CN106770946A - 一种环境污染物对秀丽线虫致死毒性的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种环境污染物对秀丽线虫致死毒性的分析方法，其包括如下步骤：将同步化的秀丽线虫培养液稀释后得到秀丽线虫样液；将环境污染物原液按照等比浓度梯度稀释为n个环境污染物样液；在透明微孔内加入秀丽线虫样液并相应加入不同浓度的环境污染物样液，不加入环境污染物样液的透明微孔作为空白对照；培养t0后，获取归一化存活的秀丽线虫个数并计算归一化致死率；通过曲线拟合计算出环境污染物的半数致死浓度；本发明的分析方法能够更准确地计算出环境污染物对秀丽线虫致死毒性，更具统计学意义，能够为评价环境污染物对生态系统及人类健康的安全问题提供更科学的理论支撑。
Description
技术领域
本发明属于环境污染物毒性检测技术领域，涉及一种分析环境污染物对秀丽线虫致死毒性的方法。
背景技术
环境污染已经成为全世界普遍存在的问题，其中，有机化合物、重金属、抗生素等环境污染物所造成的环境污染尤为突出。近年来，国内外越来越关注环境污染物对环境的破坏和对生物的毒害作用及其作用机理，一系列检测环境污染程度与评价毒物毒性的方法被不断地提出。
从环境化学分析的角度，高效液相色谱法、气相色谱法等化学分析法可对环境污染物进行定性与定量分析，却不能直接反映环境污染物对生态环境的影响，这些传统的分析方法实验周期长、成本高，通常不能广泛、快速地用于毒物毒性与环境质量的评估，见Lee,C.M.,Allen,H.E.The ecological risk assessment of copper differs from thatof hydrophobic organic chemicals.Hum Ecol Risk Assess[J]；1998；4:605‐617。环境污染物对生物体的毒性，并非完全取决于其环境含量，一些变化的环境因素如pH值、氧化还原状态等在很大程度上影响环境污染物的生物效应。同时，化学分析数据并不能从整体上反映水质的优劣，或反映环境污染物对生物体和生态系统的影响。
生物毒性测试法可以弥补化学分析法在评价污染物毒性中的不足之处。鉴于模式生物对于生物科学与毒理学研究的重要价值，各种模式生物被逐渐开发出来用于环境科学与毒理学研究，例如秀丽线虫和斑马鱼。在被开发出来的模式生物中，秀丽线虫与斑马鱼因其个体小、测试周期短而日益受到重视与广泛应用。
秀丽线虫是一种经典模式生物，它的出现使得生命科学等领域许多复杂的问题得以简单化，同时也解释了许多基本的问题。与其他模式生物相比，秀丽线虫对环境科学与生态毒理研究而言具有以下优点：
(1)、秀丽线虫从受精卵发育成一个成熟的成体仅需55小时左右，生活周期短、繁殖速度快、易于实验室培养，因此，实验周期短；
(2)、秀丽线虫生活在土壤中，体长1mm左右，以细菌为食，对实验人员自身并无危害；
(3)、秀丽线虫通体透明，十分利于分析细胞谱系的变化与深入揭示和追踪毒物的神经毒理；
(4)、秀丽线虫染色体数目少(2n＝12)，基因组小(8 107bp)，约有13500个基因，十分适于针对特定的毒理学研究开展全基因组筛选。
(5)、秀丽线虫基因组中有约40％基因与人类基因组同源，暗示在秀丽线虫中所进行的毒理学研究将在很大程度上反映毒物可能导致的对人体的毒害。
(6)、秀丽线虫不仅可以生活在土壤中，在水溶液中也能生存，因此它可以作为分析土壤环境与水环境污染及相关毒理的有价值评估体系。
基于上述优点，秀丽线虫已经成功地应用于土壤与水环境中毒物毒性评估与毒理的研究(Steven G.Donkin,David B.Dusenbery.Using the Caenorhabditiselegans soiltoxicity test to identify factors affecting toxicity of four metal ions inintact soil.Water,Air,and Soil Pollution[J]；1994；78；359‐373.Traunspurger,W etal.Ecotoxicological assessment of aquatic sediments withCaenorhabditiselegans(nematoda)‐A method for testing liquid medium and whole‐sediment samples.Environ ToxicolChem[J]；1997；16；245‐250)。
