CN110484591A - 一种应用青海弧菌q67测试磺胺类抗生素生物毒性的方法 - Google Patents

一种应用青海弧菌q67测试磺胺类抗生素生物毒性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种应用青海弧菌Q67测试磺胺类抗生素生物毒性的方法。以磺胺类抗生素为研究对象，以青海弧菌Q67为测试生物，96孔微孔板为载体；通过96孔微孔板分析方法，采用微孔板分光光度计来检测其发光强度；根据实验组与对照组的发光强度来计算发光抑制率，从而判断磺胺类抗生素的生物毒性。本发明方法利用微板法对磺胺类抗生素的毒性进行检测分析，通过计算发光菌的发光抑制率，再利用基于Matlab自编的Logit函数拟合计算出的EC50值的负对数pEC50，以pEC50值判断磺胺类抗生素的综合毒性大小，本发明方法操作简单、方便快捷、重现性好，能够广泛适用于测试环境中实际残留的磺胺类抗生素的毒性。

Description

一种应用青海弧菌Q67测试磺胺类抗生素生物毒性的方法
技术领域
本发明属于磺胺类抗生素生物毒性检测领域，特别涉及一种应用青海弧菌Q67测试磺胺类抗生素生物毒性的方法。
背景技术
抗生素是一类能在低微浓度情况下抑制或影响生物机能的化学物质，在医疗及动、植物病虫害防治方面发挥了巨大的作用。抗生素按使用对象，可分为人用抗生素和兽用抗生素，磺胺类药物是一类人工合成的抗菌剂，自20世纪40年代磺胺类药物被合成成功以来，超过150种磺胺类药物和其衍生物被应用于人体疾病的治疗或作为兽药应用于动物饲养。由于这类药物在动物体内很难被完全吸收，大部分以母体或代谢产物的形式通过粪尿排出体外进入环境，导致药物在环境中的大量残留。目前磺胺类抗生素生物毒性的检测方法有：发光菌毒性试验，藻类毒性试验，溞类毒性试验，鱼类毒性试验等。
发光细菌毒性测试方法应用于环境毒物的检测源于自上个世纪80年代，由于其检测速度快、灵敏度高、设备简单以及具有极好的可扩展性，在环境样品的毒性检测中得到了迅猛的发展。且研究表明，大部分有机污染物对发光细菌毒性与对多种水生生物的毒性明显正相关。青海弧菌是从青海湖裸鲤体表分离得到的一种新的淡水型发光细菌。研究表明，青海弧菌的研究课题组已成功开发了一种快速、灵敏的环境污染物综合毒性检测仪，并已形成一套完整的体系，已在环境污染物监测中被广泛地应用（如汶川地震及上海世博会饮用水的安全检测），得到了较高的评价，因此成为近年来研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用青海弧菌Q67测试磺胺类抗生素生物毒性的方法。
具体步骤为：
（1）将磺胺类抗生素标准品按照溶解度配制成标准溶液，并置于4℃冰箱保存待用。
（2）培养青海弧菌Q67使其达到对数生长期，得到青海弧菌Q67菌液，将其作为工作菌液。
（3）将步骤（1）配制的标准溶液加入到白色不透明96孔微孔板中，设置好微孔板中磺胺类抗生素浓度梯度，然后向白色不透明96孔微孔板中加入步骤（2）得到的工作菌液，制作磺胺类抗生素和工作菌液的反应体系；每孔总体积为200μL，实验组每孔含100μL工作菌液和100μL不同浓度的磺胺类抗生素，空白对照组每孔含100μL工作菌液和100μL超纯水；使磺胺类抗生素和工作菌液充分反应15min，然后用微孔板分光光度计测定其发光强度RLU，相同条件下，每个磺胺类抗生素浓度进行9次重复实验，并取平均值。
（4）根据实验组与空白对照组的发光强度计算出不同浓度磺胺类抗生素对青海弧菌Q67的发光抑制率E，以磺胺类抗生素不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的发光抑制率为纵坐标，利用基于Matlab自编的Logistic函数对不同浓度磺胺类抗生素与发光抑制率E进行非线性拟合：
式中：I0为空白对照组的RLU平均值，I为实验组各浓度9次平行样的RLU平均值；最后，利用基于Matlab自编的Logit函数拟合计算出的EC50值的负对数pEC50，以pEC50作为毒性指标，判断磺胺类抗生素的毒性大小，pEC50的数值越大，毒性越大。
本发明的有益效果是：
1）该方法测试过程中所用试剂少，使用量少，环境友好。
2）该方法利用微板法对磺胺类抗生素的毒性进行检测分析，通过计算发光菌的发光抑制率，利用基于Matlab自编的Logit函数拟合计算出的EC50值的负对数pEC50作为毒性指标，判断磺胺类抗生素的综合毒性大小。
3）该方法操作简单，方便快捷，重现性好，能够广泛适用于测试磺胺类抗生素的毒性。
附图说明
图1为本发明实施例中磺胺吡啶对青海弧菌Q67的浓度-效应曲线。
图2为本发明实施例中磺胺甲基嘧啶对青海弧菌Q67的浓度-效应曲线。
图3为本发明实施例中磺胺二甲嘧啶对青海弧菌Q67的浓度-效应曲线。
图4为本发明实施例中磺胺甲氧哒嗪对青海弧菌Q67的浓度-效应曲线。
图5为本发明实施例中磺胺甲恶唑对青海弧菌Q67的浓度-效应曲线。
图6为本发明实施例中磺胺喹噁啉对青海弧菌Q67的浓度-效应曲线。
图7为本发明实施例中磺胺-6-甲氧嘧啶对青海弧菌Q67的浓度-效应曲线。
图8为本发明实施例中磺胺氯吡嗪钠对青海弧菌Q67的浓度-效应曲线。
图9为本发明实施例中使用的96孔微孔板的加样设计图，其中，b为对照组，含100μL超纯水+100μL工作菌液；C1-C12依次为磺胺类抗生素从高到低的12个浓度梯度。
具体实施方式
实施例：
本实施例中受试的8种磺胺类抗生素标准品均购自美国Cato Research ChemicalsInc，对磺胺类抗生素的标准品进行如下试验：
（1）将磺胺类抗生素标准品按照溶解度配成标准溶液，将所配标准溶液置于4℃冰箱保存待用。
（2）培养青海弧菌Q67使其达到对数生长期，将其作为工作菌液，具体操作如下：
