建立基于青海弧菌Q67的环境污染物长期微板毒性分析法，能有助于全面的了解污染物的毒性效应，能更深入的了解污染物的毒理作用机制与途径，更能体现实际环境中污染物暴露的现象和信息。
文献检索结果表明：在本发明之前，未发现以青海弧菌Q67为受试生物检测环境污染物长期毒性方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对传统污染物发光细菌毒性检测方法的不足及环境中新兴污染物浓度低、作用时间长等特点，在传统短期性毒性检测方法基础上强调时间因素对毒性的影响，建立一种基于青海弧菌Q67的环境污染物长期微板毒性分析法，该法可以有效地检测在环境中含量低、存在时间长且对受试生物有特定作用位点的污染物的毒性。
为解决上述技术问题，采用的技术方案如下：
一种基于青海弧菌Q67的环境污染物长期微板毒性分析法，包括以下步骤：
(1)青海弧菌Q67普通培养基配制与培养：
分别称取KH2PO4 27.2mg，Na2HPO4·12H2O 71.6mg，MgSO4·7H2O 0.5g，MgCl2·6H2O 1.22g，CaCl2 66.0mg，NaHCO3 2.68g，NaCl 3.08g，酵母浸出膏5.0g，胰蛋白胨5.0g，甘油3.0g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，用1mol/L NaOH调节pH值至8.5±0.5，按照常规灭菌操作于121℃下高压蒸汽灭菌20min，即得青海弧菌Q67普通培养基，冷却后使用或放置于4℃冰箱保存备用。以上培养基中所有成分均可在市场(如上海国药集团化学试剂有限公司)购买得到。
(2)青海弧菌Q67的固体平板培养基配制：
取步骤(1)所得普通培养基100mL，加入1.5～2.0g琼脂，加热使溶解至透明，按照常规灭菌操作经121℃高压蒸汽灭菌20min，取出后在无菌操作条件下趁热倒入平板中，每块平板含前述溶液9～11ml，冷却后使用或保存于4℃冰箱备用，即得青海弧菌Q67固体平板培养基。
(3)青海弧菌Q67菌种的配制与培养：
取出-20℃保存的青海弧菌典型菌株Q67冷冻干粉100mg(该菌株购自华东师范大学，100mg/瓶)，用0.2mL 0.8％NaCl(质量百分比浓度)溶液溶解，转接到一块步骤(2)所得固体平板培养基上，22±1℃培养48小时长出菌落后，挑取小米粒大小菌落，接种到50mL步骤(1)所得普通培养基中，将所得菌液置于振荡培养箱，振荡转速为每分钟120转，温度保22±1℃，培养至100μL菌液的相对发光单位达到30万以上，此时青海弧菌Q67生长进入对数生长期，即得青海弧菌Q67菌种。
根据此前实验或参考论文中青海弧菌Q67生长曲线(葛会林.预测部分有机污染物对淡水发光菌的联合毒性.材料与化学工程系[T]；2006；硕士学位论文：78)，100μL菌液的相对发光单位首次达到30万以上即可认为细菌生长进入对数生长期。因此，在上述菌种培养过程中，通过在SpectraMax M5酶标仪中测定100μL菌液的相对发光单位，当相对发光单位首次达到30万以上时，即说明青海弧菌Q67进入对数生长期，达到对数生长期时间一般需14小时。只有处于对数生长期的发光菌且相对发光单位达到30万以上时，青海弧菌Q67方可用于污染物毒性测定实验或为长期微板毒性分析法提供菌种。若青海弧菌Q67生长超过对数生长期，则细菌会进入衰亡期，各种生理、生化代谢活动将不稳定。此时，即使100μL菌液的相对发光单位达到30万以上也不使用。
(4)青海弧菌Q67微板培养基的配制：
分别称取KH2PO4 27.2mg，Na2HPO4·12H2O 71.6mg，MgSO4·7H2O 0.5g，MgCl2·6H2O 1.22g，CaCl2 66.0mg，NaHCO3 2.68g，NaCl 3.08g，酵母浸出膏8.78g，胰蛋白胨6.63g，甘油6.90g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，利用1mol/L NaOH调节pH值至8.5±0.5，按照常规灭菌操作于121℃下高压蒸汽灭菌20min，即得青海弧菌Q67微板培养基，冷却后使用或于4℃冰箱保存备用。