秀丽线虫评价体系已经发展成为含有致死率、最长寿命与半数致死天数、细胞凋亡、个体发育、生殖、运动行为、乙酰胆碱酯酶活性、学习行为、记忆行为、转基因品系、突变体、基因表达模式等多项指标的成熟模式生物，分别获得了2002年诺贝尔生理学/医学奖、2006年诺贝尔生理学/医学奖、2008年诺贝尔化学奖，充分证明了采用该模式生物进行研究的优势，也充分奠定了其丰厚的基础数据。
虽然用秀丽线虫测定环境污染物致死毒性的方法已有研究，但这些方法及其结果因为受限于实验条件等原因，往往是简单的通过体视显微镜确定秀丽线虫的存活率，暴露组和对照组之间没有可靠的、科学的数学模型进行关联，从而得出更具统计学意义的数据。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种环境污染物对秀丽线虫致死毒性的分析方法，其能够更加准确地获取秀丽线虫的归一化致死率，并采用非线性最小二乘法模拟得到相关种类的环境污染物的浓度与归一化致死率的曲线以及环境污染物的半数致死浓度(LC50)。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种环境污染物对秀丽线虫致死毒性的分析方法，其包括如下步骤：
(1)、获取同步化的秀丽线虫培养液，稀释后得到秀丽线虫样液；
(2)、获取浓度为C0的环境污染物原液，将环境污染物原液按照等比浓度梯度稀释为n个环境污染物样液，每个环境污染物样液的浓度为k为1至n中的任意一个，n为大于1的整数，为稀释因子；
(3)、获取m+j×n个透明微孔，每个透明微孔内均加入一定体积的秀丽线虫样液，j×n个透明微孔内对应加入不同浓度的环境污染物样液，m为不添加环境污染物样液的空白对照的个数，j为每种浓度的环境污染物样液的平行对照的个数，m为≥1的整数，j为大于1的整数；
获取归一化系数Ben(0)为空白对照在t＝0时刻的秀丽线虫个数，Cen(i,j,0)为j×n个透明微孔在t＝0时刻各自的秀丽线虫个数，i为1至n中的任意一个；
(4)、培养t＝t0后，获取t＝t0时刻时m个空白对照的秀丽线虫个数的平均值Ben(t0)：
Ben(x，t)为第x个空白对照在t＝t0时刻的秀丽线虫个数，x为1至m中的任意一个；
获取t＝t0时刻时每种浓度的环境污染物样液中实际存活的秀丽线虫个数Cen(i,j,t0)exp，并获取该时刻每种浓度的环境污染物样液中归一化存活的秀丽线虫个数Cen(i,j,t0)＝Cen(i,j,t0)exp×fB(i，j)；
(5)、获取t＝t0时刻时秀丽线虫的归一化致死率
其中，环境污染物为二价铜、1‐己基‐3‐甲基咪唑溴、草甘膦和四氯苯酚中的任意一种。
同步化的秀丽线虫培养液的制备方法包括如下步骤：
(a‐1)、获取秀丽线虫原液；
(a‐2)、在秀丽线虫原液中加入碱裂解液，杀死秀丽线虫成虫并得到含有秀丽线虫虫卵的液体；
(a‐3)、对含有秀丽线虫虫卵的液体进行培养，得到同步化的秀丽线虫培养液。在步骤(a‐2)中，秀丽线虫原液与碱裂解液的体积比为1:7。
上述的稀释因子的确定方法为：
以C0作为使秀丽线虫达到50％的急性致死率以上的最高效应浓度CH，以Cn作为使秀丽线虫达到0％至5％的急性致死率的最低效应浓度CL，则稀释因子
本发明的环境污染物对秀丽线虫致死毒性的分析方法还可以包括如下步骤：
(6)、获取环境污染物的浓度与归一化致死率的曲线，并计算出环境污染物的半数致死浓度。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种环境污染物对秀丽线虫致死毒性的分析方法，其包括如下步骤：将同步化的秀丽线虫培养液稀释后得到秀丽线虫样液；将环境污染物原液按照等比浓度梯度稀释为n个环境污染物样液；在透明微孔内加入秀丽线虫样液并相应加入不同浓度的环境污染物样液，不加入环境污染物样液的透明微孔作为空白对照；培养t0后，获取归一化存活的秀丽线虫个数并计算归一化致死率；通过曲线拟合计算出环境污染物的半数致死浓度；本发明的分析方法能够更准确地计算出环境污染物对秀丽线虫致死毒性，更具统计学意义，能够为评价环境污染物对生态系统及人类健康的安全问题提供更科学的理论支撑。
附图说明
图1是本发明中的96孔透明微板布局示意图。
96孔透明微板四周共42个孔(四周一圈36个孔，第11列6个孔)各加入200μLMilli‐Q水防止产生边缘效应；第6列加入100μL的Milli‐Q水作为空白对照b；第2、3、4、5列(c1‐c6)和第7、8、9、10列(c7‐c12)分别加入按稀释因子设计的不同浓度的环境污染物，第2、3、4、5列互为平行实验，第7、8、9、10列互为平行实验。
