CN111796086A - 一种个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法 - Google Patents

一种个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于环境科学与工程领域，公开了一种个人护理品急慢性剂量‑效应关系表征方法。主要包括以下步骤：获取稀释因子微板测试；确定S形和J形剂量‑效应关系稀释因子；进行剂量‑效应曲线拟合；绘制三维剂量‑效应曲线图。本发明的方法有利于研究未知组分未知浓度商品类实际环境污染物的剂量‑效应关系。

Description

一种个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法
技术领域
本发明属于环境科学与工程领域，具体地说，涉及一种个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法。
背景技术
个人护理品含日常生活中常见的护肤品、香水、抗紫外剂、防腐剂、杀虫剂、消毒剂等，护肤品包括大量化工合成的不同功能类型化妆洗护产品，比如市面上琳琅满目的化妆水、护肤水、保湿霜、洗面奶、洗发水、沐浴露、防晒霜等产品。根据国家统计局国家数据显示，2018年全年化妆品类成交额299.29亿元(http://data.stats.gov.cn/easyquery.htm？cn＝C01)。个人护理品已在不同国家地区的各种环境基质被检测出，已经成为自然环境中具有潜在生态风险的一类新型污染物。
国内外越来越多的研究表明，个人护理品中存在的活性成分会对人体、水生生态系统产生负面影响，特别是与内分泌干扰和生殖障碍有关。对羟基苯甲酸酯作为防腐剂被广泛用于化妆品中，也用于儿童产品，有些允许在食品中添加使用，有研究表明年幼的雄性大鼠口服长链对羟基苯甲酸酯会对精子和睾酮水平产生不利影响(OISHI S.Effects ofpropyl paraben on the male reproductive system.Food and Chemical Toxicology[J]；2002；40(12):1807-13)；三氯生(TCS)是一种高效的广谱抗菌剂，广泛用于个人护理品和工业产品中，在水体和陆生环境及生物体内均被检测到，可对水生生物特别是藻类产生较高的急性毒性(高海萍,周雪飞,张亚雷等.三氯生对水生生物的毒性效应研究进展.环境化学[J]；2012；08:1145-50)；二苯甲酮类紫外防晒剂安全性系数比较高,防晒的效果也比较明显，而且制造成本要比较低，所以被广泛应用在化妆品和个人护理品中，研究表明紫外防晒剂对生殖系统、青春期发育、子代成活率等方面有一定影响(KUNZ P Y,FENTK.Estrogenic activity of ternary UV filter mixtures in fish(Pimephalespromelas)-An analysis with nonlinear isobolograms.Toxicol Appl Pharmacol[J],2009,234(1):77-88)。以上研究均基于个人护理品中单个活性成分，且实验浓度往往高于环境中检出浓度。然而，实际环境体系中的化学品不是孤立的，而是以低浓度化学混合物的形式共存的。
毒物对生物的效应不仅取决于剂量还与暴露时间有关，朱祥伟等人以青海弧菌为指示生物，测定了6种除草剂的急性毒性(15分钟)和长期毒性(12h)，对比发现环嗪酮、扑灭通和嗪草酮对青海弧菌的长期毒性大于其急性毒性，而氨基三嗪只有长期毒性没有短期毒性(Zhu X.W.,Liu S.S.,Ge H.L.,et al.Comparison between the short-term and thelong-term toxicity of six triazine herbicides on photobacteria Q67.WaterResearch[J],2009,43(6):1731-9)；刘玲等发现抗生素的长期毒性高于其短期毒性(LiuL.,Liu S.S.,Yu M.,et al.Application of the combination index integrated withconfidence intervals to study the toxicological interactions of antibioticsand pesticides in Vibrio qinghaiensis sp.-Q67.Environmental toxicology andpharmacology[J],2015,39(1):447-56)；樊烨等人发现农药(甲霜灵和吡虫啉)的毒性随时间基本不变，离子液体(1-己基-3-甲基-咪唑溴和1-己基-3-甲基-咪唑氯)的毒性随时间增加而降低之后基本不变，而抗生素(氯霉素和硫酸多粘菌素B)的毒性开始随时间增加而增加之后基本保持不变(Fan Y.,Liu S.S,Qu R.,et al.Polymyxin B sulfate inducingtime-dependent antagonism of the mixtures of pesticide,ionic liquids,andantibiotics to Vibrio qinghaiensis sp.-Q67.RSC Adv[J],2017,7(10):6080-8)。以上研究均说明环境中各化学物质对生物的影响往往是长期积累的，采用短长期毒性分析方法能更全面的表征环境中污染物对生物体的毒性效应。
