CN111796085A - 一种污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法，设置多个浓度梯度对秀丽线虫分别进行高通量的毒性暴露，通过设置多个平行组且对同一污染物毒性进行多次重复测定，进而获取多个浓度点毒性数据，拟合出目标污染物的剂量‑效应曲线。该方法主要包括以下步骤：配置秀丽线虫生长培养基；配置大肠杆菌OP50培养基；获取同步化后秀丽线虫原液；获取不同浓度梯度的环境污染物样液；进行秀丽线虫毒性暴露实验并获取毒性数据；对数据进行拟合。本发明可准确的计算出环境污染物对秀丽线虫神经毒性，为评价环境污染物对生态系统和人类健康的安全提供更科学的理论支撑。

Description

一种污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法
技术领域
本发明涉及环境污染物毒性检测技术领域，尤其涉及一种污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法。
背景技术
随着工业化的迅速发展，越来越多化合物被开发出来，进而造成环境中出现各种各样的新型污染物，其中，有农药、重金属、抗生素和其它有机化合物等环境污染物造成的污染尤为突出。给环境及人类健康带来巨大的潜在风险。因此，越来越多的研究集中于环境污染物毒性的检测这一领域。
环境监测中通常采用理化分析和生物检测两类方法。其中理化分析是通过物理和化学等分析手段，快速灵敏的分析测定污染物的种类及浓度，其中，温度、溶解氧、pH值、电导率及氧化还原电位等一些常规参数可连续监测，理化分析具有快速、准确及可靠等特点，因而其在环境检测中具有很重要作用。有毒污染物的暴露水平及毒性程度决定了其在环境中的毒理作用，而理化分析方法可精确测定出化学物质、甚至是痕量的浓度以及待分析组分的精确含量，可为制定有毒化学品的相关标准及法规提供依据。
但是随着科技的不断发展，人类逐渐认识到理化分析方法虽然非常精确，但是也只能测出污染物中化合物的成分、数量，而不能直接评价污染物对生物体的危害性。当污染物进入环境后，可与环境中的其他物质共同存在，并发生复杂的作用，进而综合影响环境中的各种生物。而理化分析方法只能检出各种污染物成分的含量及类别，不能确切地评价生物所受到的综合影响。
生物监测方法是从生物学的角度出发，利用生物体对环境污染及环境变化所产生的种种反应，来对环境受污染程度及质量好坏进行直接表征，并提供环境质量监测及评价的依据。有毒污染物一旦进入环境中，将在各级生物学水平上对生态系统产生影响，进而使生态系统固有的结构及功能发生改变(李慧蓉.生物监测技术及其研究进展[J].江苏石油化工学院学报[J],2002,14(2):57-60.)。所以，生物检测方法是一种快速的监测分析方法，为一项综合性指标，其能反映出各有毒污染物对环境的综合毒性影响。应用生物监测方法检测评价有毒污染物已受到越来越多的关注。
秀丽线虫作为一种典型的受试生物体，已被证明对毒理学研究中的环境毒物敏感(Colmenares,D.,et al.,Delivery of dietary triglycerides to Caenorhabditiselegans using lipid nanoparticles:Nanoemulsion-based delivery systems.FoodChem[J].,2016.202:p.451-457.)。秀丽线虫是一种广泛分布的微小、自由爬行且全身通体透明的模式生物，主要以大肠杆菌为食，其新孵出的幼虫长0.25毫米，成虫长1毫米，易于培养(Barriere,A.andM.-A.Felix,Isolation of C.elegans and relatednematodes.WormBook:the online review of C.elegans biology,2014:p.1-19.)。秀丽线虫的生命周期短，在25℃条件下，从卵生长发育到能够产卵成虫，只需3天时间。同时，秀丽线虫寿命相对较短，野生型线虫在20℃条件下培养，在给予充足的食物和良好的环境下，其平均寿命仅为2-3周，这为我们进行相关的研究工作节省了大量的时间(张帅,miR-52通过抑制非经典Wnt信号通路VANG-1/Van Gogh延长秀丽隐杆线虫寿命的研究.2019,东北师范大学.)。