具体实施方式
本发明提供了一种环境污染物对秀丽线虫致死毒性的分析方法，其包括如下步骤：
(1)、获取同步化的秀丽线虫培养液，稀释后得到秀丽线虫样液；
(2)、获取浓度为C0的环境污染物原液，将环境污染物原液按照等比浓度梯度稀释为n个环境污染物样液，每个环境污染物样液的浓度为Ck为第k个环境污染物样液的浓度，k为1至n中的任意一个，n为大于1的整数，为稀释因子；例如：n可以为12；
(3)、获取m+j×n个透明微孔，每个透明微孔内均加入一定体积的秀丽线虫样液(例如100μL)，j×n个透明微孔分别暴露于不同浓度的环境污染物样液(即毒性暴露法)，m为不添加环境污染物样液的透明微孔的个数(作为空白对照)，j为加入了同种浓度的环境污染物样液的透明微孔的个数(作为相同环境污染物样液的浓度的平行对照)，m为≥1的整数，例如，m可以为6，j为大于1的整数；
获取归一化系数Ben(0)为空白对照在t＝0时刻的秀丽线虫个数，Cen(i,j,0)为j×n个透明微孔在t＝0时刻的秀丽线虫个数，i为1至n中的任意一个；
(4)、培养t＝t0后，获取t＝t0时刻时m个空白对照的秀丽线虫个数的平均值Ben(t0)：
Ben(x，t0)为第x个空白对照在t＝t0时刻的秀丽线虫个数，x为1至m中的任意一个；
获取t＝t0时刻时每种浓度的环境污染物样液中实际存活的秀丽线虫个数Cen(i,j,t0)exp，并获取该时刻每种浓度的环境污染物样液中归一化后存活的秀丽线虫个数Cen(i,j,t0)＝Cen(i,j,t0)exp×fB(i，j)；
(5)、获取t＝t0时刻时秀丽线虫的归一化致死率
其中，在步骤(1)中，环境污染物可以为二价铜、1‐己基‐3‐甲基咪唑溴、草甘膦和四氯苯酚中的任意一种。环境污染物的浓度可以为3.76×10‐3mol/L至3.7755×10‐2mol/L。
同步化的秀丽线虫培养液的制备方法包括如下步骤：
(a‐1)、获取秀丽线虫原液；
(a‐2)、在秀丽线虫原液中加入碱裂解液，得到含有秀丽线虫虫卵的液体；秀丽线虫原液与碱裂解液的体积比为1:7；
(a‐3)、对含有秀丽线虫虫卵的液体进行培养，得到同步化的秀丽线虫培养液。
具体而言，同步化的秀丽线虫培养液的制备方法包括如下步骤：
1‐1、配制无菌K‐溶液、碱裂解液、线虫生长固体培养基(Nematode GrowthMedium，NGM)、用于培养大肠杆菌OP50(E.coli OP50)的LB液体培养基(LuriaBertaniMedium)。
1‐2、将E.coli OP50在常温下接种至灭菌后的LB液体培养基中，于37℃恒温培养24h；
1‐3、将培养好的E.coli OP50接种至线虫生长固体培养基(NGM培养基)上，于37℃继续恒温培养24h；
1‐4、将秀丽线虫接种至生长E.coli OP50的线虫生长固体培养基上，在20℃条件下培养3天；
1‐5、用2mL无菌K‐溶液或无菌水将线虫生长固体培养基(NGM培养基)表面的秀丽线虫冲洗至15mL具有刻度的离心管中，静置30min至2h以消耗其体内残留的食物，弃去上清液使得含有秀丽线虫的液体留存约1.5mL；
1‐6、按含有秀丽线虫的液体(虫液):碱裂解液＝1:7的体积比，将碱裂解液加入虫液中，混合摇匀，反应20min，并每5min摇匀一次，以充分杀死秀丽线虫母体，留下对碱裂解液有抵抗能力的含虫卵的液体；
1‐7、对含虫卵的液体在1500rpm离心1min，弃去上清液，加入无菌K‐溶液至离心前相同刻度，摇匀，1500rpm离心1min，弃去上清液，重复该操作2次；
1‐8、然后将离心管含有虫卵的无菌K‐溶液转移至有食物源的NGM培养基，置于生化培养箱内培养(温度为20℃)培养48h，获得同步化的秀丽线虫培养液(即L4期成虫)。
其中，在步骤1‐1中，LB液体培养基按照《分子克隆试验指南》(J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔等)中的方法配制。
在步骤1‐1中，线虫生长固体培养基(NGM培养基)按照S.Brenner在1974年Genetics刊物上发表的论文(The genetic of Caenorhabditiselegans)中提及的方法配制。