以淡水发光菌青海弧菌Q67为受试生物的毒性测试法，例如国家环保部颁布的测定水质急性毒性(0.25h)的发光细菌法国家标准(GB/T 15441-1995水质急性毒性的测定发光细菌法[S]；1995)，短长期微板毒性分析方法(0.25h和12h)(朱祥伟,刘树深,张琼,刘堰.杀虫剂及抗生素对发光菌的短期毒性与长期毒性.环境科学研究[J],2009,22(05):589-594)，时间毒性微板分析法(0.25h-12h)(林楠；张晶；刘树深.污染物对青海弧菌Q67时间依赖微板毒性分析.中国科技论文在线精品论文[J].2013,6(24),2321-2328)等因快速、简便、灵敏、稳定、经济而受到关注。因此，青海弧菌Q67已长期广泛的应用于环境污染物的毒性检测。
然而，到目前为止，尚未有关于市面上各类个人护理品的急慢性毒性测试及剂量-效应关系表征方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种毒性测试方法，尤其是针对护肤品类商品的毒性测试方法。
为了提供一种适于个人护肤用品的急慢性毒性测试及剂量-效应关系表征方法，本发明将直接选取市售护肤品为研究对象，通过对其进行统一浓度单位，以青海弧菌Q67为受试生物，基于短长期微板毒性分析方法，获取急慢性浓度-效应曲线，为市面上各类护肤用品提供急慢性毒性测试及剂量-效应关系表征方法。
一方面，本发明提供了一种个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法，所述的个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法包括以下步骤：
稀释因子微板测试；
确定稀释因子；
进行剂量-效应曲线拟合；
绘制三维剂量-效应曲线图。
所述的稀释因子微板测试包括以下步骤：
稀释透明液状样品；
加入不同体积受试液；
加入等体积的青海弧菌Q67菌液；
分别于急性暴露时间(例如0.25小时)和慢性暴露时间(例如12小时)收样，读取菌液发光度。
具体而言，所述的稀释因子微板测试包括以下步骤：首先选取透明液状溶于水的护肤品放置于22℃房间，直接将其当储备液1，依次将护肤品稀释10倍和100倍和1000倍得到储备液2,3,4且都置于相同温度房间，稀释过的样品储存时限为3天，以96孔微板为载体，实验组用10μL-100μL量程12道移液枪依次取100μL、50μL、20μL储备液1分别加入到不同微孔中，每个体积3次平行并排列在同一列三个孔中，接着重复上述步骤分别取出稀释10倍和100倍相同体积的储备液2和3加入同一块96孔微板中，不足100μL的孔中加入对应的超纯水，比如50μL溶液中加入50μL超纯水，以此类推，共9个实验组；对照组加入100μL超纯水，然后在对照组和实验组中各加入100μL培养好的青海弧菌Q67菌液，从加菌液开始计时，静置于22℃房间，急性暴露时间为0.25h，慢性暴露时间为12h，用酶标仪分别读取暴露0.25h和12h对照组和实验组发光度。
所述的确定稀释因子包括：计算实验孔和对照孔的发光抑制率，所述的发光抑制率＝(对照组发光度-实验组发光度/对照组发光度)*100％；根据慢性暴露时间的发光抑制率确定稀释因子。
对于S形单调剂量-效应关系，稀释因子的计算公式为，df＝(Cmax/Cmin)1/(n-1)，
其中实验点(即浓度点)共设置n个，n是不小于9的正整数，Cmax为最大效应浓度，Cmin为最低抑制率浓度；
对于J形非单调剂量-效应关系，除满足抑制区域浓度点外，还要确定包含最大刺激效应浓度点一般为C10或C9)和接近原点的浓度点(C12)，稀释因子DF＝(Cmax/Cmin)1/(n-1)；
其中，总浓度点为n个，采用Cn＝C0*(DF)n-1，n＝1,2，…，n，C0对应最大效应浓度Cmax，Cn对应最低抑制率时的浓度。
具体包括如下步骤：用移液枪吸取1mL护肤品原液并称取其质量，确定护肤品浓度(单位：g/mL)，则各孔浓度单位可根据加入体积得到；发光抑制率I0＝(对照组发光度-实验组发光度/对照组发光度)*100％，发光抑制率可正可负；不同浓度发光抑制率为3孔的平均值，根据12h发光抑制率确定S形(df)和J形稀释因子(DF)；对于S形单调剂量-效应关系即I0全为正数时，确定5％-95％的发光抑制率浓度区间，即确定对应最低抑制率浓度(Cmin)和最大抑制率浓度(Cmax)，实验点共设置12个，则Cmin＝Cmax*(df)11，Cmax为最大效应浓度，进而确定稀释因子df＝(Cmax/Cmin)1/11；对于J形非单调剂量-效应关系即I0既有正数又有负数时，除满足抑制区域浓度点外，还要确定包含最大刺激效应浓度点和接近原点的浓度点，总浓度点依然为12个，采用Cn＝C0*(DF)n-1，n＝1,2，…，12，C0对应最大效应浓度Cmax，Cn对应最低抑制率时的浓度，则稀释因子DF＝(Cmax/Cmin)1/(n-1)。
所述的进行剂量-效应曲线拟合包括如下步骤：
根据稀释因子计算各个实验浓度点需加入护肤品体积，若体积小于10μL时采用将护肤品原液稀释10倍或100倍或1000倍的方法制备受试液，采用短长期微板毒性分析方法，获取不同浓度点在急性时间点和慢性时间点对应的浓度-效应数据，即剂量-效应数据；
针对S形剂量-效应关系，对该浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合；
