CN104390920A - 基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法 - Google Patents

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陈琼
朱曙光
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刘磊
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Abstract

本发明公开了一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法，以淡水绿藻中的蛋白核小球藻为受试生物，以96孔透明微板为载体，在传统化合物浓度-效应关系中引入时间因素，通过测定部分环境污染物对蛋白核小球藻的时间依赖性毒性，发现所有测定的污染物均具有明显的时间依赖特征，再利用最小二乘样条函数逼近法构建浓度-时间-效应曲面，了解污染物随浓度和时间变化的动态毒性效应。本发明克服传统毒性分析方法中只分析污染物对暴露生物在某一暴露时间终点的累积效应的不足，有助于全面的了解污染物的毒性效应，而且能更深入的了解污染物的毒理作用机制与途径，更能体现实际环境中污染物暴露的现象和信息。

Description

基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法
技术领域
本发明涉及环境污染物毒性检测技术领域，尤其涉及一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法。
背景技术
目前，人类的生产和生活不间断地排放着大量的种类繁多的污染物进入环境，对生态环境和生物体产生着持续的毒害作用。因而，污染物毒性的检测除考虑浓度因素外，更应该着眼于污染物对暴露生物随着时间而变化的动态效应，即同时观察浓度和时间两个因素在污染物对生物体毒性变化过程中起的重要作用。
环境中的污染物对水生生物的毒性效应是一个动态变化的过程，同时因其在环境中代谢转化等因素的也会影响污染物对生物的毒性效应，而基于污染物对暴露生物在某一特殊时间终点的毒性效应如短期效应和长期效应只是某一时间段的累积效应，不易观测到污染物对生物体在整个暴露期间毒性效应发生的变化，更不易观测到污染物对暴露生物的真实的毒性作用规律和作用机制。因此，检测环境污染物对暴露生物随时间而变化的动态效应规律与作用机制，不仅有助于全面的了解污染物的毒性效应，而且能更深入的了解污染物的毒理作用机制与途径，更能体现实际环境中污染物暴露的现象和信息。
发明内容
本发明提出了一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法，相对于传统毒性分析方法，强调了时间因素，克服传统毒性分析方法中只分析污染物对暴露生物在某一暴露时间终点的累积效应的不足，有助于全面的了解污染物的毒性效应，而且能更深入的了解污染物的毒理作用机制与途径，更能体现实际环境中污染物暴露的现象和信息。
本发明提出的一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法，包括如下步骤：
S1、培养得到OD690＝0.25-0.35的蛋白核小球藻液；
S2、取m个8行×12列的96孔透明微板；在任一个微板中，选取最外围的36个微孔并定义为第一微孔，在36个第一微孔中分别加入200μL蒸馏水，在外围之内选取12个微孔并定义为第二微孔，在12个第二微孔中分别加入100μL蒸馏水和100μL由S1得到的蛋白核小球藻液，将剩余48个微孔定义为第三微孔，将48个第三微孔均分为12组并分别标记为j＝1、2、…、12，向第j组的4个第三微孔中分别加入100μL浓度为Cj的受试样品溶液和100μL由S1得到的蛋白核小球藻液；