目前秀丽线虫的运动行为、摄食行为、生殖水平、寿命等指标已广泛运用于重金属、纳米材料和有机农药的毒性评价中(Zhou D,Yang J,Li H,et al.Ecotoxicologicalevaluation of low-concentration bisphenol A exposure on the soil nematodeCaenorhabditis elegans and intrinsic mechanisms of stress response in vivo[J].Environmental Toxicology&Chemistry,2016,35(8):2041-204)。秀丽线虫的神经结构相对简单,但神经细胞体系功能完整,控制神经递质产生、代谢和传递的基因具有高度保守性，因此在神经毒性效应评价的应用上具有很大潜力(Chen N,Li J,Li D,etal.Chronic exposure to perfluorooctane sulfonate induces behavior defects andneurotoxicity through oxidative damages,in vivo and in vitro[J].Plos One,2014,9(11):e113453)。基于秀丽线虫作为毒性测试生物的优势，诸多学者都尝试着将其作为进行毒性试验的标准实验动物，并且尝试着将毒性试验的方法确定为标准步骤以供毒性试验参考。虽然已经有很多学者对秀丽线虫神经毒性进行研究，但所用的方法及其结果因受限于实验条件等原因，只是简单的进行单个或少数几个污染物浓度暴露下对秀丽线虫头部摆动次数统计，暴露组和空白对照组之间没有进行可靠的、科学的数学模型进行关联性分析。
发明内容
针对上述现有技术的缺陷与不足，提供一种污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法，包括以下步骤：S1、通过秀丽线虫培养实验获取同龄段秀丽线虫原液；S2、获取n(n≥2)个不同浓度的目标污染物，每个目标污染物的浓度为Cn＝C0×Fn-1，C0为目标污染物的浓度，F为稀释因子；S3、通过毒性暴露实验获取n个不同浓度下的秀丽线虫头部平均摆动数Wn、对照组的秀丽线虫头部摆动数W2；S4、通过公式
Figure BDA0002559383060000021
获取n个不同浓度对应的秀丽线虫头部摆动抑制率En，对En进行非线性拟合，获取“n个不同浓度-秀丽线虫头部摆动率”的剂量-效应曲线。
较佳地，通过预实验获取使秀丽线虫头部摆动抑制率达到50％以上的最高抑制浓度CH、抑制率低于10％以下的最低抑制浓度CL，根据公式F＝(CL/CH)1/(n-1)计算出稀释因子F。
较佳地，所述秀丽线虫培养实验包括以下步骤：S301、通过一级培养实验得到产卵期的秀丽线虫；S302、将S301的产卵期的秀丽线虫通过二级培养实验得到同龄段秀丽线虫原液。
较佳地，所述一级培养实验包括以下步骤：S3011、制备秀丽线虫生长的固体培养基BS，包括：将1mol/L的MgSO4、1mol/L的CaCl2、5mg/mL的胆固醇乙醇溶液各1mL与25mL的pH为6.0的K2PO4-KH2PO4混合配置成缓冲溶液；将琼脂粉、细菌学用蛋白胨、氯化钠溶于超纯水中，密封后进行高温杀菌18-22min，待冷却至60-70℃时加入所述缓冲溶液，混合均匀后在无菌环境中转移至灭菌后的培养皿中，得到固体培养基BS，待固体培养基BS冷却凝固后，冷藏保存；S3012、制备OP50大肠杆菌的液体培养基BL，包括：将胰蛋白胨、酵母浸出膏、氯化钠溶于超纯水中，混合均匀后用1mol/L的氢氧化钠溶液调整pH值至6.5-7.5，密封后进行高温杀菌18-22min，得到液体培养基BL；S3013、在无菌环境中将OP50大肠杆菌菌液注入液体培养基BL，并将液体培养基BL置于恒温震荡培养箱中培养22-26h后放入冷藏备用；所述恒温震荡培养箱的转速设置为150转/min；S3014、吸取S3013培养后的OP50大肠杆菌菌液平铺于固体培养基BS上，将固体培养基BS放入所述恒温震荡培养箱中培养22-26h后，得到含有OP50大肠杆菌的秀丽线虫生长培养基BE；S3015、将秀丽线虫转移至S3014获取的含有OP50大肠杆菌的秀丽线虫生长培养基BE，将含有OP50大肠杆菌的秀丽线虫生长培养基BE置于所述恒温培养箱中培养2-3天，得到产卵期的秀丽线虫。