针对J形剂量-效应关系，采用两个Hill函数结合的模型对该浓度-效应数据进行拟合；
获得样品的浓度-效应曲线模型，计算半抑制效应浓度EC50。
所述的进行剂量-效应曲线拟合包括如下步骤：首先根据确定的稀释因子计算12个实验浓度点需加入护肤品体积，若体积小于10μL时采用将护肤品原液稀释10倍或100倍或1000倍的方法制备受试液，采用短长期微板毒性分析方法，每次每板每浓度3个平行，至少重复3块板，获取12个不同浓度点在0.25h和12h对应的浓度-效应数据，实验组抑制率为每一受试样品浓度的3个平行微孔测试所得发光抑制率的平均值，即为受试样品12个浓度点的浓度-效应数据；针对S形剂量-效应关系，对该浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合；针对J形剂量-效应关系，抑制率大于0浓度区间与抑制率小于0浓度区间同时存在，采用两个Hill函数结合的模型对该浓度-效应数据进行拟合；进而得到护肤品在任一时间完整的浓度-效应曲线模型，计算半抑制效应浓度EC50(g/mL)。
所述的绘制三维剂量-效应曲线图包括如下步骤：
以浓度取对数为X轴，生物发光抑制率为Y轴，时间为Z轴，同时绘制急性时间点和慢性时间点对应的三维平面浓度-效应关系曲线图。
优选的，所述的稀释因子用于表征S形或者J形剂量-效应关系。
具体的，绘制三维剂量-效应曲线图包括如下步骤：根据步骤③得到的剂量-效应模型，获取12个浓度-效应拟合值，以浓度(g/mL)取对数为X轴，生物发光抑制率为Y轴，时间为Z轴，为在Origin软件同时绘制0.25h和12h的三维平面浓度-效应关系曲线图，J形曲线同时跨越Y轴负半轴和正半轴，从完整的剂量-效应曲线，以g/mL为浓度单位统一量化表征各护肤品急慢性毒性变化。
另一方面，本发明提供了所述的个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法的应用，可以用于构建急慢性剂量-效应关系模型、检测急慢性毒性效应、检测剂量-毒性效应、预判急慢性条件下达到预期毒性效应的剂量值、急慢性毒性全面实验测试或者评估急慢性剂量条件下的毒性效应。
针对传统化学品毒性测试浓度不符合实际环境浓度，仅限于以标准品为研究对象，人为设计混合物组分及浓度，无法表征实际混合物浓度-效应关系等不足之处。本发明提供了一种市面上护肤品类商品毒性测试方法，可用于研究各类护肤品的剂量-效应曲线如何随时间变化。该方法不仅可以帮助护肤品进行实验浓度设计，也可以完成护肤品类商品从定性到定量的表征，为实际环境样品风险评估提供合理的科学指导。
本发明还提供了一种个人护理品表征急慢性剂量-效应关系的试剂盒，所述的试剂盒包括：
测试稀释因子的微板；
青海弧菌Q67菌液；
S形和J形三维剂量-效应曲线的绘制说明或者产品说明书。
较好的，该试剂盒还包括样品稀释液、阴性对照、阳性对照、超纯水、操作手册、反应容器中的一种或者几种。
更好的，该试剂盒还包括计时器、计算器、温度计、常规操作所需的软件、App或者小程序的链接，等等。
针对个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法主要包括以下步骤：①获取稀释因子微板测试；②确定S形和J形剂量-效应关系稀释因子；③进行剂量-效应曲线拟合；④绘制三维剂量-效应曲线图。
所述步骤①包括如下步骤：首先选取透明液状溶于水的护肤品放置于22℃房间，直接将其当储备液1，依次将护肤品稀释10倍和100倍和1000倍得到储备液2、储备液3、储备液4，置于相同温度房间，稀释过的样品储存时限为3天，以96孔微板为载体，如图1所示，实验组用10μL-100μL量程12道移液枪依次取100μL、50μL、20μL储备液1分别加入B1-D1，B2-D2，B3-D3中，也可用单道移液枪取样，每个体积3次平行并排列在同一列3个孔中，接着重复上述步骤分别取出稀释10倍和100倍的储备液2,3以相同体积加入同一块96孔微板中，即储备液2加入B4-D4，B5-D5，B6-D6中，储备液3加入B7-D7，B8-D8，B9-D9中，相应的A1-A9作为对照组，不足100μL的孔中加入对应的超纯水，比如50μL溶液中加入50μL超纯水，以此类推，共9个实验组(9个实验组，原液3个，稀释10倍的三个，稀释100倍的3个)；对照组加入100μL超纯水和100μLQ67菌液，总体积共200μL；实验组中加入100μL培养好的青海弧菌Q67菌液，每个实验组样品、超纯水、Q67菌液体积共200μL，如图1所示，从加菌液开始计时，静置于22℃房间，急性暴露时间为0.25h，慢性暴露时间为12h，用酶标仪分别读取暴露0.25h和12h对照组和实验组发光度，酶标仪检测区域取决于加样孔位置。每次可同时进行多样品稀释因子微板测试。