其中，Cj＝fj–1·C0，式中j为各组相应的标号，j＝1、2、…、12，C0为受试样品的储备液浓度，f为受试样品的稀释因子，而f可由公式f＝(CL/CH)1/(n-1)推导得到，式中CL为受试样品的最低效应浓度，CH为受试样品的最高效应浓度，n为受试样品溶液浓度梯度的数目，即n＝12；
S3、将m个微板置于光照培养箱中进行培养，在培养Tx时，测定每个微板上第三微孔的j组在Tx时的OD690平均值并记为ODj组，x，并测定每个微板上第二微孔在Tx时的OD690平均值并记为OD空白，x，其中Tx＝0h、t h、2t h、4t h、6th、…、96h，x为正整数；
S4、根据公式μj，T＝(ODj组，x-ODj组，x-1)/ODj组，x计算得到浓度为Cj的受试样品处理蛋白核小球藻在T时的平均生长速率μj，T，根据公式μ0，T＝(OD空白，x-OD空白，x-1)/OD空白，x计算得到第二微孔中蛋白核小球藻在T时的平均生长速率μ0，T，式中x≥2；
以受试样品对蛋白核小球藻的生长速率μj，T的抑制率Ej，T为毒性效应，通过公式Ej，T＝(1-μj，T/μ0，T)×100％计算在培养时间为Tx时浓度为Cj的受试样品的毒性，得到受试样品的浓度-效应数据，对所述浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合得到浓度-效应函数，利用浓度-效应函数的反函数进而计算得到不同受试样品溶液浓度下的效应值。
S2中，m一般取3，以保证实验的重复再现性和成本、效率达到平衡。
S2中，在36个第一微孔中分别加入200μL蒸馏水，可有效的克服实验中的边缘效应，大幅降低误差。
S2中的CH为通过预实验确定暴露96小时后最高受试样品溶液浓度，即对微板上蛋白核小球藻的生长抑制率(即最高抑制率)达到50～100％的受试样品溶液浓度。
S2中的CL为通过预实验确定暴露96小时后最低受试样品溶液浓度，即对微板上蛋白核小球藻的生长抑制率(即低抑制率)为-5％～+5％的受试样品溶液浓度。
优选地，S1中，所述培养得到OD690＝0.25-0.35的蛋白核小球藻液具体如下：在新鲜的培养基中接入蛋白核小球藻的藻种，使接种后蛋白核小球藻的OD690＝0.15±0.01，置于光照培养箱中进行培养，光照培养箱的温度为25±1℃，光照培养箱的光照度为5000lux，得到OD690＝0.25-0.35的蛋白核小球藻液。
培养过程中可能会因为环境等因素使得培养箱内部温度会稍高于或低于25℃，如果稍高于或低于25度，培养箱会自动降温或升温至25℃，但幅度不会超过1℃。
优选地，S2中，在任一个微板中，第二微孔为第6列和第7列所在列与第2行、第3行、第4行、第5行、第6行、第7行所在列相交的微孔，使得第二微孔位于每块微板的中央，可大大降低本发明的误差。
优选地，S2中，在任一个微板中，第三微孔中第j组的四个微孔为任一行与第2列、第3列、第8列和第9列相交的微孔，或为任一行与第4列、第5列、第10列和第11列相交的微孔，使第三微孔中的第j组均分布在第二微孔的两侧，大大降低了本发明的实验误差，而且大幅提高本发明的实验结果的再现性。
优选地，S3中，光照培养箱的培养条件为：光照培养箱的温度为25±1℃，光照培养箱的光照度为5000lux。
经过预实验可知蛋白核小球藻的紫外-可吸收光谱图如图2所示，蛋白核小球藻在波长为690nm光照环境下的OD值达到峰值，便于检测。
根据预实验中对蛋白核小球藻进行培养得到的生长速率和时间的数据在直角坐标系中进行曲线拟合，如图3所示，可以得出蛋白核小球藻在培养72h时达到最高值，即蛋白核小球藻在0-72h时一直处于对数增长期；继续培养，蛋白核小球藻的生长速率下降，当培养至96h时，蛋白核小球藻的生长速率与蛋白核小球藻的初始生长速率相同，即蛋白核小球藻在72-96h时处于静止期，如继续培养，则蛋白核小球藻进入衰落期，从而确定本发明在S3中对蛋白核小球藻检测时间为0-96h。
