CN103487555A - 分析环境污染物对明亮发光杆菌长期微板毒性的方法 - Google Patents

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莫凌云
覃礼堂
曾鸿鹄
李艳红
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Abstract

本发明公开了一种分析环境污染物对明亮发光杆菌长期微板毒性的方法。该方法以明亮发光杆菌为指示生物，在短期微板毒性分析法的基础上,建立长期微板毒性分析法，所用长期培养基的组分浓度为短期培养基相应组分浓度的2倍。本发明长期微板毒性分析可以合理的评价具有特定作用机制的化合物的生态毒性，长期毒性测试法能全面的了解污染物的毒性效应,能更深入的了解污染物的毒理作用机制与途径,更能体现实际环境中污染物暴露的现象和信息，同时本发明具有操作简单、灵敏度高、充复性好及能全面的了解污染物的毒性效应等优点。

Description

分析环境污染物对明亮发光杆菌长期微板毒性的方法
技术领域
本发明属于环境污染分析技术领域，特别涉及一种分析环境污染物对明亮发光杆菌长期微板毒性的方法。
背景技术
目前, 人类活动产生的污染物持续不断的进入环境，具有持久性及生物富集性的污染物, 对生态环境和生物体产生长期持久的危害，因而, 污染物毒性的检测也应该着眼于它们的长期效应, 观察时间因素在污染物对生物体毒性变化过程中起重要的作用。
多数污染物对水生生物的短期效应不易观测, 但长期效应慢慢积累,还会引起一些不可逆性的变化,发光细菌短期毒性测试法会低估环境污染物的毒性, 延长测试时间可以合理的评估具有特定作用机制的化合物的生态毒性，长期毒性测试法能全面的了解污染物的毒性效应, 能更深入的了解污染物的毒理作用机制与途径,更能体现实际环境中污染物暴露的现象和信息。
发明内容
本发明的目的是提供一种分析环境污染物对明亮发光杆菌长期微板毒性的方法。
本发明的思路：以明亮发光杆菌为指示生物，在短期微板毒性分析法的基础上, 建立长期微板毒性分析法。
具体步骤为：
(1)按照短期微板毒性分析法在固体培养基中培养明亮发光杆菌菌落，菌落在22~23℃培养48小时后，保存于4℃冰箱中备用，所述固体培养基的配方按照短期微板毒性分析法进行配制。
(2)从步骤(1)于4℃冰箱中保存备用的明亮发光杆菌菌落中挑取小米粒大小的菌落接种到长期培养基中培养，长期培养基置于振荡培养箱, 振荡转速设为120转每分钟, 温度保持22~23℃，直至明亮发光杆菌生长至对数期，即其相对发光单位大于等于 1.0×105，所得菌液备用。
(3)按照稀释因子设置12个浓度梯度，即
cn= c0×Nn，n=0,1,2,……,11;
其中c0为储备液浓度，cn为设置的浓度，N为稀释因子，所属稀释因子根据实际测定情况设定。
(4)取96孔微板备用，所述96孔微板上的微孔呈8行×12列的方式排列，将所述96 孔微板周边的36 个微孔均加入 200 微升蒸馏水，在剩余微孔中选取第 2、3、7 及11 列共 24个微孔作为空白对照，剩余36个微孔为待测孔，按步骤(3)所设定的稀释因子在36个待测孔中均匀设置12个浓度梯度, 各浓度做3 个平行, 每个待测孔中环境污染物溶液的体积为100微升。
(5)将步骤(3)培养的菌液与长期培养基按体积比1:4混合，制得混合菌液。
(6)利用多道移液枪向步骤(4)所述的36个待测孔中分别移取步骤(5)制得的混合菌液100微升，使待测孔中试液的总体积均达到200微升，96孔微板准备完毕。
(7)将步骤(6)准备好的96孔微板在21~23℃下培养12小时，并在21~23℃的环境下测定其相对发光单位。
所述长期培养基的组分浓度为短期培养基相应组分浓度的2倍。
所述相对发光单位在酶标仪上测定, 按下列公式计算环境污染物对明亮发光杆菌长期毒性的抑制率：
E=(I0－I)/I0×100%    。
I0为空白控制样品的发光强度平均值，I为各浓度3个平行样的发光强度平均值，E为不同浓度时抑制发光百分数。
本发明长期微板毒性分析可以合理的评价具有特定作用机制的化合物的生态毒性，长期毒性测试法能全面的了解污染物的毒性效应, 能更深入的了解污染物的毒理作用机制与途径,更能体现实际环境中污染物暴露的现象和信息，同时本发明具有操作简单、灵敏度高、充复性好及能全面的了解污染物的毒性效应等优点。
附图说明
图1是本发明方法所使用96孔微板的平面布局示意图。
具体实施方式
实施例：
(1)按照短期微板毒性分析法在固体培养基中培养明亮发光杆菌菌落，菌落在22℃培养48小时后，保存于4℃冰箱中备用，所述固体培养基的配方按照短期微板毒性分析法进行配制。
(2)从步骤(1)于4℃冰箱中保存备用的明亮发光杆菌菌落中挑取小米粒大小的菌落接种到长期培养基中培养，长期培养基置于振荡培养箱, 振荡转速设为120转每分钟, 温度保持22~23℃，直至明亮发光杆菌生长至对数期，即其相对发光单位大于等于 1.0×105，所得菌液备用。
(3)稀释因子取0.618，储备液取具有代表性环境污染物苯酚，其浓度为0.02376mol/L，按照稀释因子设置12个浓度梯度，即
cn= 0.02376(mol/L)×0.618n，n=0,1,2,……,11。
(4)取96孔微板备用，所述96孔微板上的微孔呈8行×12列的方式排列，将所述96 孔微板周边的36 个微孔均加入 200 微升蒸馏水，在剩余微孔中选取第 2、3、7 及11 列共 24个微孔作为空白对照，剩余36个微孔为待测孔，按步骤(3)所取的苯酚溶液的浓度以及稀释因子在36个待测孔中均匀设置12 个浓度梯度, 各浓度做3 个平行, 每个待测孔中环境污染物溶液的体积为100微升。
(5)将步骤(3)培养的菌液与长期培养基按体积比1:4混合，制得混合菌液。
(6)利用多道移液枪向步骤(4)所述的36个待测孔中分别移取步骤(5)制得的混合菌液100微升，使待测孔中试液的总体积均达到200微升，96孔微板准备完毕。
(7)将步骤(6)准备好的96孔微板在22℃下培养12小时，并在22℃的环境下测定其相对发光单位，结果如下表：
I0 37873012 40305136 39926884 39556140 39888104 38727524 38884040 39748928 38352188 39666224 40890732 40130960
I1 2719381 7000937 12068539 18223168 21479732 26208806 28423016 33713680 35296904 35629056 37273340, 37319040
I2 2411342 7448412 14069118 19985426 25553792 32945246 34890696 37875964 39629920 39264440 39509792 39815968
I3 2159120 7409364 14253117 20709772 26646372 32238032 33680712 38741768 40360936 39335464 40280412 41861520
I 2429948 7286238 13463591 19639455 24559965 30464028 32331475 36777137 38429253 38076320 39021181 39665509
E, % 93.84758 81.55188 65.91135 50.2746 37.8163 22.86772 18.13951 6.883476 2.700462 3.594059 1.201752 -0.42963
其中，I1、I2和I3为12个浓度梯度的三次平行相对发光单位，与I0的关系如下：
I0=( I1＋I2＋I3) /3  。
按下列公式计算苯酚对明亮发光杆菌长期毒性的抑制率：
E=(I0－I)/I0×100%  。
I0为空白控制样品的发光强度平均值，I为各浓度3个平行样的发光强度平均值，E为不同浓度时抑制发光百分数。
所述长期培养基的组分浓度为短期培养基相应组分浓度的2倍，加热溶于1000毫升去离子水中，调节其pH值为8.7, 分装于100毫升的锥形瓶中, 每瓶50 毫升, 用牛皮纸包住瓶口扎紧，121℃下高压蒸汽灭菌20分钟, 冷却后置于4℃冰箱中保存备用。