步骤②包括如下步骤：用移液枪吸取1mL护肤品原液并称取其质量，确定护肤品浓度(单位：g/mL)，则各孔浓度单位可根据加入体积得到；发光抑制率I0＝(对照组发光度-实验组发光度/对照组发光度)*100％，发光抑制率可正可负；不同浓度发光抑制率为3孔的平均值(也可大于3孔)，根据12h发光抑制率确定S形和J形稀释因子；对于S形单调剂量-效应关系即I0全为正数时，确定5％-95％的发光抑制率浓度区间，即确定对应最低抑制率浓度(Cmin，相对应的发光抑制率为5％)和最大抑制率浓度(Cmax，相对应的发光抑制率为95％)，实验点共设置12个，则Cmin＝Cmax*(df)11，Cmax为最大效应浓度，进而确定稀释因子df＝(Cmax/Cmin)1/11；对于J形非单调剂量-效应关系即I0既有正数又有负数时，除满足抑制区域浓度点外，还要确定包含最大刺激效应浓度点和接近原点的浓度点，总浓度点依然为12个，采用Cn＝C0*(DF)n-1，n＝1,2，…，12，C0对应最大效应浓度Cmax，Cn对应最低抑制率时的浓度，则稀释因子DF＝(Cmax/Cmin)1/(n-1)。发光抑制率计算可在Excel完成，稀释因子计算可在APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)或MATLAB或Excel等软件进行，每个样品稀释因子可取多个同时进行实验。
步骤③包括如下步骤：首先根据步骤②确定的稀释因子计算12个实验浓度点需加入护肤品体积，若体积小于10μL时采用将护肤品原液稀释10倍或100倍或1000倍的方法制备受试液，采用短长期微板毒性分析方法(朱祥伟,刘树深,张琼,刘堰.杀虫剂及抗生素对发光菌的短期毒性与长期毒性.环境科学研究[J],2009,22(05):589-594)，如图2所示，每次每板每浓度3个平行，至少重复3块板，获取12个不同浓度点在0.25h和12h对应的浓度-效应数据(见图2)，可选择在APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)或Excel软件计算，实验组抑制率为每一受试样品浓度的3个平行微孔测试所得发光抑制率的平均值，即为受试样品12个浓度点的浓度-效应数据；针对S形剂量-效应关系，可在APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中选择Weibull函数、Logit函数、Hill函数，MATLAB软件，R语言等对该浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合；针对J形剂量-效应关系，抑制率大于0浓度区间与抑制率小于0浓度区间同时存在，可采用JSFit软件(软著登字第3123293号，登记号2018SR794198)中5参数、6参数、7参数模型对该浓度-效应数据进行拟合；进而得到护肤品在任一时间完整的浓度-效应曲线模型，计算半抑制效应浓度EC50(g/mL)，也可计算任一效应对应的浓度或任一浓度对应的效应。为避免边缘水效应，最外围一圈加入200μL超纯水；B2-G2、B6-G6、B7-G7、B11-G11为对照组；B3-B5依次到G8-G10为12个实验组，浓度从大到小排列。
步骤④包括如下步骤：根据步骤③得到的剂量-效应关系，获取12个浓度-效应拟合值，以浓度(g/mL)取对数为X轴，生物发光抑制率为Y轴，时间为Z轴，为在Origin软件同时绘制0.25h和12h的三维平面浓度-效应关系曲线图，也可利用超过12个浓度效应-数据点进行作图，J形曲线同时跨越Y轴负半轴和正半轴，从完整的剂量-效应曲线，以g/mL为浓度单位统一量化表征各护肤品急慢性毒性变化，也可选择Excel、R语言、MATLAB等软件作图。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
1、本发明方法通过采用市售护肤品类商品直接进行实验，避免传统方法中只研究活性成分毒性的缺点，减小了人为设计混合物组分及浓度配比用于实验测试产生的误差，可以同时进行多种市售护肤产品测试，大大缩短实验时间，减小成分检测花费。
2、本发明方法可针对拥有不同剂量-效应关系的市面上多类护肤产品，帮助获取各产品稀释因子，提供科学的毒性实验设计指导，完成急慢性毒性全面实验测试，从而获得多浓度下的效应数据，建立稳定的拟合模型。
3、本发明方法通过量化护肤品类商品浓度，统一浓度单位，避免无法表征实际混合物浓度-效应关系的缺点，完成护肤品类商品从定性到定量的表征，为实际环境样品风险评估提供合理的科学指导。
4、本发明方法采用绘制三维剂量-效应图，将时间因素引入作图，避免二维作图无法直观显示护肤品在不同暴露时间的毒性变化规律，填补了这一研究领域的空白。
附图说明
图1获取稀释因子加板示意图。
图2实验孔安排示意图。
图3为阿迪达斯(Adidas)男士舒润肌能水三维剂量-效应曲线图。
图4为资生堂水之印弹力胶原保湿水三维剂量-效应曲线图。
图5为姬芮(Za)多元水活盈润化妆水三维剂量-效应曲线图。
具体实施方式
下文将更详细地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同形式实现，并且不应解释为受在此提出之实施例的限制。相反，提出这些实施例是为了达成充分及完整公开，并且使本技术领域的技术人员完全了解本发明的范围。
【实施例1】阿迪达斯(Adidas)男士舒润肌能水急慢性剂量-效应关系表征