长期微板毒性分析法首先要保证青海弧菌Q67在微板中正常生长的营养条件，然而普通培养基无法提供青海弧菌Q67在微板上长期生长所需的营养浓度。因此，需专门对普通培养基采用合适的方法进行优化，使其能够适应青海弧菌Q67在微板上生长的营养需求。发明人利用均匀设计实验方法及多元线性回归对影响微板中青海弧菌生长的三个因素：酵母浸出膏、胰蛋白胨、甘油进行优化，得到上述青海弧菌Q67微板培养基。经测定，该微板培养基可支持青海弧菌Q67在微板上至少12小时正常生长，青海弧菌Q67在微板上12个小时内生长发光曲线如图1所示，图中数据点及误差棒分别表示微板上60个微孔中细菌相对发光强度平均值及标准偏差。微板上Q67相对发光强度前30分钟稍微增长，随后不断降低，至第180分钟达到最低点，随后相对发光强度不断增加，表明青海弧菌Q67进入对数生长期。由图1可知，微板上各微孔中的青海弧菌Q67的相对发光强度在12小时培养时间内呈现出良好的稳定性与均匀性。因此，可以将污染物毒性测定时间设置在12小时以内。而将长期微板毒性分析法污染物毒性测定时间长度设定为12小时最佳。
(5)微板加样菌液的配制：
将步骤(3)所得的菌种与步骤(4)所得的微板培养基混合均匀，使100μL前述混合液的相对发光强度达到0.8×105～1.2×105相对发光单位，即得微板加样菌液。当混合液(即微板加样菌液)的相对发光强度达到1.0×105相对发光单位时效果更好。
进一步，步骤(3)所得的菌种与步骤(4)所得的微板培养基之间的体积比是1∶5～1∶3。当体积比为1∶4时发明效果更好。
以1∶4比例混合方式为例，说明混合步骤：取4℃冰箱中保存的微板培养基放置于常温下30分钟或更长时间，使微板培养基恢复至常温；利用1mL移液器吸取8mL步骤(4)所得微板培养基于加样槽中，然后再移入2mL步骤(3)所得菌种，利用移液器吹打混合液，使其混合均匀；然后测定100μL混合液的相对发光单位，即可。
(6)微板加样受试样品溶液浓度设计：
污染物的实验浓度梯度设计方案、测试污染物浓度数量根据不同检测的要求变化。等比浓度稀释方案可以检测更大范围内污染物的毒性效应。因此，本发明以等比浓度稀释方案为例，说明微板中样品浓度设计。本发明采用等比浓度稀释方法设计12个微板加样受试样品溶液浓度，具体采用下列公式n＝1，2，L 12.确定受试样品溶液的12个浓度梯度。
其中，c0为样品储备液浓度；cn为第n个梯度的受试样品溶液浓度。根据下列条件确定最高受试样品溶液浓度和稀释因子
：通过预实验确定最高受试样品溶液浓度下的样品溶液对微板上青海弧菌Q67发光强度的长期抑制率须达到50％以上(即最高抑制率)，最低受试样品溶液浓度下的样品溶液对微板上青海弧菌Q67发光强度的长期抑制率为-5％～+5％(即最低抑制率)；此时，根据最高抑制率时的效应浓度(CH，)与最低抑制率时的效应浓度(CL)以及需要测试的浓度梯度个数n，可以根据下面公式计算得到稀释因子：
例如，若CL＝2.290×10-5mol/L，CH＝4.586×10-3mol/L，设计12个浓度梯度(n＝12)，即采用0.618的稀释因子稀释样品溶液。
一般要求最高浓度样品溶液对微板上青海弧菌Q67发光强度的长期抑制率须达到50％以上。此外，污染物的实验浓度梯度设计方案以及测试浓度数量n均可根据不同检测的要求而变化。
(7)微板加样与培养：
取96孔微板，在微板周边的36个微孔中加入200μL蒸馏水。因为长期微板毒性分析法要求青海弧菌Q67长期在微板中生长，因而需要充分考虑此生长过程中各因素的影响，保证实验数据的精密度与统计学显著性。微板周边孔水分蒸发速度快于微板上其它微孔，若长时间放置会导致Q67发光强度异常，产生边缘效应。因此，为避免边缘效应，本发明采取独特的微板设计，将不使用96孔微板周边的36个微孔，而是加入200μL蒸馏水，这样可平衡微板与板盖间狭小空隙内的湿度，延缓其它微孔中水分蒸发速度。