菌种的活化与接种：取出-30℃保存的装有青海弧菌菌株的Q67冷冻干粉（购自北京滨松光子技术股份有限公司）的安瓿瓶，置于4℃冰箱内约10~15min，用酒精棉球擦拭外周消毒后，在超净工作台中用砂轮切开安瓿瓶，加入300μL Q67冻干粉复苏液，轻微振荡，进行活化，然后用量程为100μL的移液器移取菌种液至培养皿平板上，然后将培养皿放置于恒温培养箱中，22℃培养（夏季18h，冬季30h）长出菌落获得F1代，然后用接种环从F1挑选菌落接种至平板培养基上，倒置放于恒温培养箱中，22℃培养（夏季18h，冬季30h）长出菌落获得F2代，按照同样的方法培养至F3代。取出放置于4℃冰箱保存待用。
测试菌种的培养：从4℃保存的Q67固体平板上挑取一环菌落，转接到50mL液体培养基中，置于振荡培养箱中培养，22℃、120rpm下振荡培养，直至Q67到达对数生长期，待用。
液体培养基配制：13.6mg KH2PO4、35.8mg Na2HPO4·12H2O、250.0mg MgSO4·7H2O、610.0mg MgCl2·6H2O、33.0mg CaCl2、1.34g NaHCO3、1.54g NaCl、5.0g酵母浸膏、5.0g胰蛋白脉和3.0g甘油。称取培养基各成分，加热溶于1L超纯水中。用1mol/L NaOH溶液调节pH值至8.5~9.0，分装于250mL锥形瓶中，每瓶约50mL，用牛皮纸包扎，120℃高压蒸汽灭菌25min，冷却后于4℃冰箱保存备用。
固体培养基配制：取上述已经配好的液体培养基300ml，1.5%-2%(4.5-6g)琼脂粉加入到1L的三角瓶中，同时将洗净烘干的培养皿用牛皮纸包扎紧与培养基一起放入高压灭菌锅中，120℃、高压蒸汽灭菌25min，取出、置于已紫外灭菌10~20min的超净工作台中，稍冷后制备固体平板培养基，将培养基倒于培养皿中，铺展均匀、冷却后制成平板，放入4℃冰箱中保存、备用。
（3）将工作菌液加入到预先设置好磺胺类抗生素浓度梯度的白色不透明96孔微孔板中，制作磺胺类抗生素和工作菌液的反应体系，其中每孔总体积为200μL（100μL的工作菌液和100μL不同浓度的磺胺类抗生素，空白为100μL的工作菌液和100μL超纯水）；使工作菌液与磺胺类抗生素充分反应15min。为了减少实验误差，相同条件下，每个浓度进行9次重复实验。
（4）采用synergy H2微孔板分光光度计检测微孔板发光强度RLU，利用实验组与对照组的发光强度计算出不同浓度磺胺类抗生素对青海弧菌Q67的发光抑制率E，以磺胺类抗生素不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的发光抑制率为纵坐标，利用基于Matlab自编的Logistic函数对不同浓度磺胺类抗生素与发光抑制率E进行非线性拟合。
式中：I0为空白对照样的RLU平均值，I为各浓度9次平行样的RLU平均值；最后，利用基于Matlab自编的Logit函数拟合计算出的EC50值的负对数pEC50，以pEC50作为毒性指标，判断磺胺类抗生素的毒性大小，pEC50的数值越大，毒性越大。
8种磺胺类抗生素对青海弧菌Q67的浓度-效应数据均可通过Logit函数拟合，其拟合模型参数（回归参数α和β值，统计参数R 2 和RMSE）见表1，表中8种磺胺类抗生素的R 2值均大于0.90且所有RMSE值均小于0.03，这表示了拟合质量的可靠性。图1~图8则显示了这8种磺胺类抗生素的浓度-效应数拟合曲线(CRCs)，呈经典S型。毒性最大的是 SQ，最小的是 2-SPZ。以pEC50作为毒性指标，pEC50的数值越大，毒性越大，则8种磺胺类抗生素对青海弧菌Q67的毒性顺序为：SQ(pEC50=5.28)＞SPY(pEC50=4.86)＞SMM(pEC50=4.51)＞SMZ(pEC50=4.41)＞SMR(pEC50=4.26)＞SM2(pEC50=4.25)＞SMP(pEC50=3.93)＞2-SPZ(pEC50=3.49)。
表1 8种磺胺类抗生素理化性质及浓度-效应拟合曲线参数
磺胺类抗生素 CAS号 相对分子量 储备液/(mol·L<sup>-1</sup>) <i>α</i> <i>β</i> <i>R</i><sup>2</sup> <i>RMSE</i> pEC<sub>50</sub>
磺胺吡啶(SPY) 144-83-2 249.289 2.246E-04 3.21 1.27 0.961 0.007 4.86
磺胺甲基嘧啶(SMR) 127-79-7 264.304 5.371E-04 2.71 1.33 0.978 0.004 4.26
磺胺二甲嘧啶(SM2) 57-68-1 278.330 3.305E-04 2.23 1.26 0.902 0.007 4.25
磺胺甲氧哒嗪(SMP) 80-35-3 280.303 4.852E-04 3.07 1.53 0.966 0.004 3.93
磺胺甲恶唑(SMZ) 723-46-6 253.278 4.343E-04 3.39 1.44 0.927 0.010 4.41
磺胺喹噁啉(SQ) 59-40-5 300.336 2.664E-05 3.24 1.17 0.971 0.003 5.28
磺胺-6-甲氧嘧啶(SMM) 1220-83-3 280.303 1.284E-04 2.85 1.29 0.914 0.006 4.51
磺胺氯吡嗪钠(2-SPZ) 102-65-8 284.722 7.024E-03 6.84 2.80 0.997 0.009 3.49
注：α、β为拟合参数；R 2 、RMSE为模型统计量；EC 50为半数效应浓度；pEC 50 为半数效应浓度的负对数
本实施例显示出显著的测试效果：运用指示生物青海弧菌Q67测试磺胺类抗生素的毒性，通过计算不同浓度磺胺类抗生素对青海弧菌Q67的发光抑制率的大小，并绘制浓度-效应数拟合曲线，通过基于Matlab自编的Logit函数拟合获取磺胺类抗生素的毒性指标pEC50，从而可以有效、快速、准确地判断磺胺类抗生素的综合毒性大小。