Claims (1)

1.一种分析环境污染物对明亮发光杆菌长期微板毒性的方法，其特征在于具体步骤为：
(1)按照短期微板毒性分析法在固体培养基中培养明亮发光杆菌菌落，菌落在22~23℃培养48小时后，保存于4℃冰箱中备用，所述固体培养基的配方按照短期微板毒性分析法进行配制；
(2)从步骤(1)于4℃冰箱中保存备用的明亮发光杆菌菌落中挑取小米粒大小的菌落接种到长期培养基中培养，长期培养基置于振荡培养箱, 振荡转速设为120转每分钟, 温度保持22~23℃，直至明亮发光杆菌生长至对数期，即其相对发光单位大于等于 1.0×105，所得菌液备用；
(3)按照稀释因子设置12个浓度梯度，即
cn= c0×Nn，n=0,1,2,……,11;
其中c0为储备液浓度，cn为设置的浓度，N为稀释因子，所属稀释因子根据实际测定情况设定；
(4)取96孔微板备用，所述96孔微板上的微孔呈8行×12列的方式排列，将所述96 孔微板周边的36 个微孔均加入 200 微升蒸馏水，在剩余微孔中选取第 2、3、7 及11 列共 24个微孔作为空白对照，剩余36个微孔为待测孔，按步骤(3)所设定的稀释因子在36个待测孔中均匀设置12个浓度梯度, 各浓度做3 个平行, 每个待测孔中环境污染物溶液的体积为100微升；
(5)将步骤(3)培养的菌液与长期培养基按体积比1:4混合，制得混合菌液；
(6)利用多道移液枪向步骤(4)所述的36个待测孔中分别移取步骤(5)制得的混合菌液100微升，使待测孔中试液的总体积均达到200微升，96孔微板准备完毕；
(7)将步骤(6)准备好的96孔微板在21~23℃下培养12小时，并在21~23℃的环境下测定其相对发光单位；
所述长期培养基的组分浓度为短期培养基相应组分浓度的2倍；
所述相对发光单位在酶标仪上测定, 按下列公式计算环境污染物对明亮发光杆菌长期毒性的抑制率：
E=(I0－I)/I0×100%    ；
I0为空白控制样品的发光强度平均值，I为各浓度3个平行样的发光强度平均值，E为不同浓度时抑制发光百分数。
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