在剩余的微孔中随机选取36个微孔作为加样孔，每3个微孔作为同一受试样品溶液浓度测定的3个平行组，则可以测定12组不同浓度的受试样品(即污染物)毒性数据；剩下的微孔则作为空白对照液孔。根据如上微孔位置设计，在加样孔中先加入由步骤(6)所制得的受试样品溶液100μL，随后在前述加样孔中再加入由步骤(5)所制得的100μL微板加样菌液。每个浓度的受试样品溶液平行加样3次。空白对照孔测定没有受试样品(即污染物)作用下细菌生长的状况，因此加入100μL蒸馏水代替100μL受试样品溶液，随后再加入100μL微板加样菌液。加样完成后，将微板在22±1℃培养12小时后，在SpectraMax M5酶标仪(美国分子仪器公司)上测定相对发光强度。
为使检测结果具有统计意义，同一受试样品的毒性测定要至少3块微板的青海弧菌Q67发光抑制实验。
(8)数据处理：
根据公式(对照组-处理组)/处理组(即对照组相对发光强度的平均值减去处理组相对发光强度的平均值之后与处理组相对发光强度的平均值的比值)计算浓度-效应数据，其中：处理组为每一受试样品浓度的3个平行微孔测试所得相对发光强度的平均值，对照组为所有空白对照液孔测试所得相对发光强度的平均值。从而得到12组受试样品的浓度-效应数据，对该浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到浓度-效应函数关系，利用反函数可进而计算不同效应值对应的受试样品浓度值即效应浓度，如半数效应浓度(EC50)。进一步，参照函数拟合的确定系数，以拟合值与实验值相关性最大，也就是拟合值与实际测试值均方根误差最小者为最优函数关系。
例如，在SpectraMax M5酶标仪测定数据为青海弧菌的相对发光单位。对于同一块微板数据可在excel中处理，将每一浓度梯度的3个平行测试值取平均值，得到平均后的12个处理组相对发光强度。随后，对所有24个空白对照液孔的发光强度取平均值得对照组发光强度。按(对照组-处理组)/处理组方法计算其抑制效应，对应产生该抑制效应的受试样品浓度，可得到该受试样品的浓度-效应数据，对于同一受试样品3板重复，可以得到3组原始实验数据。将3板原始实验数据在APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中处理，可以得到浓度-效应数据，上述数据也可在Excel或其它数据处理软件中完成。通过以上方法得到受试样品的浓度-效应数据后，采用APTox软件中内置回归模型(Weibull或Logit函数)对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，参照确定系数，选择拟合值与试验观测值均方根误差最小者为最优模型。浓度-效应数据的非线性最小二乘拟合也可以在商业化软件Origin或Matlab中进行。根据选定函数参数的拟合值，利用反函数可进而计算不同浓度下的效应值，如半数效应浓度(EC50)。以上方法均在APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中完成，也可在Excel或其它数据处理软件中进行。
利用上述长期微板毒性分析法测定了部分杀虫剂、除草剂及抗生素的长期毒性与时间依赖性毒性。与常规15分钟短期微板毒性分析法测定数据对比，发现抗生素如氯霉素与盐酸四环素的短、长期毒性EC50之比分别为9.67与154.38，硫酸链霉素与硫酸巴龙霉素各自短、长期毒性EC50差异更大。由此可见，常规的短期微板毒性分析法在测定某些化合物的毒性方面存在很多局限之处，如果将长期微板毒性分析法与短期微板毒性分析法结合，则可以更为合理的评价污染物的毒性。
附图说明
图1为青海弧菌Q67在微板上12小时内的生长发光曲线。
图2为本发明用微板加样设计图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步详细说明本发明。
以下通过实施例和附图进一步说明本发明。
【实施例1】用本发明毒性分析法进行威尔伯长期毒性测定，包括以下步骤：
(1)青海弧菌Q67普通培养基配制与培养：
分别称取KH2PO4 27.2mg，Na2HPO4·12H2O 71.6mg，MgSO4·7H2O 0.5g，MgCl2·6H2O 1.22g，CaCl2 66.0mg，NaHCO3 2.68g，NaCl 3.08g，酵母浸出膏5.0g，胰蛋白胨5.0g，甘油3.0g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，用1mol/L NaOH调节pH值至8.5±0.5，按照常规灭菌操作于121℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却后使用。以上培养基中均通过上海国药集团化学试剂有限公司购买得到。