(1)从品牌官网购买阿迪达斯(Adidas)男士舒润肌能水，并储藏于22℃房间，将原液直接当做储备液1，分别稀释10倍和100倍和1000倍得到储备液2,3,4，并置于相同温度房间，稀释过的样品储存时限为3天，以96孔微板为载体，按图1所示加板，实验组用10μL-100μL量程12道移液枪依次取100μL、50μL、20μL各储备液分别加入到B1-D1，B2-D2，B3-D3中，也可用单道移液枪取样，每个体积至少3次重复并排在同一列3个孔中，也可横排，接着重复上述步骤分别取出稀释10倍和100倍的储备液2,3以相同体积加入同一块96孔微板中，即储备液2加入B4-D4，B5-D5，B6-D6中，储备液3加入B7-D7，B8-D8，B9-D9中，相应的A1-A9作为对照组，不足100μL的孔中加入对应的超纯水，比如50μL受试液中加入50μL超纯水，20μL受试液中加入80μL超纯水，共9个实验组，也可拓展实验组数；对照组加入100μL超纯水，然后在对照组和实验组中用量程为10-100μL的12道移液枪各加入100μL培养好的青海弧菌Q67菌液，样品、超纯水、Q67菌液体积共200μL，实验组和对照组每样可加样超过3孔，从加菌液开始计时，急性暴露时间为0.25h，慢性暴露时间为12h，全称暴露皆在22℃房间，用酶标仪分别读取暴露0.25h和12h对照组和实验组生物发光度。
(2)称取1mL阿迪达斯(Adidas)男士舒润肌能水原液质量9.859E-01g，得到其浓度为9.859E-01g/mL。以其为基准，则各孔浓度单位可根据加入体积得到，各孔浓度从大到小依次为4.929E-01g/mL，2.465E-01g/mL，9.859E-02g/mL，4.929E-02g/mL，2.465E-02g/mL，9.859E-03g/mL，4.929E-03g/mL，2.465E-03g/mL，9.859E-04g/mL，发光抑制率I0＝(对照组发光度-实验组发光度/对照组发光度)*100％，不同浓度发光抑制率为3孔的平均值(也可大于3孔)，根据12h发光抑制率出现小于0情况，判定此时护肤品对应J形非单调剂量-效应关系，此时将最大浓度4.929E-01g/mL作为第1个实验点，最低浓度9.859E-04g/mL作为第12个浓度点，则在MATLAB计算稀释因子DF＝(9.859E-04/4.929E-01)1/(12-1)，即DF＝0.5684，为了方便实验DF取0.57。此外，发光抑制率计算可在Excel完成，稀释因子计算可在APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)或MATLAB或Excel等软件进行，每个样品稀释因子可取多个同时进行实验。
(3)首先根据步骤②确定的稀释因子DF＝0.57计算12个实验浓度点从大到小依次为4.929E-01，2.810E-01，1.577E-01，8.873E-02，4.929E-02，2.859E-02，1.627E-02，9.366E-03，5.422E-03，2.958E-03，1.479E-03，9.859E-04，单位g/mL，需加入护肤品体积依次对应为100，57，32.49，18.5193，10.556001，6.01692057，3.429644725，1.954897493，1.114291571，0.635146196，0.362033331，0.206358999(μL)，当加入原液即储备液1体积小于10μL时，通过将储备液1稀释10倍即储备液2进行实验加板，当加入原液体积小于1μL时，通过将原液稀释100倍即储备液3进行加板，则本实验将把阿迪达斯(Adidas)男士舒润肌能水分别稀释10倍、100倍准备储备液2和储备液3，为减小实验误差，体积都取整数，采用短长期微板毒性分析方法(朱祥伟,刘树深,张琼,刘堰.杀虫剂及抗生素对发光菌的短期毒性与长期毒性.环境科学研究[J],2009,22(05):589-594)，如图2所示，则最后加样则根据：前五个浓度点体积100,57,32，19,11(μL)使用储备液1加板；第6个至第9个浓度点体积为60,34,20,11(μL)用储备液2加板；后3个浓度点体积64,36,21(μL)则采用储备液3加板；每次每板每浓度3个平行，至少重复3块板，获取12个不同浓度点在0.25h和12h对应的浓度-效应数据，在APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)进行计算，也可选择Excel软件计算，实验组抑制率为每一受试样品浓度的3个平行微孔测试所得发光抑制率的平均值，即为受试样品12个浓度点的浓度-效应数据，采用JSFit进行S形和J形剂量-效应曲线拟合，急慢性EC50分别为1.362E-01g/mL和1.239E-01g/mL，也可计算任一效应对应的浓度或任一浓度对应的效应。针对S形剂量-效应关系，也可采用APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)，MATLAB软件，R语言等对该浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合。
(4)首先根据步骤(3)得到的剂量-效应模型，获取0.25h和12h的12个浓度-效应拟合值(表1)，以浓度(g/mL)取对数为X轴，生物发光抑制率为Y轴，时间为Z轴，为在Origin软件同时绘制0.25h和12h的三维平面浓度-效应关系曲线图(图3)，也可利用超过12个浓度效应-数据点进行作图，J形曲线同时跨越Y轴负半轴和正半轴，从完整的剂量-效应曲线，以g/mL为浓度单位统一量化表征各护肤品急慢性毒性变化，也可选择Excel、R语言、MATLAB等软件作图。
【实施例2】资生堂水之印弹力胶原保湿水急慢性剂量-效应关系表征