Claims (1)

1.一种应用青海弧菌Q67测试磺胺类抗生素生物毒性的方法，其特征在于具体步骤为：
（1）将磺胺类抗生素标准品按照溶解度配制成标准溶液，并置于4℃冰箱保存待用；
（2）培养青海弧菌Q67使其达到对数生长期，得到青海弧菌Q67菌液，将其作为工作菌液；
（3）将步骤（1）配制的标准溶液加入到白色不透明96孔微孔板中，设置好微孔板中磺胺类抗生素浓度梯度，然后向白色不透明96孔微孔板中加入步骤（2）得到的工作菌液，制作磺胺类抗生素和工作菌液的反应体系；每孔总体积为200μL，实验组每孔含100μL工作菌液和100μL不同浓度的磺胺类抗生素，空白对照组每孔含100μL工作菌液和100μL超纯水；使磺胺类抗生素和工作菌液充分反应15min，然后用微孔板分光光度计测定其发光强度RLU，相同条件下，每个磺胺类抗生素浓度进行9次重复实验，并取平均值；
（4）根据实验组与空白对照组的发光强度计算出不同浓度磺胺类抗生素对青海弧菌Q67的发光抑制率E，以磺胺类抗生素不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的发光抑制率为纵坐标，利用基于Matlab自编的Logistic函数对不同浓度磺胺类抗生素与发光抑制率E进行非线性拟合：
；
式中：I0为空白对照组的RLU平均值，I为实验组各浓度9次平行样的RLU平均值；最后，利用基于Matlab自编的Logit函数拟合计算出的EC50值的负对数pEC50，以pEC50作为毒性指标，判断磺胺类抗生素的毒性大小，pEC50的数值越大，毒性越大。
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