(2)青海弧菌Q67的固体平板培养基配制：
取步骤(1)所得普通培养基100mL，加入1.5～2.0g琼脂，加热使溶解至透明，按照常规灭菌操作经121℃高压蒸汽灭菌20min，取出后在无菌操作条件下趁热倒入平板中，每块平板含前述溶液9～11ml，冷却后使用。
(3)青海弧菌Q67菌种的配制与培养：
取出-20℃保存的青海弧菌典型菌株Q67冷冻干粉100mg(该菌株购自华东师范大学，100mg/瓶)，用0.2mL 0.8％NaCl溶液溶解，转接到一块步骤(2)所得固体平板培养基上，22±1℃培养48小时长出菌落后，挑取小米粒大小菌落，接种到50mL步骤(1)所得普通培养基中，将所得菌液置于振荡培养箱，振荡转速为每分钟120转，温度保持22±1℃，培养至100μL菌液的相对发光单位首次达到30万以上，此时青海弧菌Q67生长进入对数生长期，即得青海弧菌Q67菌种。
(4)青海弧菌Q67微板培养基的配制：
分别称取KH2PO4 27.2mg，Na2HPO4·12H2O 71.6mg，MgSO4·7H2O 0.5g，MgCl2·6H2O 1.22g，CaCl2 66.0mg，NaHCO3 2.68g，NaCl 3.08g，酵母浸出膏8.78g，胰蛋白胨6.63g，甘油6.90g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，利用1mol/LNaOH调节pH值至8.5±0.5，按照常规灭菌操作于121℃下高压蒸汽灭菌20min后，冷却使用。
(5)微板加样菌液的配制：
将步骤(3)所得的菌种与步骤(4)所得的微板培养基按体积比为1∶4混合均匀，得到100μL前述混合液的相对发光强度为1.0×105相对发光单位，即得微板加样菌液。
(6)微板加样受试样品溶液浓度设计：
本实施例采用等比浓度稀释方法设计12个微板加样受试样品溶液浓度，具体采用下列公式
n＝1，2，L 12.确定受试样品溶液的12个浓度梯度。
其中，c0为样品储备液浓度，亦即最高受试样品溶液浓度；cn为第n个梯度的受试样品溶液浓度。根据下列条件确定最高受试样品溶液浓度和稀释因子：通过预实验确定最高受试样品溶液浓度下的样品溶液对微板上青海弧菌Q67发光强度的长期抑制率须达到50％以上(即最高抑制率)，最低受试样品溶液浓度下的样品溶液对微板上青海弧菌Q67发光强度的长期抑制率为-5％～+5％(即最低抑制率)；据此，得到样品储备液浓度为5.61×10-3mol/L，稀释因子
(7)微板加样与培养：
取96孔微板，在微板周边的36个微孔中加入200μL蒸馏水。在剩余的微孔中随机选取36个微孔作为加样孔，每3个微孔作为同一受试样品溶液浓度测定的3个平行组，共测定12组不同浓度的受试样品毒性数据；剩下的微孔则作为空白对照液孔。微板具体设计如图2所示：96孔微板周围36孔(黑色)不用，只用60个孔进行长期毒性试验。以第2、3、7、11列共24个微孔(灰色)为空白对照液孔；剩余36个微孔(白色)为样品组，B4至B6为样品最低浓度的3孔平行，浓度梯度按照由上而下、由左而右依次增大，即G8至G10的3孔平行为受试样品最高浓度组，则可以测定12组不同浓度的受试样品毒性数据。
根据如上微孔位置设计，在加样孔中先加入由步骤(6)所制得的受试样品溶液100μL，随后在前述加样孔中再加入由步骤(5)所制得的100μL微板加样菌液。每个浓度的受试样品溶液平行加样3次。空白对照孔测定没有受试样品作用下细菌生长的状况，因此加入100μL蒸馏水代替100μL受试样品溶液，随后再加入100μL微板加样菌液。加样完成后，将微板在22±1℃培养12小时后，在SpectraMax M5酶标仪(美国分子仪器公司)上测定相对发光强度。
同一受试样品的毒性测定共进行3块微板的青海弧菌Q67发光抑制实验。
(8)数据处理：