本发明可以测定部分抗生素、离子液体、重金属及其混合物的时间毒性。本发明与常规96小时的微板毒性分析法测定数据对比，发现这些化合物及其混合物的浓度-效应曲线(CRC)随着时间的延长，毒性在逐渐增加，但增加的速率不同。混合物的毒性相互作用规律也随着混合物的组分和暴露时间发生很大的变化，有的混合物随着暴露时间的延长，协同或拮抗作用逐渐增强，而有的混合物毒性相互作用随着时间甚至发生了作用类型的变化如从协同逐渐转变为拮抗或从拮抗逐渐转变为协同。本发明可以更为合理的评价污染物的毒性和揭示环境污染物毒性作用规律与机制。
附图说明
图1为本发明提出的一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法中96孔透明微板分组示意图，其中1为第一微孔，2为第二微孔，j＝1、2、…、12为第三微孔。
图2为蛋白核小球藻的紫外-可见吸收光谱图。
图3为蛋白核小球藻在微孔板上的同步生长速率图。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
采用本发明测定抗生素硫酸链霉素的时间毒性，包括以下步骤：
S1、在新鲜的培养基中接入蛋白核小球藻的藻种，使接种后蛋白核小球藻的OD690＝0.14，置于光照培养箱中进行培养，光照培养箱的温度为25±1℃，光照培养箱的光照度为5000lux，得到OD690＝0.35的蛋白核小球藻液；
S2、参照图1，图1为本发明提出的一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法中96孔透明微板分组示意图，取3个8行×12列的96孔透明微板；在任一个微板中，选取最外围的36个微孔并定义为第一微孔，在36个第一微孔中分别加入200μL蒸馏水，选取第6列和第7列所在列与第2行、第3行、第4行、第5行、第6行、第7行所在列相交形成的12个微孔定义为第二微孔，在12个第二微孔中分别加入100μL蒸馏水和100μL由S1得到的蛋白核小球藻液，将剩余48个微孔定义为第三微孔，将48个第三微孔均分为12组并分别标记为j＝1、2、…、12，向第j组的4个第三微孔中分别加入100μL浓度为Cj的硫酸链霉素溶液和100μL由S1得到的蛋白核小球藻液，其中第三微孔中第j组的四个微孔为任一行与第2列、第3列、第8列和第9列相交的微孔，或为任一行与第4列、第5列、第10列和第11列相交的微孔；
其中，Cj＝fj–1·C0，式中j为各组相应的标号，j＝1、2、…、12，C0为硫酸链霉素的储备液浓度，f为硫酸链霉素的稀释因子，而f可由公式f＝(CL/CH)1/(n-1)推导得到，式中CL为硫酸链霉素的最低效应浓度，CH为硫酸链霉素的最高效应浓度，n为硫酸链霉素溶液浓度梯度的数目，即n＝12，通过暴露96小时的预实验，得到硫酸链霉素溶液的储备液浓度C0为7.02×10-4mol/L，稀释因子f为0.6，从而确定硫酸链霉素溶液的12个浓度梯度；
S3、将3个微板置于光照培养箱中进行培养，光照培养箱的培养条件为：光照培养箱的温度为25±1℃，光照培养箱的光照度为5000lux，在培养Tx时，测定每个微板上第三微孔的j组在Tx时的OD690平均值并记为ODj组，x，并测定每个微板上第二微孔在Tx时的OD690平均值并记为OD空白，x，其中Tx＝0h、12h、24h、48h、72h、96h，x为正整数；
S4、根据公式μj，T＝(ODj组，x-ODj组，x-1)/ODj组，x计算得到浓度为Cj的硫酸链霉素处理蛋白核小球藻在T时的平均生长速率μj，T，根据公式μ0，T＝(OD空白，x-OD空白，x-1)/OD空白，x计算得到第二微孔中蛋白核小球藻在T时的平均生长速率μ0，T，式中x≥2；