较佳地，S3011中先将细菌学用蛋白胨、氯化钠溶于超纯水中，再加入琼脂粉；S3012中将液体培养基BL内的溶液分瓶密封后再进行高温杀菌18-22min。
较佳地，所述二级培养实验包括以下步骤：S3021、在无菌环境中将NaCl和KCl溶解于超纯水中，得到无菌K溶液，用所述无菌K溶液冲洗所述产卵期的秀丽线虫，用吸管吸取上清液后得到产卵期的秀丽线虫浓缩液；S3022、向S3021中的产卵期的秀丽线虫浓缩液中加入秀丽线虫裂解液，所述秀丽线虫浓缩液与所述秀丽线虫裂解液的体积比为1：7，裂解10-12min后得到分散于裂解液中的秀丽线虫卵；S3023、向秀丽线虫卵中加入所述无菌K溶液润洗后进行离心过程；S3024、重复S3023过程两次，得到处于同一生长阶段的秀丽线虫虫卵；S3025、将S3024中处于同一生长阶段的秀丽线虫虫卵移取至含有OP50大肠杆菌的秀丽线虫生长培养基BE上，置于18-22℃的恒温培养箱中培养得到处于同一生长阶段秀丽线虫；S3026、将S3025中的处于同一生长阶段秀丽线虫用所述无菌K溶液进行稀释，得到同龄段秀丽线虫原液。由于从培养基BE上冲洗下来的处于同一生长阶段的秀丽线虫个数能够达到每毫升几千个，因此需要不断进行稀释，以获得合适的虫液密度，这样既不会造成因秀丽线虫个数较多而影响秀丽线虫的生理活动。
较佳地，实验组为n组不同浓度的污染物，对照组为超纯水；向实验组和对照组内加取同龄段秀丽线虫原液，在高通量微板中进行所述毒性暴露实验，44-52h后，对n组实验组和对照组分别取样，在显微镜下获取n组实验组的秀丽线虫头部平均摆动数Wn、对照组的秀丽线虫头部摆动数W2。具体的，在Excel中记录t＝t0时刻的Wn、W2，以此获得受试样品的剂量-效应数据。
较佳地，S301过程在酒精灯旁进行，且在S3015过程中转移秀丽线虫时的工具需要提前灭菌消毒，防止杂菌或不同品系秀丽线虫之间产生污染。
较佳地，S3022中应不断翻转摇晃所述秀丽线虫浓缩液与所述秀丽线虫裂解液的混合液，防止秀丽线虫沉淀造成裂解不完全。
较佳地，对En以均方根误差作为拟合优度标准，各拟合参数根据均方根误差的最小进行确定。采用非线性最小二乘对剂量-效应数据进行拟合，参照确定系数，选择拟合值与试验观测值均方根误差最小者为最优模型。剂量-效应数据的非线性最小二乘拟合也可以在商业化软件Origin或Matlab中进行。根据选定函数参数的拟合值，利用反函数可进而计算不同效应下的浓度值。
本发明采用高通量微板暴露方法，并对暴露组和空白对照组进行关联性分析，采用非线性最小二乘法对n个浓度点毒性数据进行拟合，获取整个剂量-效应曲线，并利用反函数对效应浓度(ECx)进行求解，实验结果可靠。
附图说明
图1为本发明提供的污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法的毒性暴露实验的96孔微板；
图2为本发明提供的污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法的第一实施例的毒死蜱剂量效应曲线；
图3为本发明提供的污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法的第二实施例的三唑磷剂量效应曲线。
具体实施方式
以下参见示出的本发明实施例的附图，下文将更详细地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同形式实现，并且不应解释为受在此提出之实施例的限制。相反，提出这些实施例是为了达成充分及完整公开，并且使本技术领域的技术人员完全了解本发明的范围。这些附图中，为清楚起见，可能放大了层及区域的尺寸及相对尺寸。