根据公式(对照组-处理组)/处理组(即对照组相对发光强度的平均值减去处理组相对发光强度的平均值之后与处理组相对发光强度的平均值的比值)计算浓度-效应数据，其中：处理组为每一受试样品浓度的3个平行微孔测试所得相对发光强度的平均值，对照组为所有空白对照液孔测试所得相对发光强度的平均值。从而得到12组受试样品的浓度-效应数据，对该浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到浓度-效应函数关系，利用反函数可进而计算不同效应值对应的受试样品浓度值即效应浓度，如半数效应浓度(EC50)。参照函数拟合的确定系数，以拟合值与实验值相关性最大，也就是拟合值与实际测试值均方根误差最小者为最优函数关系。
根据上述方法步骤测定Q67发光强度原始数据并按照步骤(8)进行处理得到浓度-效应数据见表1所示。选择APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中的Logit，函数对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到拟合参数α＝9.60，β＝2.92，相关系数平方为0.982，均方根误差为0.0433。上述拟合参数说明，实验数据具有良好的精密度，所选拟合方程能够很好的描述威尔伯对青海弧菌Q67的长期毒性的浓度-效应关系。威尔伯长期毒性的EC50值为5.18×10-4mol·L-1。与实验室此前测定威尔伯短期毒性EC50值1.80×10-3mol·L-1相比【短期毒性分析法参照(葛会林，刘树深，刘芳.多组分苯胺类混合物对发光菌的抑制毒性.生态毒理学报[J]；2006；1：295-302)，以下各实施例均相同】，其长期毒性具有明显提升。
表1.威尔伯长期毒性浓度-效应数据
附注：x表示实验中12个浓度梯度值(mol/L)，浓度采用科学计数法表示，2.81E-03等同于2.81×10-3，y表示相应浓度梯度产生的效应值(百分率表示)，三组数为三板重复的浓度-效应数据。以下各表相同。
【实施例2】用本发明毒性分析法进行扑灭通长期毒性测定
方法其余步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(5)中所述体积比为1∶5，所述100μL微板加样菌液相对发光强度为0.8×105相对发光单位；步骤(6)中最高抑制率达到80％以上，样品储备液浓度为2.22×10-3mol/L，稀释因子
根据上述方法步骤测定Q67发光强度原始数据并按照步骤(8)进入预处理得到浓度-效应数据如表2所示。选择APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中的Weibull函数对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到拟合参数α＝7.47，β＝2.56，相关系数平方为0.960，均方根误差为0.0391。上述拟合参数说明，实验数据具有良好的精密度，所选拟合方程能够很好的描述扑灭通对青海弧菌Q67的长期毒性的浓度-效应关系。扑灭通长期毒性的EC50值为8.65×10-4mol/L。与实验室此前测定扑灭通短期毒性EC50值1.97×10-3mol/L相比，其长期毒性具有明显提升。
表2.扑灭通长期毒性浓度-效应数据
【实施例3】用本发明毒性分析法进行嗪草酮长期毒性测定
方法其余步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(5)中所述体积比为1∶3，所述100μL微板加样菌液相对发光强度为1.2×105相对发光单位；步骤(6)中样品储备液浓度为3.56×10-3mol/L，稀释因子
根据上述方法步骤测定Q67发光强度原始数据并按照步骤(8)进入预处理得到浓度-效应数据见表3所示。选择APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中的Logit函数对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到拟合参数α＝9.09，β＝2.92，相关系数平方为0.968，均方根误差为0.0464。上述拟合参数说明，实验数据具有良好的精密度，所选拟合方程能够很好的描述嗪草酮对青海弧菌Q67的长期毒性的浓度-效应关系。嗪草酮长期毒性的EC50值为7.77×10-4mol/L。与实验室此前测定嗪草酮短期毒性EC50值3.21×10-3mol/L相比，其长期毒性具有明显提升。