以硫酸链霉素对蛋白核小球藻的生长速率μj，T的抑制率Ej，T为毒性效应，通过公式Ej，T＝(1-μj，T/μ0，T)×100％计算在培养时间为Tx时浓度为Cj的硫酸链霉素的毒性，得到硫酸链霉素的浓度-效应数据，对所述浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合得到浓度-效应函数，利用浓度-效应函数的反函数进而计算得到不同硫酸链霉素溶液浓度下的效应值即效应浓度，如半数效应浓度(EC50)，参照函数拟合的确定系数，以拟合值与实验值相关性最大，即拟合值与实际测试值均方根误差最小者为最优函数关系。
硫酸链霉素溶液各浓度在不同时间点时对蛋白核小球藻生长抑制率E的原始数据如表1所示。
表1 硫酸链霉素的时间-毒性数据
实施例2
采用本发明测定离子液体1-辛基咪唑氯的时间毒性的时间毒性，包括以下步骤：
S1、在新鲜的培养基中接入蛋白核小球藻的藻种，使接种后蛋白核小球藻的OD690＝0.16，置于光照培养箱中进行培养，光照培养箱的温度为25±1℃，光照培养箱的光照度为5000lux，得到OD690＝0.25的蛋白核小球藻液；
S2、参照图1，图1为本发明提出的一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法中96孔透明微板分组示意图，取3个8行×12列的96孔透明微板；在任一个微板中，选取最外围的36个微孔并定义为第一微孔，在36个第一微孔中分别加入200μL蒸馏水，选取第6列和第7列所在列与第2行、第3行、第4行、第5行、第6行、第7行所在列相交形成的12个微孔定义为第二微孔，在12个第二微孔中分别加入100μL蒸馏水和100μL由S1得到的蛋白核小球藻液，将剩余48个微孔定义为第三微孔，将48个第三微孔均分为12组并分别标记为j＝1、2、…、12，向第j组的4个第三微孔中分别加入100μL浓度为Cj的1-辛基咪唑氯溶液和100μL由S1得到的蛋白核小球藻液，其中第三微孔中第j组的四个微孔为任一行与第2列、第3列、第8列和第9列相交的微孔，或为任一行与第4列、第5列、第10列和第11列相交的微孔；
其中，Cj＝fj–1·C0，式中j为各组相应的标号，j＝1、2、…、12，C0为1-辛基咪唑氯的储备液浓度，f为1-辛基咪唑氯的稀释因子，而f可由公式f＝(CL/CH)1/(n-1)推导得到，式中CL为1-辛基咪唑氯的最低效应浓度，CH为1-辛基咪唑氯的最高效应浓度，n为1-辛基咪唑氯溶液浓度梯度的数目，即n＝12，通过暴露96小时的预实验，得到1-辛基咪唑氯溶液的储备液浓度C0为6.50×10-4mol/L，稀释因子f为0.6，从而确定1-辛基咪唑氯溶液的12个浓度梯度；
S3、将3个微板置于光照培养箱中进行培养，光照培养箱的培养条件为：光照培养箱的温度为25±1℃，光照培养箱的光照度为5000lux，在培养Tx时，测定每个微板上第三微孔的j组在Tx时的OD690平均值并记为ODj组，x，并测定每个微板上第二微孔在Tx时的OD690平均值并记为OD空白，x，其中Tx＝0h、12h、24h、48h、72h、96h，x＝1、2、3、4、5、6；
S4、根据公式μj，T＝(ODj组，x-ODj组，x-1)/ODj组，x计算得到浓度为Cj的1-辛基咪唑氯处理蛋白核小球藻在T时的平均生长速率μj，T，根据公式μ0，T＝(OD空白， x-OD空白，x-1)/OD空白，x计算得到第二微孔中蛋白核小球藻在T时的平均生长速率μ0，T，式中x≥2；
以1-辛基咪唑氯对蛋白核小球藻的生长速率μj，T的抑制率Ej，T为毒性效应，通过公式Ej，T＝(1-μj，T/μ0，T)×100％计算在培养时间为Tx时浓度为Cj的1-辛基咪唑氯的毒性，得到1-辛基咪唑氯的浓度-效应数据，对所述浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合得到浓度-效应函数，利用浓度-效应函数的反函数进而计算得到不同1-辛基咪唑氯溶液浓度下的效应值即效应浓度，如半数效应浓度(EC50)，参照函数拟合的确定系数，以拟合值与实验值相关性最大，即拟合值与实际测试值均方根误差最小者为最优函数关系。
1-辛基咪唑氯溶液各浓度在不同时间点时对蛋白核小球藻生长抑制率E的原始数据如表2所示。