在步骤1‐1中，配制1mol/L K2HPO4‐KH2PO4缓冲液(pH＝6，前后者按2:1比例配制而成)，用于平衡秀丽线虫的渗透压；胆固醇溶液、1mol/L MgSO4溶液、1mol/L CaCl2溶液，用于补充大肠杆菌生存所需营养元素；1mol/L NaOH溶液，用于调节pH。
在步骤1‐1中，无菌K‐溶液按照P.L.Williams等人在1990年EnvironmentalToxicology and Chemistry刊物上发表的论文(Aquatic toxicity testing using thenematode，Caenorhabditiselegans)中提及的方法配制。
在步骤1‐1中，碱裂解液(clorox溶液)按照S.W.Emmons等人在1979年Proceedingsof the National Academy of Sciences刊物上发表的论文(An analysis of theconstancy of DNA sequences during development and evolution of the nematodeCaenorhabditiselegans)中提到的方法配制。
在步骤(2)中，获取浓度为C0的环境污染物原液的方法为：将环境污染物(如重金属、农药、抗生素、离子液体、取代酚等)的实验用分析纯药品溶解于Milli‐Q水中，制备为浓度较高的环境污染物原液。该环境污染物原液对秀丽线虫的急性致死率应为50％以上，优选为60％以上，更优选为70％以上，进一步优选为80％以上，更进一步优选为90％以上，还可以优选为100％。
急性致死率的测定方法如下：将含有秀丽线虫的培养液加入一定浓度的环境污染物，然后置于体视显微镜下计数，计数完毕后，置于20℃的生化培养箱中，然后加入环境污染物原液以进行毒性暴露；暴露一定时间后，采用体视显微镜计数秀丽线虫的存活个数与死亡个数；用铂丝轻触秀丽线虫，若10s内没有反应，则判定为该条秀丽线虫已死亡。急性致死率的定义为毒性暴露之后的秀丽线虫的死亡个数与毒性暴露之前的秀丽线虫的个数之比。
稀释因子的确定方法为：
以C0作为使秀丽线虫达到至少50％的急性致死率以上的最高效应浓度CH，以Cn作为使秀丽线虫达到0％至5％的急性致死率的最低效应浓度CL，等比浓度梯度的环境污染物样液的个数为n，则稀释因子最高效应浓度CH的急性致死率可以优选为60％以上，更优选为70％以上，进一步优选为80％以上，更进一步优选为90％以上，还可以优选为100％。例如，若CL＝2.290×10-5mol/L，CH＝4.586×10-3mol/L，等比浓度梯度的环境污染物样液的个数为n＝12，则稀释因子 那么，就按照稀释因子的比例依次对浓度为C0的环境污染物原液进行稀释。
步骤(3)具体包括如下步骤：
(b‐1)、获取m+j×n个透明微孔，用无菌K‐溶液将NGM培养基表面L4期的秀丽线虫冲洗至5mL离心管中，应轻微冲洗以避免将E.coli OP50带入离心管中；
(b‐2)、根据具体需要，每个透明微孔内均加入100μL的稀释后的秀丽线虫样液；采用体视显微镜对m+j×n个透明微孔中的秀丽线虫的个数进行计数；m为不暴露在环境污染物样液的透明微孔的个数(作为空白对照)；n为等比浓度梯度的环境污染物样液的个数；j为暴露于同种浓度的环境污染物样液的透明微孔的个数(作为平行对照)，例如，j＝4；m为≥1的整数，j为大于1的整数；
(b‐3)、获取归一化系数Ben(0)为空白对照在t＝0时刻的秀丽线虫的个数，Cen(i,j,0)为j×n个透明微孔在t＝0时刻的对应的秀丽线虫个数，i为1至n中的任意一个。
(b‐4)、将j×n个透明微孔分别置于20℃的生化培养箱中并分别暴露于不同浓度的环境污染物样液中。
步骤(4)具体包括如下步骤：
(c‐1)、暴露培养t＝t0后(例如t＝24小时)，采用体视显微镜对每个透明微孔中的秀丽线虫的个数进行计数；
(c‐2)、获取t＝t0时刻时m个空白对照的秀丽线虫个数的平均值Ben(t0)：
Ben(x，t0)为第x个空白对照在t＝t0时刻的秀丽线虫个数，x为1至m中的任意一个；
(c‐3)、获取t＝t0时刻时暴露于每种浓度的环境污染物样液中的透明微孔中实际存活的秀丽线虫个数Cen(i,j,t0)exp，并获取该时刻暴露于每种浓度的环境污染物样液的环境的透明微孔中归一化存活的秀丽线虫个数Cen(i,j,t0)＝Cen(i,j,t0)exp×fB(i，j)。
在步骤(5)中，致死率定义为各个透明微孔中死亡的秀丽线虫数占空白对照的平均秀丽线虫数的比例或百分率，归一化致死率定义为以m(例如为6)个空白对照的平均线虫数为参考对各个透明微孔中的死亡的秀丽线虫数进行归一化校正后的致死率，这样可以提高秀丽线虫计数的精度。