表3.嗪草酮长期毒性浓度-效应数据
【实施例4】用本发明毒性分析法进行杀草强长期毒性测定
方法其余步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(5)中所述体积比为1∶4，所述100μL微板加样菌液相对发光强度为1.0×105相对发光单位；步骤(6)中样品储备液浓度为1.31×10-1mol/L，稀释因子
根据上述方法步骤测定Q67发光强度原始数据并按照步骤(8)进入预处理得到浓度-效应数据见表4所示。选择APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中的Weibull函数对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到拟合参数α＝4.27，β＝2.15，相关系数平方为0.968，均方根误差为0.0664。上述拟合参数说明，实验数据具有良好的精密度，所选拟合方程能够很好的描述杀草强对青海弧菌Q67的长期毒性的浓度-效应关系。杀草强长期毒性的EC50值为6.70×10-3mol/L。与实验室此前测定杀草强对青海弧菌Q67没有短期毒性，其长期毒性具有明显提升。
表4.杀草强长期毒性浓度-效应数据
【实施例5】用本发明毒性分析法进行敌百虫长期毒性测定
方法其余步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(6)中样品储备液浓度为3.37×10-2mol/L，稀释因子
根据上述方法步骤测定Q67发光强度原始数据并按照步骤(8)进入预处理得到浓度-效应数据见表5所示。选择APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中的Weibull函数对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到拟合参数α＝6.53，β＝2.26，相关系数平方为0.996，均方根误差为0.0243。上述拟合参数说明，实验数据具有良好的精密度，所选拟合方程能够很好的描述敌百虫对青海弧菌Q67的长期毒性的浓度-效应关系。敌百虫长期毒性的EC50值为9.00×10-4mol/L。与实验室此前测定敌百虫短期毒性EC50值1.06×10-2mol/L相比，其长期毒性具有明显提升。
表5.敌百虫长期毒性浓度-效应数据
【实施例6】用本发明毒性分析法进行氯霉素长期毒性测定
方法其余步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(6)中样品储备液浓度为1.04×10-3mol/L，稀释因子根据上述方法步骤测定Q67发光强度原始数据并按照步骤(8)进入预处理得到浓度-效应数据见表6所示。选择APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中的Weibull函数对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到拟合参数α＝7.00，β＝2.07，相关系数平方为0.979，均方根误差为0.0415。上述拟合参数说明，实验数据具有良好的精密度，所选拟合方程能够很好的描述氯霉素对青海弧菌Q67的长期毒性的浓度-效应关系。氯霉素长期毒性的EC50值为2.72×10-4mol/L。与实验室此前测定氯霉素短期毒性EC50值2.63×10-3mol/L相比，其长期毒性具有明显提升。
表6.氯霉素长期毒性浓度-效应数据
【实施例7】用本发明毒性分析法进行盐酸四环素长期毒性测定
方法其余步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(6)中样品储备液浓度为1.43×10-5mol/L，稀释因子