表2 离子液体1-辛基咪唑氯的时间-毒性数据
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、培养得到OD690＝0.25-0.35的蛋白核小球藻液；
S2、取m个8行×12列的96孔透明微板；在任一个微板中，选取最外围的36个微孔并定义为第一微孔，在36个第一微孔中分别加入200μL蒸馏水，在外围之内选取12个微孔并定义为第二微孔，在12个第二微孔中分别加入100μL蒸馏水和100μL由S1得到的蛋白核小球藻液，将剩余48个微孔定义为第三微孔，将48个第三微孔均分为12组并分别标记为j＝1、2、…、12，向第j组的4个第三微孔中分别加入100μL浓度为Cj的受试样品溶液和100μL由S1得到的蛋白核小球藻液；
其中，Cj＝fj–1·C0，式中j为各组相应的标号，j＝1、2、…、12，C0为受试样品的储备液浓度，f为受试样品的稀释因子，而f可由公式f＝(CL/CH)1/(n-1)推导得到，式中CL为受试样品的最低效应浓度，CH为受试样品的最高效应浓度，n为受试样品溶液浓度梯度的数目，即n＝12；
S3、将m个微板置于光照培养箱中进行培养，在培养Tx时，测定每个微板上第三微孔的j组在Tx时的OD690平均值并记为ODj组，x，并测定每个微板上第二微孔在Tx时的OD690平均值并记为OD空白，x，其中Tx＝0h、t h、2t h、4t h、6t h、…、96h，x为正整数；
S4、根据公式μj，T＝(ODj组，x-ODj组，x-1)/ODj组，x计算得到浓度为Cj的受试样品处理蛋白核小球藻在T时的平均生长速率μj，T，根据公式μ0，T＝(OD空白，x-OD空白，x-1)/OD空白，x计算得到第二微孔中蛋白核小球藻在T时的平均生长速率μ0，T，式中x≥2；
以受试样品对蛋白核小球藻的生长速率μj，T的抑制率Ej，T为毒性效应，通过公式Ej，T＝(1-μj，T/μ0，T)×100％计算在培养时间为Tx时浓度为Cj的受试样品的毒性，得到受试样品的浓度-效应数据，对所述浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合得到浓度-效应函数，利用浓度-效应函数的反函数进而计算得到不同受试样品溶液浓度下的效应值。
2.根据权利要求1所述基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法，其特征在于，S1中，所述培养得到OD690＝0.25-0.35的蛋白核小球藻液具体如下：在新鲜的培养基中接入蛋白核小球藻的藻种，使接种后蛋白核小球藻的OD690＝0.15±0.01，置于光照培养箱中进行培养，光照培养箱的温度为25±1℃，光照培养箱的光照度为5000lux，得到OD690＝0.25-0.35的蛋白核小球藻液。
3.根据权利要求1或2所述基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法，其特征在于，S2中，在任一个微板中，第二微孔为第6列和第7列所在列与第2行、第3行、第4行、第5行、第6行、第7行所在列相交的微孔。
4.根据权利要求1或2或3所述基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法，其特征在于，S2中，在任一个微板中，第三微孔中第j组的四个微孔为任一行与第2列、第3列、第8列和第9列相交的微孔，或为任一行与第4列、第5列、第10列和第11列相交的微孔。
5.根据权利要求1-4任一项所述基于蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析方法，其特征在于，S3中，光照培养箱的培养条件为：光照培养箱的温度为25±1℃，光照培养箱的光照度为5000lux。
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