(1)从品牌官网购买资生堂水之印弹力胶原保湿水，并储藏于22℃房间，将原液直接当做储备液1，分别稀释10倍和100倍和1000倍得到储备液2,3,4，并置于相同温度房间，稀释过的样品储存时限为3天，以96孔微板为载体，按图1所示加板，实验组用10μL-100μL量程12道移液枪依次取100μL、50μL、20μL各储备液1分别加入到B1-D1，B2-D2，B3-D3中，也可用单道移液枪取样，每个体积至少3次重复并排在同一行3个孔中，也可竖排，接着重复上述步骤分别取出稀释10倍和100倍的储备液2,3以相同体积加入同一块96孔微板中，即储备液2加入B4-D4，B5-D5，B6-D6中，储备液3加入B7-D7，B8-D8，B9-D9中，相应的A1-A9作为对照组，不足100μL的孔中加入对应的超纯水，比如50μL受试液中加入50μL超纯水，20μL受试液中加入80μL超纯水，共9个实验组，也可拓展实验组数；对照组加入100μL超纯水，然后在对照组和实验组中用量程为10-100μL的12道移液枪各加入100μL培养好的青海弧菌Q67菌液，样品、超纯水、Q67菌液体积共200μL，实验组和对照组每样可加样超过3孔，从加菌液开始计时，急性暴露时间为0.25h，慢性暴露时间为12h，全称暴露皆在22℃房间，用酶标仪分别读取暴露0.25h和12h对照组和实验组生物发光度。
(2)称取1mL资生堂水之印弹力胶原保湿水原液质量0.97447E-01g，得到其浓度为0.97447E-01g/mL，则各孔浓度单位可根据加入体积得到，则各孔浓度从大到小依次为4.872E-01，2.436E-01，9.745E-02，4.872E-02，2.436E-02，9.745E-03，4.872E-03，2.436E-03，9.745E-04，单位(g/mL)，发光抑制率I0＝(对照组发光度-实验组发光度/对照组发光度)*100％，不同浓度发光抑制率为3孔的平均值(也可大于3孔)，根据12h发光抑制率出现小于0情况，判定此时护肤品对应J形非单调剂量-效应关系，此时将最大浓度4.872E-01g/mL作为第1个实验点，最低浓度9.745E-04g/mL作为第6个浓度点，则在MATLAB计算稀释因子DF＝(9.745E-04/4.872E-01)1/(6-1)，即DF＝0.5493，为了方便实验DF取0.55。此外，发光抑制率计算可在Excel完成，稀释因子计算可在APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)或MATLAB或Excel等软件进行，每个样品稀释因子可取多个同时进行实验。
(3)首先根据步骤②确定的稀释因子DF＝0.55计算12个实验浓度点从大到小依次为6.821E-04，1.218E-03，2.241E-03，4.093E-03，7.309E-03，1.364E-02，2.436E-02，4.483E-02，8.283E-02，1.462E-01，2.680E-01，4.872E-01，单位g/mL，需加入护肤品体积依次对应为100，55，30.25，16.6375，9.15063，5.03284，2.76806，1.52244，0.83734，0.46054，0.2533，0.13931(μL)，当加入原液即储备液1体积小于10μL时，通过将储备液1稀释10倍得到储备液2进行实验加板，当加入储备液1体积小于1μL时，通过将原液稀释100倍得到储备液3进行加板，则本实验将把资生堂水之印弹力胶原保湿水分别稀释10倍、100倍准备储备液2和储备液3，为减小实验误差，体积都取整数，采用短长期微板毒性分析方法(朱祥伟,刘树深,张琼,刘堰.杀虫剂及抗生素对发光菌的短期毒性与长期毒性.环境科学研究[J],2009,22(05):589-594)，如图2所示，则最后加样则根据：前4个浓度点体积100，55，30，17(μL)使用储备液1加板；第5个至第8个浓度点体积为92，50，28，15(μL)用储备液2加板；后4个浓度点体积84，46，25，14(μL)则采用储备液3加板；每次每板每浓度3个平行，至少重复3块板，获取12个不同浓度点在0.25h和12h对应的浓度-效应数据，在APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)进行计算，也可选择Excel软件计算，实验组抑制率为每一受试样品浓度的3个平行微孔测试所得发光抑制率的平均值，即为受试样品12个浓度点的浓度-效应数据，采用JSFit进行S形和J形剂量-效应曲线拟合，急慢性EC50分别为1.299E-01g/mL和1.194E-01g/mL，也可计算任一效应对应的浓度或任一浓度对应的效应。针对S形剂量-效应关系，也可采用APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)，MATLAB软件，R语言等对该浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合。
(4)首先根据步骤(3)得到的剂量-效应模型，获取0.25h和12h的12个浓度-效应拟合值(表2)，以浓度(g/mL)取对数为X轴，生物发光抑制率为Y轴，时间为Z轴，为在Origin软件同时绘制0.25h和12h的三维平面浓度-效应关系曲线图(图4)，也可利用超过12个浓度效应-数据点进行作图，J形曲线同时跨越Y轴负半轴和正半轴，从完整的剂量-效应曲线，以g/mL为浓度单位统一量化表征各护肤品急慢性毒性变化，也可选择Excel、R语言、MATLAB等软件作图。
【实施例3】姬芮(Za)多元水活盈润化妆水急慢性剂量-效应关系表征