根据上述方法步骤测定Q67发光强度原始数据并按照步骤(8)进入预处理得到浓度-效应数据见表7所示。选择APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中的Weibull函数对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到拟合参数α＝14.39，β＝2.55，相关系数平方为0.979，均方根误差为0.0575。上述拟合参数说明，实验数据具有良好的精密度，所选拟合方程能够很好的描述盐酸四环素对青海弧菌Q67的长期毒性的浓度-效应关系。盐酸四环素长期毒性的EC50值为1.60×10-6mol/L。与实验室此前测定盐酸四环素短期毒性EC50值2.47×10-4mol/L相比，其长期毒性具有明显提升。
表7.盐酸四环素长期毒性浓度-效应数据
【实施例8】用本发明毒性分析法进行盐酸二氟沙星长期毒性测定
方法其余步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(6)中样品储备液浓度为1.15×10-6mol/L，稀释因子
根据上述方法步骤测定Q67发光强度原始数据并按照步骤(8)进入预处理得到浓度-效应数据见表8所示。选择APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中的Weibull函数对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到拟合参数α＝44.97，β＝7.14，相关系数平方为0.986，均方根误差为0.0316。上述拟合参数说明，实验数据具有良好的精密度，所选拟合方程能够很好的描述盐酸二氟沙星对青海弧菌Q67的长期毒性的浓度-效应关系。盐酸二氟沙星长期毒性的EC50值为4.44×10-7mol/L。与实验室此前测定盐酸二氟沙星短期毒性EC50值3.86×10-4mol/L相比，其长期毒性具有明显提升。
表8.盐酸二氟沙星长期毒性浓度-效应数据
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于青海弧菌Q67的环境污染物长期微板毒性分析法，包括以下步骤：
(1)青海弧菌Q67普通培养基配制与培养：
(2)青海弧菌Q67的固体平板培养基配制：
(3)青海弧菌Q67菌种的配制与培养：
(4)青海弧菌Q67微板培养基的配制：
(5)微板加样菌液的配制：
(6)微板加样受试样品溶液浓度设计：
(7)微板加样与培养：
(8)数据处理，计算不同浓度下的效应值。
2.根据权利要求1所述的基于青海弧菌Q67的环境污染物长期微板毒性分析法，其特征在于：
(1)青海弧菌Q67普通培养基配制与培养：
分别称取KH2PO4 27.2mg，Na2HPO4·12H2O 71.6mg，MgSO4·7H2O 0.5g，MgCl2·6H2O 1.22g，CaCl2 66.0mg，NaHCO3 2.68g，NaCl 3.08g，酵母浸出膏5.0g，胰蛋白胨5.0g，甘油3.0g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，用1mol/L NaOH调节pH值至8.5±0.5，按照常规灭菌操作于121℃下高压蒸汽灭菌20min，即得青海弧菌Q67普通培养基，冷却后使用或放置于4℃冰箱保存备用；
(2)青海弧菌Q67的固体平板培养基配制：
取步骤(1)所得普通培养基100mL，加入1.5～2.0g琼脂，加热使溶解至透明，按照常规灭菌操作经121℃高压蒸汽灭菌20min，取出后在无菌操作条件下趁热倒入平板中，每块平板含前述溶液9～11ml，冷却后使用或保存于4℃冰箱备用，即得青海弧菌Q67固体平板培养基；
(3)青海弧菌Q67菌种的配制与培养：
取出-20℃保存的青海弧菌典型菌株Q67冷冻干粉100mg，用0.2mL 0.8％NaCl溶液溶解，转接到一块步骤(2)所得固体平板培养基上，22±1℃培养48小时长出菌落后，挑取小米粒大小菌落，接种到50mL步骤(1)所得普通培养基中，将所得菌液置于振荡培养箱，振荡转速为每分钟120转，温度保持22±1℃，培养至100μL菌液的相对发光单位达到30万以上，此时青海弧菌Q67生长进入对数生长期，即得青海弧菌Q67菌种；