本发明的环境污染物对秀丽线虫致死毒性的分析方法还可以包括如下步骤：
(6)、获取相关环境污染物的浓度与归一化致死率的曲线，并计算出环境污染物的半数致死浓度(LC50)。
其中，步骤(6)具体包括如下步骤：采用APTox软件中的Logit或Weibull函数对不同浓度的环境污染物的秀丽线虫归一化致死率数据进行非线性最小二乘拟合，得到环境污染物的浓度‐归一化致死率关系曲线，置信区间为95％；然后分别计算出不同的环境污染物的半数致死浓度(LC50)。上述的APTox软件的软著登字为第062731，登记号为2006SR15065。
在步骤(6)中，所得到的半数致死浓度(LC50)可以为6.099×10‐4至5.962×10‐ 3mol/L。置信区间的下限可以为3.981×10‐4至5.154×10‐3mol/L，上限可以为8.036×10‐4至6.974×10‐3mol/L。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明：
实施例一
本实施例提供了一种环境污染物(Cu2+)对秀丽线虫致死毒性的分析方法，其包括如下步骤：
(1)、将E.coli OP50在常温下接种至灭菌后的LB培养基中，于37℃恒温培养24h；
(2)、将培养好的E.coli OP50接种至NGM培养基上，于37℃继续恒温培养24h；
(3)、将秀丽线虫接种至已生长E.coli OP50的NGM培养基上，于20℃的条件下恒温培养三天；
(4)、用2mL无菌K‐溶液将NGM培养基表面的秀丽线虫冲洗至15mL具有刻度的离心管中，静置30min，弃去上清液使得含有秀丽线虫的液体(虫液)留存约1.5mL；
(5)、按虫液:碱裂解液＝1:7的体积比，将碱裂解液加入虫液中，混合摇匀，反应20min，并每5min摇匀一次，以充分杀死秀丽线虫母体，留下对碱裂解液有抵抗能力的虫卵；
(6)、对含虫卵的液体在1500rpm离心1min，弃去上清液，加入无菌K‐溶液至离心前相同刻度，摇匀，1500rpm离心1min，弃去上清液，重复该操作2次；
(7)、将离心管含有虫卵的无菌K‐溶液转移至有食物源(E.coli OP50)的NGM培养基，置于生化培养箱内培养(温度为20℃)培养48h，获得同步化的秀丽线虫培养液(L4期成虫)，备用；
(8)、用移液器移取2mL无菌水冲洗同步化后并处于L4期的秀丽线虫，将其置于装有无菌K‐溶液的离心管中2h，以消耗其体内残留的食物，从而减少急性致死毒性测试过程中的干扰因素；
(9)、将秀丽线虫虫液用稀释法加入到96孔透明微板中，每个透明微孔中加入100μL虫液(确保每孔线虫数基本一致)；
(10)、通过预实验结果得到的浓度‐效应数据以及期望的浓度‐效应曲线点数，按几何级数浓度梯度计算稀释因子，将已配制的重金属Cu2+使用液(Copper sulfate,CuSO4,美国Sigma公司，储备液用Milli‐Q水配制，为3.76×10‐3mol/L并置于4℃冰箱中保存)根据最高毒性稀释配制，并置于4℃冰箱中保存，使用液按稀释因子(计算得：)所得的浓度梯度分别加入96孔透明微板的相应孔中；其中，如图1所示，96孔透明微板四周共42个孔(四周一圈36个孔，第11列6个孔)各加入200μL Milli‐Q水防止产生边缘效应；第6列加入100μL的Milli‐Q水作为空白对照b；第2、3、4、5列(c1‐c6)和第7、8、9、10列(c7‐c12)分别加入按稀释因子设计的不同浓度Cu2+，第2、3、4、5列互为平行实验，第7、8、9、10列互为平行实验。每孔加入溶液体积均为100μL；即，总计每孔的混合液中有：100μL环境污染物溶液+100μL虫液＝200μL的液体与数目基本一致的秀丽线虫；将96孔透明微板置于20摄氏度恒温培养箱中进行毒性暴露；
(11)、24h后，采用体视显微镜计数96孔透明微板每孔中秀丽线虫的存活与死亡个体数，在此过程中，用铂丝轻触秀丽线虫，若10s内没有反应则判定为死亡。
(12)、根据公式计算归一化致死率：
(13)、选择APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中的Logit或Weibull函数进行非线性最小二乘拟合，得到Cu2+的LC50拟合值与95％置信区间上下限分别为7.589×10‐4mol/L、7.186×10‐4mol/L、8.036×10‐4mol/L。
实施例二