(1)从品牌官网购买姬芮(Za)多元水活盈润化妆水，并储藏于22℃房间，将原液直接当做储备液1，分别稀释10倍和100倍和1000倍得到储备液2,3,4，并置于相同温度房间，稀释过的样品储存时限为3天，以96孔微板为载体，按图1所示加板，实验组用10μL-100μL量程12道移液枪依次取100μL、50μL、20μL各储备液1分别加入到B1-D1，B2-D2，B3-D3中，也可用单道移液枪取样，每个体积至少3次重复并排在同一行3个孔中，也可竖排，接着重复上述步骤分别取出稀释10倍和100倍的储备液2,3以相同体积加入同一块96孔微板中，即储备液2加入B4-D4，B5-D5，B6-D6中，储备液3加入B7-D7，B8-D8，B9-D9中，相应的A1-A9作为对照组，不足100μL的孔中加入对应的超纯水，比如50μL受试液中加入50μL超纯水，20μL受试液中加入80μL超纯水，共9个实验组，也可拓展实验组数；对照组加入100μL超纯水，然后在对照组和实验组中用量程为10-100μL的12道移液枪各加入100μL培养好的青海弧菌Q67菌液，样品、超纯水、Q67菌液体积共200μL，实验组和对照组每样可加样超过3孔，从加菌液开始计时，急性暴露时间为0.25h，慢性暴露时间为12h，全称暴露皆在22℃房间，用酶标仪分别读取暴露0.25h和12h对照组和实验组生物发光度。
(2)称取1mL姬芮(Za)多元水活盈润化妆水原液质量，得到其浓度为9.865E-01g/mL，则各孔浓度单位可根据加入体积得到，则各孔浓度从大到小依次为4.932E-01，2.466E-01，9.865E-02，4.932E-02，2.466E-02，9.865E-03，4.932E-03，2.466E-03，9.865E-04，单位(g/mL)，发光抑制率I0＝(对照组发光度-实验组发光度/对照组发光度)*100％，不同浓度发光抑制率为3孔的平均值(也可大于3孔)，根据12h发光抑制率出现小于0情况，判定此时护肤品对应J形非单调剂量-效应关系，此时将最大浓度4.932E-01g/mL作为第1个实验点，最低浓度9.865E-04g/mL作为第6个浓度点，则在MATLAB计算稀释因子DF＝(9.865E-04/4.932E-01)1/(6-1)，即DF＝0.5493，为了方便实验DF取0.55。此外，发光抑制率计算可在Excel完成，稀释因子计算可在APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)或MATLAB或Excel等软件进行，每个样品稀释因子可取多个同时进行实验。
(3)首先根据步骤②确定的稀释因子DF＝0.55计算12个实验浓度点从大到小依次为6.905E-04，1.233E-03，2.269E-03，4.143E-03，7.398E-03，1.381E-02，2.466E-02，4.538E-02，8.385E-02，1.480E-01，2.713E-01，4.932E-01，单位g/mL，需加入护肤品体积依次对应为100，55，30.25，16.6375，9.15063，5.03284，2.76806，1.52244，0.83734，0.46054，0.2533，0.13931(μL)，当加入原液即储备液1体积小于10μL时，通过将储备液1稀释10倍得到储备液2进行实验加板，当加入储备液1体积小于1μL时，通过将储备液1稀释100倍得到储备液3进行加板，则本实验将把姬芮(Za)多元水活盈润化妆水分别稀释10倍、100倍准备储备液2和储备液3，为减小实验误差，体积都取整数，采用短长期微板毒性分析方法(朱祥伟,刘树深,张琼,刘堰.杀虫剂及抗生素对发光菌的短期毒性与长期毒性.环境科学研究[J],2009,22(05):589-594)，如图2所示，则最后加样则根据：前4个浓度点体积100，55，30，17(μL)使用储备液1加板；第5个至第8个浓度点体积为92，50，28，15(μL)用储备液2加板；后4个浓度点体积84，46，25，14(μL)则采用储备液3加板；每次每板每浓度3个平行，至少重复3块板，获取12个不同浓度点在0.25h和12h对应的浓度-效应数据，在APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)进行计算，也可选择Excel软件计算，实验组抑制率为每一受试样品浓度的3个平行微孔测试所得发光抑制率的平均值，即为受试样品12个浓度点的浓度-效应数据，采用JSFit进行S形和J形剂量-效应曲线拟合，急慢性EC50分别为1.275E-01g/mL和1.382E-01g/mL，也可计算任一效应对应的浓度或任一浓度对应的效应。针对S形剂量-效应关系，也可采用APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)，MATLAB软件，R语言等对该浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合。
(4)首先根据步骤(3)得到的剂量-效应模型，获取0.25h和12h的12个浓度-效应拟合值(表3)，以浓度(g/mL)取对数为X轴，生物发光抑制率为Y轴，时间为Z轴，为在Origin软件同时绘制0.25h和12h的三维平面浓度-效应关系曲线图(图5)，也可利用超过12个浓度效应-数据点进行作图，J形曲线同时跨越Y轴负半轴和正半轴，从完整的剂量-效应曲线，以g/mL为浓度单位统一量化表征各护肤品急慢性毒性变化，也可选择Excel、R语言、MATLAB等软件作图。