本发明提供了一种污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法，包括以下步骤：S1、通过秀丽线虫培养实验获取同龄段秀丽线虫原液；S2、获取12个不同浓度的目标污染物，每个目标污染物的浓度为Cn＝C0×Fn-1，C0为目标污染物的浓度，F为稀释因子，以等比浓度稀释法设计12个浓度样液，每个目标污染物的浓度为Cn＝C0×Fn-1，Cn为第n个梯度的受试样品溶液浓度，通过预实验获取使秀丽线虫头部摆动抑制率达到50％以上的最高抑制浓度CH、抑制率低于10％以下的最低抑制浓度CL，根据公式F＝(CL/CH)1/(n-1)计算出稀释因子F，例如通过预实验得到CL＝2.290×10-5mol/L,CH＝4.586×10-3mol/L，稀释因子F＝(CL/CH)1/(n-1)＝(2.290×10-5/4.586×10-3)1/(12-1)＝0.618，即采用0.618的稀释因子稀释样品溶液；S3、通过毒性暴露实验获取12个不同浓度下的秀丽线虫头部平均摆动数Wn、对照组的秀丽线虫头部摆动数W2；S4、通过公式
Figure BDA0002559383060000051
获取12个不同浓度对应的秀丽线虫头部摆动抑制率En，对En进行非线性拟合，获取“12个不同浓度-秀丽线虫头部摆动率”的效应曲线。
具体的，秀丽线虫培养实验包括以下步骤：S301、通过一级培养实验得到产卵期的秀丽线虫，包括：
制备秀丽线虫生长的固体培养基BS，包括：将1mol/L的MgSO4、1mol/L的CaCl2、5mg/mL的胆固醇乙醇溶液各1mL与25mL的pH为6.0的K2PO4-KH2PO4混合配置成缓冲溶液；先将2.5g的细菌学用蛋白胨、3g的氯化钠溶于100ml的超纯水中，再加入17g琼脂粉，混合均匀，并转移到1000mL锥形瓶中，用牛皮纸和橡皮筋包扎好置于灭菌锅中灭菌，灭菌温度：121℃,灭菌时间：20min，待冷却至60-70℃时加入缓冲溶液，混合均匀后在超净台中转移至灭菌后的培养皿中，得到固体培养基BS，待固体培养基BS冷却凝固后，4℃冷藏保存；
OP50大肠杆菌作为秀丽线虫的食物源，制备OP50大肠杆菌的液体培养基BL，包括：将10g胰蛋白胨、5g酵母浸出膏、10g氯化钠溶于1000mL的超纯水中，混合均匀后用1mol/L的氢氧化钠溶液调整pH值至6.5-7.5，分装于50mL锥形瓶中，每瓶约50mL，用牛皮纸和橡皮筋包扎后进行高温杀菌20min，灭菌温度：121℃，得到液体培养基BL；
在超净工作台中点燃酒精灯，在酒精灯火焰旁用200μL移液枪吸取200μL的OP50大肠杆菌菌液注入液体培养基BL，用橡皮筋封口之后置于37℃的恒温震荡培养箱中培养24h后放入冷藏备用，恒温震荡培养箱的转速设置为150转/min；
吸取培养后的OP50大肠杆菌菌液500μL，平铺于固体培养基BS上，将固体培养基BS放入37℃的恒温震荡培养箱中培养24h后，得到含有OP50大肠杆菌的秀丽线虫生长培养基BE；
将秀丽线虫转移至S304获取的含有OP50大肠杆菌的秀丽线虫生长培养基BE，并标记好接取日期和秀丽线虫品系，将含有OP50大肠杆菌的秀丽线虫生长培养基BE置于20℃的恒温培养箱中培养2-3天，得到产卵期的秀丽线虫。
S302、将S301的产卵期的秀丽线虫通过二级培养实验得到同龄段秀丽线虫原液，包括：
在无菌环境中将NaCl和KCl溶解于超纯水中，得到无菌K溶液，用无菌K溶液冲洗产卵期的秀丽线虫，集于15ml离心管中，静置5min用吸管吸去上清液，最终留取1.5ml的秀丽线虫浓缩液；向产卵期的秀丽线虫浓缩液中加入10.5ml的秀丽线虫裂解液，秀丽线虫浓缩液与秀丽线虫裂解液的体积比为1：7，裂解10-12min后得到分散于裂解液中的秀丽线虫卵，过程中应不断翻转摇晃秀丽线虫浓缩液与秀丽线虫裂解液的混合液，防止秀丽线虫沉淀造成裂解不完全，把裂解后的离心管置于2000转/分的离心机中质量配平后离心2min，在离心管底部得到虫卵；撇弃上清液向秀丽线虫卵中加入12mL加入无菌K溶液润洗后进行离心过程，重复离心过程两次，得到处于同一生长阶段的秀丽线虫虫卵；将处于同一生长阶段的秀丽线虫虫卵采用移液枪小心移取至含有OP50大肠杆菌的秀丽线虫生长培养基BE上，置于20℃的恒温培养箱中培养得到处于同一生长阶段秀丽线虫；将处于同一生长阶段秀丽线虫用1ml移液枪吸取1-2ml无菌K溶液进行稀释，得到同龄段秀丽线虫原液。由于从培养基BE上冲洗下来的处于同一生长阶段的秀丽线虫个数能够达到每毫升几千个，因此需要不断进行稀释，以获得合适的虫液密度，这样既不会造成因秀丽线虫个数较多而影响秀丽线虫的生理活动。转移秀丽线虫时的所用的工具需要提前灭菌消毒，防止杂菌或不同品系秀丽线虫之间产生污染。