本实施例提供了一种环境污染物(1‐己基‐3‐甲基咪唑溴)对秀丽线虫致死毒性的分析方法，本实施例的方法与实施例一的方法的不同之处在于：1‐己基‐3‐甲基咪唑溴(1‐hexyl‐3‐methylimidazolium bromide,[hmim]Br，Damas beta公司)储备液浓度为3.7755×10‐2mol/L，稀释因子对秀丽线虫的急性致死毒性数据选择APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中的Logit或Weibull函数进行非线性最小二乘拟合，得到LC50拟合值与95％置信区间上下限分别为：5.962×10‐3mol/L、5.154×10‐3mol/L、6.974×10‐3mol/L；其余参数与实施例一相同。
实施例三
本实施例提供了一种环境污染物(草甘膦)对秀丽线虫致死毒性的分析方法，本实施例的方法与实施例一的方法的不同之处在于：草甘膦(Glyphosate,GLY,美国Fluka公司)储备液浓度为7.64×10‐3mol/L，稀释因子GLY对秀丽线虫的急性致死毒性数据选择APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中的Logit或Weibull函数进行非线性最小二乘拟合，得到LC50拟合值与95％置信区间上下限分别为：1.683×10‐3mol/L、1.317×10‐3mol/L、2.137×10‐3mol/L。其余参数与实施例一相同。
实施例四
本实施例提供了一种环境污染物(四氯苯酚)对秀丽线虫致死毒性的分析方法，本实施例的方法与实施例一的方法的不同之处在于：四氯苯酚(4‐Chlorophenol,德国Dr.Ehrenstorfer公司)储备液浓度为3.12×10‐2mol/L，稀释因子四氯苯酚对秀丽线虫的急性致死毒性数据选择APTox软件(软著登字第062731，登记号2006SR15065)中的Logit或Weibull函数进行非线性最小二乘拟合，得到LC50拟合值与95％置信区间上下限分别为：6.099×10‐4mol/L、3.981×10‐4mol/L、8.55×10‐4mol/L。
其余参数与实施例一相同。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种环境污染物对秀丽线虫致死毒性的分析方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)、获取同步化的秀丽线虫培养液，稀释后得到秀丽线虫样液；
(2)、获取浓度为C0的环境污染物原液，将所述环境污染物原液按照等比浓度梯度稀释为n个环境污染物样液，每个环境污染物样液的浓度为k为1至n中的任意一个，n为大于1的整数，为稀释因子；
(3)、获取m+j×n个透明微孔，每个透明微孔内均加入一定体积的秀丽线虫样液，j×n个透明微孔内对应加入不同浓度的环境污染物样液，m为不添加环境污染物样液的空白对照的个数，j为每种浓度的环境污染物样液的平行对照的个数，m为≥1的整数，j为大于1的整数；
获取归一化系数Ben(0)为空白对照在t＝0时刻的秀丽线虫个数，Cen(i,j,0)为j×n个透明微孔在t＝0时刻各自的秀丽线虫个数，i为1至n中的任意一个；
(4)、培养t＝t0后，获取t＝t0时刻时m个空白对照的秀丽线虫个数的平均值Ben(t0)：
Ben(x，t)为第x个空白对照在t＝t0时刻的秀丽线虫个数，x为1至m中的任意一个；
获取t＝t0时刻时每种浓度的环境污染物样液中实际存活的秀丽线虫个数Cen(i,j,t0)exp，并获取该时刻每种浓度的环境污染物样液中归一化存活的秀丽线虫个数Cen(i,j,t0)＝Cen(i,j,t0)exp×fB(i，j)；
(5)、获取t＝t0时刻时秀丽线虫的归一化致死率。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述环境污染物为二价铜、1‐己基‐3‐甲基咪唑溴、草甘膦和四氯苯酚中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述同步化的秀丽线虫培养液的制备方法包括如下步骤：
(a‐1)、获取秀丽线虫原液；
(a‐2)、在所述秀丽线虫原液中加入碱裂解液，杀死秀丽线虫成虫并得到含有秀丽线虫虫卵的液体；