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从上述实施例可见，本发明的个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法能够缩短实验周期，比如若用绿藻进行测试，实验周期4-7天，而本发明发光菌慢性实验12h，急性实验15min，实验周期短说明发光菌对个人护理品敏感性强。另一方面，本发明也具有较低成本的优越性，这是基于实验周期、实验设备、实验耗材、人力投入等的考虑，生物越高级，相应投入的人力、物力、设备维护费用等会增加，实验成本也就越高。
本技术领域的技术人员应理解，本发明可以以许多其他具体形式实现而不脱离其本身的精神或范围。尽管已描述了本发明的实施案例，应理解本发明不应限制为这些实施例，本技术领域的技术人员可如所附权利要求书界定的本发明的精神和范围之内做出变化和修改。

Claims (10)

1.一种个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法，其特征在于，所述的个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法包括以下步骤：
稀释因子微板测试；
确定S形和J形稀释因子；
进行剂量-效应曲线拟合；
绘制三维剂量-效应曲线图。
2.根据权利要求1所述的个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法，其特征在于，所述的稀释因子微板测试包括以下步骤：
稀释透明液状样品；
加入不同体积受试液；
加入青海弧菌Q67菌液；
分别于急性暴露时间和慢性暴露时间收样，读取菌液发光度。
3.根据权利要求1所述的个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法，其特征在于，所述的确定稀释因子包括：
计算实验孔的发光抑制率；
根据慢性暴露时间的发光抑制率确定稀释因子；
所述的发光抑制率＝(对照组发光度-实验组发光度/对照组发光度)*100％。
4.根据权利要求3所述的个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法，其特征在于，剂量-效应关系包括S形和J形；
对于S形单调剂量-效应关系，稀释因子的计算公式为，df＝(Cmax/Cmin)1/(n-1)，
其中实验点共设置n个；
对于J形非单调剂量-效应关系，除满足抑制区域浓度点外，还要确定最大刺激效应的浓度点和接近原点的浓度点，稀释因子DF＝(Cmax/Cmin)1/(n-1)，
采用Cn＝C0*(DF)n-1，n＝1,2，…，n，C0对应最大效应浓度Cmax，Cn对应最低抑制率时的浓度Cmin，
其中，总浓度点为n个；
n是不小于9的正整数，Cmax为最大效应浓度，Cmin为最低抑制率浓度。
5.根据权利要求4所述的个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法，其特征在于，所述的进行剂量-效应曲线拟合包括如下步骤：
根据权利要求4所述的稀释因子计算各个实验浓度点需加入护肤品体积，若体积小于10μL时采用将护肤品原液稀释10倍或100倍或1000倍的方法制备受试液，采用短长期微板毒性分析方法，获取不同浓度点在急性时间点和慢性时间点对应的浓度-效应数据，
针对S形剂量-效应关系，对该浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合；
针对J形剂量-效应关系，采用两个Hill函数结合的模型对该浓度-效应数据进行拟合；
获得样品的浓度-效应曲线模型，计算半抑制效应浓度。
6.根据权利要求1-5中任意一种个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法，其特征在于，所述的绘制三维剂量-效应曲线图包括如下步骤：
以浓度取对数为X轴，生物发光抑制率为Y轴，时间为Z轴，同时绘制急性时间点和慢性时间点对应的三维平面浓度-效应关系曲线图。
7.权利要求1-6中任意一种个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法的应用，其特征在于，所述的个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法用于表征急慢性剂量-效应关系、检测急慢性毒性效应、检测剂量-毒性效应、预判急慢性条件下达到预期毒性效应的剂量值、急慢性毒性全面实验测试或者评估急慢性剂量条件下的毒性效应。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用研究未知组分未知浓度商品实际环境污染物的剂量-效应关系。
9.一种表征个人护理品急慢性剂量-效应关系的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
测试稀释因子的微孔板；
青海弧菌Q67菌液；
S形和J形三维剂量-效应曲线的绘制说明或者产品说明书。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：样品稀释液、阴性对照、阳性对照中的一种或者几种。
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