具体的，如图1所示(C为实验组，B为对照组)，取96孔微板，在微板周边的36个微孔和第6和7列的12个孔中分别加入200μL超纯水，以防止边缘效应。第2列和第11列的12个孔作为空白加样孔，第3、4、5、8、9、10列中的36作为目标污染物的12个浓度梯度加样孔，每个浓度设置3个平行对照；分别用100μL移液枪对每个目标污染物加样孔进行污染物加样，空白对照加入100μL的超纯水；48个孔中每个孔分别加入100μL的同龄段秀丽线虫原液，每个孔中秀丽线虫个数在10-15条左右。进行48小时毒性暴露后，将每个暴露孔中的秀丽线虫分别转移至两个24孔板中，在24孔板中静置1min，选取每个暴露孔中10条虫子，在显微镜下进行1min的视频拍摄，在Excel中记录t＝t0时刻的Wn、W2，通过公式
Figure BDA0002559383060000071
获得受试样品的剂量-效应数据。
具体的，对En以均方根误差作为拟合优度标准，各拟合参数根据均方根误差的最小进行确定。采用非线性最小二乘对剂量-效应数据进行拟合，参照确定系数，选择拟合值与试验观测值均方根误差最小者为最优模型。剂量-效应数据的非线性最小二乘拟合也可以在商业化软件Origin或Matlab中进行。根据选定函数参数的拟合值，利用反函数可进而计算不同浓度下的效应值。
实施例一：根据上述方法测定毒死蜱对秀丽线虫头部摆动抑制毒性数据。选择APTox软件中的Weibull函数对数据进行拟合得到拟合参数α＝14.97，β＝2.23，相关系数平方为0.9660，均方根误差为0.0454。并由反函数计算得出半数效应浓度EC50值为1.32629E-7mol·L-1，95％观测置信上限为1.86897E-7，95％观测置信下限为8.92756E-8。毒死蜱剂量效应曲线如图2所示。
实施例二：根据上述方法测定三唑磷对秀丽线虫头部摆动抑制率的检测方法。本例的稀释因子为0.78328。选择APTox软件中的Weibull函数对数据进行拟合得到拟合参数α＝12.380，β＝1.880，相关系数平方为0.9507，均方根误差为0.0584。并由反函数计算得出半数效应浓度EC50值为1.65936E-7mol·L-1，95％观测置信上限为2.83480E-7，95％观测置信下限为8.93650E-8。三唑磷剂量效应曲线如图3所示。
因本技术领域的技术人员应理解，本发明可以以许多其他具体形式实现而不脱离其本身的精神或范围。尽管已描述了本发明的实施案例，应理解本发明不应限制为这些实施例，本技术领域的技术人员可如所附权利要求书界定的本发明的精神和范围之内做出变化和修改。

Claims (10)

1.一种污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、通过秀丽线虫培养实验获取同龄段秀丽线虫原液；
S2、获取n(n≥2)个不同浓度的目标污染物，每个目标污染物的浓度为Cn＝C0×Fn-1，C0为目标污染物的浓度，F为稀释因子；
S3、通过毒性暴露实验获取n个不同浓度下的秀丽线虫头部平均摆动数Wn、对照组的秀丽线虫头部摆动数W2；
S4、通过公式
Figure FDA0002559383050000011
获取n个不同浓度对应的秀丽线虫头部摆动抑制率En，对En进行非线性拟合，获取“n个不同浓度-秀丽线虫头部摆动率”的剂量-效应曲线。
2.根据权利要求1所述的污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法，其特征在于，通过预实验获取使秀丽线虫头部摆动抑制率达到50％以上的最高抑制浓度CH、抑制率低于10％以下的最低抑制浓度CL，根据公式F＝(CL/CH)1/(n-1)计算出稀释因子F。
3.根据权利要求1所述的污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法，其特征在于，所述秀丽线虫培养实验包括以下步骤：
S301、通过一级培养实验得到产卵期的秀丽线虫；
S302、将S301的产卵期的秀丽线虫通过二级培养实验得到同龄段秀丽线虫原液。
4.根据权利要求3所述的污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法，其特征在于，所述一级培养实验包括以下步骤：