(a‐3)、对含有秀丽线虫虫卵的液体进行培养，得到同步化的秀丽线虫培养液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述秀丽线虫原液与所述碱裂解液的体积比为1:7。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：稀释因子的确定方法为：
以C0作为使秀丽线虫达到50％的急性致死率以上的最高效应浓度CH，以Cn作为使秀丽线虫达到0％至5％的急性致死率的最低效应浓度CL，则稀释因子
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括如下步骤：
(6)、获取环境污染物的浓度与归一化致死率的曲线，并计算出环境污染物的半数致死浓度。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108459138A (zh) * | 2018-02-09 | 2018-08-28 | 中国科学技术大学 | 离子液体污染的检测方法 |
| CN111796086A (zh) * | 2020-07-03 | 2020-10-20 | 同济大学 | 一种个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法 |
| CN113834910A (zh) * | 2021-09-29 | 2021-12-24 | 同济大学 | 一种基于秀丽线虫运动障碍微板毒性分析方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101982075A (zh) * | 2010-09-09 | 2011-03-02 | 长春理工大学 | 用秀丽线虫建立食品与饲料中甾体类激素污染物生物模型及方法 |
| CN102183627A (zh) * | 2011-02-25 | 2011-09-14 | 同济大学 | 采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法 |
-
2016
- 2016-12-14 CN CN201611154609.XA patent/CN106770946A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101982075A (zh) * | 2010-09-09 | 2011-03-02 | 长春理工大学 | 用秀丽线虫建立食品与饲料中甾体类激素污染物生物模型及方法 |
| CN102183627A (zh) * | 2011-02-25 | 2011-09-14 | 同济大学 | 采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HAN-XIAO TANG ETAL: "Combining the uniform design-based ray procedure with combination index to investigate synergistic lethal toxicities of ternary mixtures on Caenorhabditis elegans", 《ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY》 * |
| ZHENYANG YU ETAL: "Transgenerational effects of heavy metal on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progey", 《ECOTOXICOLOGY AND ENVIRONMENTAL SAFETY》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108459138A (zh) * | 2018-02-09 | 2018-08-28 | 中国科学技术大学 | 离子液体污染的检测方法 |
| CN111796086A (zh) * | 2020-07-03 | 2020-10-20 | 同济大学 | 一种个人护理品急慢性剂量-效应关系表征方法 |
| CN113834910A (zh) * | 2021-09-29 | 2021-12-24 | 同济大学 | 一种基于秀丽线虫运动障碍微板毒性分析方法 |
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