(4)青海弧菌Q67微板培养基的配制：
分别称取KH2PO4 27.2mg，Na2HPO4·12H2O 71.6mg，MgSO4·7H2O 0.5g，MgCl2·6H2O 1.22g，CaCl2 66.0mg，NaHCO3 2.68g，NaCl 3.08g，酵母浸出膏8.78g，胰蛋白胨6.63g，甘油6.90g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，利用1mol/L NaOH调节pH值至8.5±0.5，按照常规灭菌操作于121℃下高压蒸汽灭菌20min，即得青海弧菌Q67微板培养基，冷却后使用或于4℃冰箱保存备用；
(5)微板加样菌液的配制：
将步骤(3)所得的菌种与步骤(4)所得的微板培养基混合均匀，使100μL前述混合液的相对发光强度达到0.8×105～1.2×105相对发光单位，即得微板加样菌液；
(6)微板加样受试样品溶液浓度设计：
污染物的实验浓度梯度设计方案、测试浓度数量根据不同检测的要求变化，等比浓度稀释方案可以检测更大范围内污染物的毒性效应，因此，本发明以等比浓度稀释方案为例，说明微板中样品浓度设计；采用下列公式
n＝1，2，L 12.确定12个受试样品溶液等比浓度梯度；其中，c0为样品储备液浓度，亦即最高受试样品溶液浓度c1；cn为第n个梯度的受试样品溶液浓度；根据下列条件确定最高受试样品溶液浓度和稀释因子
：预实验确定最高受试样品溶液浓度下的样品溶液对微板上青海弧菌Q67发光强度的长期抑制率(即最高抑制率)须达到50％以上，最低受试样品溶液浓度下的样品溶液对微板上青海弧菌Q67发光强度的长期抑制率(即最低抑制率)为-5％～+5％；此时，根据最高抑制率时的效应浓度(CH)与最低抑制率时的效应浓度(CL)以及需要测试的浓度梯度个数，可以根据下面公式计算得到稀释因子：污染物的实验浓度梯度设计方案以及测试浓度数量n均可根据不同检测的要求而变化；
(7)微板加样与培养：
取96孔微板，在微板周边的36个微孔中加入200μL蒸馏水，在剩余的微孔中随机选取36个微孔作为加样孔，每3个微孔作为同一受试样品溶液浓度测定的3个平行组，则可以测定12组不同浓度的受试样品毒性数据；剩下的微孔则作为空白对照液孔；
在加样孔中先加入由步骤(6)所制得的受试样品溶液100μL，随后在前述加样孔中再加入由步骤(5)所制得的100μL微板加样菌液，每个浓度的受试样品溶液平行加样3次；在空白对照液孔中先加入100μL蒸馏水，随后再加入100μL微板加样菌液；加样完成后，将微板在22±1℃培养，培养时间≤12小时，培养完成后测定相对发光强度；
同一受试样品的毒性测定要至少3块微板的青海弧菌Q67发光抑制实验；
(8)数据处理：
根据公式(对照组-处理组)/处理组计算抑制效应，其中：处理组为每一受试样品浓度的3个平行微孔测试所得相对发光强度的平均值，对照组为所有空白对照液孔测试所得相对发光强度的平均值；从而得到受试样品的浓度-效应数据，对该浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合，得到浓度-效应函数关系，利用反函数进而计算不同浓度下的效应值。
3.根据权利要求2所述的毒性分析法，其特征在于：步骤(5)所述100μL微板加样菌液相对发光强度为1.0×105相对发光单位。
4.根据权利要求2或3所述的毒性分析法，其特征在于：步骤(5)所述微板加样菌液是由步骤(3)所得的菌种与步骤(4)所得的微板培养基按体积比1∶5～1∶3混合而成。
5.根据权利要求4所述的毒性分析法，其特征在于：所述体积比为1∶4。
6.根据权利要求2或3或4或5所述的毒性分析法，其特征在于：步骤(6)中最高受试样品浓度下的样品溶液对青海弧菌Q67发光强度的抑制率达到80％以上。
7.根据权利要求2或3或4或5或6所述的毒性分析法，其特征在于：步骤(7)中所述培养时间为12小时。
8.根据权利要求2或3或4或5或6或7所述的毒性分析法，其特征在于：步骤(8)中参照确定系数，选择拟合值与实际测试值均方根误差最小者为最优函数关系。
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