S3011、制备秀丽线虫生长的固体培养基BS，包括：将1mol/L的MgSO4、1mol/L的CaCl2、5mg/mL的胆固醇乙醇溶液各1mL与25mL的pH为6.0的K2PO4-KH2PO4混合配置成缓冲溶液；将琼脂粉、细菌学用蛋白胨、氯化钠溶于超纯水中，密封后进行高温杀菌18-22min，待冷却至60-70℃时加入所述缓冲溶液，混合均匀后在无菌环境中转移至灭菌后的培养皿中，得到固体培养基BS，待固体培养基BS冷却凝固后，冷藏保存；
S3012、制备OP50大肠杆菌的液体培养基BL，包括：将胰蛋白胨、酵母浸出膏、氯化钠溶于超纯水中，混合均匀后用1mol/L的氢氧化钠溶液调整pH值至6.5-7.5，密封后进行高温杀菌18-22min，得到液体培养基BL；
S3013、在无菌环境中将OP50大肠杆菌菌液注入液体培养基BL，并将液体培养基BL置于恒温震荡培养箱中培养22-26h后放入冷藏备用；所述恒温震荡培养箱的转速设置为150转/min；
S3014、吸取S3013培养后的OP50大肠杆菌菌液平铺于固体培养基BS上，将固体培养基BS放入所述恒温震荡培养箱中培养22-26h后，得到含有OP50大肠杆菌的秀丽线虫生长培养基BE；
S3015、将秀丽线虫转移至S3014获取的含有OP50大肠杆菌的秀丽线虫生长培养基BE，将含有OP50大肠杆菌的秀丽线虫生长培养基BE置于所述恒温培养箱中培养2-3天，得到产卵期的秀丽线虫。
5.根据权利要求4所述的污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法，其特征在于，
S3011中先将细菌学用蛋白胨、氯化钠溶于超纯水中，再加入琼脂粉；
S3012中将液体培养基BL内的溶液分瓶密封后再进行高温杀菌18-22min。
6.根据权利要求3所述的污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法，其特征在于，所述二级培养实验包括以下步骤：
S3021、在无菌环境中将NaCl和KCl溶解于超纯水中，得到无菌K溶液，用所述无菌K溶液冲洗所述产卵期的秀丽线虫，用吸管吸取上清液后得到产卵期的秀丽线虫浓缩液；
S3022、向S3021中的产卵期的秀丽线虫浓缩液中加入秀丽线虫裂解液，所述秀丽线虫浓缩液与所述秀丽线虫裂解液的体积比为1：7，裂解10-12min后得到分散于裂解液中的秀丽线虫卵；
S3023、向秀丽线虫卵中加入所述无菌K溶液润洗后进行离心过程；
S3024、重复S3023过程两次，得到处于同一生长阶段的秀丽线虫虫卵；
S3025、将S3024中处于同一生长阶段的秀丽线虫虫卵移取至含有OP50大肠杆菌的秀丽线虫生长培养基BE上，置于18-22℃的恒温培养箱中培养得到处于同一生长阶段秀丽线虫；
S3026、将S3025中的处于同一生长阶段秀丽线虫用所述无菌K溶液进行稀释，得到同龄段秀丽线虫原液。
7.根据权利要求1所述的污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法，其特征在于，实验组为n组不同浓度的污染物，对照组为超纯水；
向实验组和对照组内加取同龄段秀丽线虫原液，进行所述毒性暴露实验，44-52h后，对n组实验组和对照组分别取样，在显微镜下获取n组实验组的秀丽线虫头部平均摆动数Wn、对照组的秀丽线虫头部摆动数W2。
8.根据权利要求4所述的污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法，其特征在于，S301过程在酒精灯旁进行，且在S3015过程中转移秀丽线虫时的工具需要提前灭菌消毒。
9.根据权利要求6所述的污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法，其特征在于，S3022中应不断翻转摇晃所述秀丽线虫浓缩液与所述秀丽线虫裂解液的混合液。
10.根据权利要求1所述的污染物对秀丽线虫头部摆动抑制率的分析方法，其特征在于，对En以均方根误差作为拟合优度标准，各拟合参数根据均方根误差的最小进行确定。
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