CN107045026A - 一种利用青海弧菌q67检测真菌毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用青海弧菌Q67检测真菌毒素的方法。a、青海弧菌Q67(Vibrio‑qinghaiensis sp.‑Q67)菌悬液的制备：将青海弧菌Q67置于质量分数为0.8％的氯化钠溶液中制成菌悬液，使得菌悬液的相对发光强度为10～30万RLU；b、将待测样品用质量分数为0.8％的氯化钠溶液稀释成不同浓度，按照菌悬液与不同浓度的待测样品稀释液1：9的体积比进行混合，于22±2℃静置15min，再测定发光强度，再以真菌毒素标准品建立标准曲线，选取待测样品稀释液中真菌毒素含量为1～40μg/ml的作为标准样，计算不同浓度的各待测样品稀释液中的真菌毒素含量，以此标准样计算待测液体或固体样品中的真菌毒素的含量；所述的真菌毒素为：Fumonisin b1、呕吐毒素、玉米烯酮、棒曲霉素和/或桔青霉素。

Description

一种利用青海弧菌q67检测真菌毒素的方法
技术领域
本发明属于天然产物领域，具体涉及一种利用青海弧菌q67检测真菌毒素的方法。
背景技术
青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensis sp.Q67)是我国学者发现的一种淡水发光细菌。目前已广泛应用在燃油毒性的检测(Application number CN 200910057297)、雾霾天污染物毒性的检测(Application number CN 201510098688)、兽药残留检测(Applicationnumber CN 201520337859)、农药残留检测(Application number CN 201210581427)等。其也应用于真菌毒素萎焉酸的检测，但真菌毒素种类繁多，主要包括：呕吐毒素(Deoxynivalenol，DON)、玉米烯酮(Zearalenone，ZON)，赭曲霉素A(Ochratoxin A，OA)，棒曲霉素(Patulin)，桔青霉素(Citrinin)。对于这些真菌毒素是否能用青海弧菌Q67检测并无相关研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用青海弧菌q67检测真菌毒素的方法。
本发明的利用青海弧菌Q67检测真菌毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、青海弧菌Q67(Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67)菌悬液的制备：将青海弧菌Q67置于质量分数为0.8％的氯化钠溶液中制成菌悬液，使得菌悬液的相对发光强度为10～30万RLU(Relative Light Units)；
b、将待测样品用质量分数为0.8％的氯化钠溶液稀释成不同浓度，按照菌悬液与不同浓度的待测样品稀释液1：9的体积比进行混合，于22±2℃静置15min，再测定发光强度，再以真菌毒素标准品建立标准曲线，建立标准曲线时真菌毒素标准品和待测样品的发光细菌的抑制率是依据公式lgct＝blgΓt+lga进行计算，其中，Γ是测定值，c是测试样本的百分率，b是斜率，lga是斜距，由此根据真菌毒素标准品的标准曲线拟合获得回归方程，选取待测样品稀释液中真菌毒素含量为1～40μg/ml的作为标准样，计算不同浓度的各待测样品稀释液中的真菌毒素含量，以此标准样计算待测液体或固体样品中的真菌毒素的含量；
所述的真菌毒素为：Fumonisin b1、呕吐毒素(Deoxynivalenol，DON)、玉米烯酮(Zearalenone，ZON)、棒曲霉素(Patulin)和/或桔青霉素(Citrinin)。
所述的步骤(2)中的于22±2℃静置优选为于22℃静置。
本发明中调节pH值的物质可以是为氢氧化钠和盐酸。
本发明的青海弧菌Q67(Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67)属于现有技术中已知的菌株，很多期刊文献中都有记载，如魏胜非等的报道(魏胜非，陈彩云，许德玄。基于青海弧菌Q67的饮用水取水环境虚拟检测仪器。东北师范大学报(自然科学版)，2010，42(2)，143～146。)。该菌株本申请人也持有，并且保证可以自本发明申请日起20年内向公众提供。
本发明将待测样品稀释后，按照9：1的比例与相对发光强度为10～30万RLU的青海弧菌Q67菌悬液混合，静置反应，测定发光强度，再根据真菌毒素标准品对青海弧菌发光强度影响的标准曲线计算待测梯度稀释样品中真菌毒素的含量，选取待测稀释样品中真菌毒素含量为1～40μg/ml的作为标准样，以此标准样计算样品中的真菌毒素的含量。按照本发明的方法对待测样品(固体和液体样品)进行测定，与液相色谱法测定的结果无显著差异，测定结果准确度高。本发明的利用青海弧菌Q67检测真菌毒素的方法中的菌悬液的相对发光强度控制、菌悬液与待测稀释样品的配比以及选取待测稀释样品中真菌毒素含量为1～40μg/ml的作为标准样进行计算，这些都是为了使得本发明的方法能够准确的测定样品中真菌毒素的含量。本发明由于方法简单，无需大型仪器设备，测定所需的微弱发光仪设备成本较为低廉，测定结果准确，因此具有简便、快速、准确的优点，易于普及和推广应用。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
一、青海弧菌Q67的培养和收集：
Q67培养基的配制：在1000mL的蒸馏水中加入13.6mg KH2PO4，35.8mg Na2HPO4·12H2O，0.25g MgSO4·7H2O，0.61gMgCl2·6H2O，33.0mg CaCl2，1.34g NaHCO3，1.54g NaCl，5.0g酵母提取物(yeast extract)，5.0g胰蛋白胨(tryptone)和3.0g甘油(glycerin)，混合均匀后，灭菌备用。青海弧菌Q67在上述Q67培养基中以180rpm的转速、22℃的温度遮光培养16-18小时，由此得到Q67培养液。
在22℃条件下，将1ml的上述Q67培养液在25000g转速下离心3分钟，收集菌体。用质量分数0.8％NaCl重悬菌体及校准，确保其初始的发光强度在100,000至300,000RLU之间，得到青海弧菌Q67菌悬液备用(现配现用)。
二、发光检测
真菌毒素呕吐毒素(Deoxynivalenol，DON)和桔青霉素(Citrinin)起初溶于甲醇(g/mL)；Fumonisin b1，赭曲霉素A(Ochratoxin A，OTA)，玉米烯酮(Zearalenone，ZEN)和棒曲霉素(Patulin)溶于乙腈(g/mL)(也可以溶于甲醇)，之后用质量分数0.8％NaCl水溶液稀释至一定浓度梯度(5,10,15,20,25and 30μg/mL)，得到待测真菌毒素溶液。准备好三个比色皿，每皿各加入待测真菌毒素溶液0.9ml，制成三个平行样。对照也取三个比色皿，分别加入0.9ml0.8％NaCl，同样也设置三个平行样。依次加入0.1ml上述发光强度在100,000至300,000RLU之间的青海弧菌Q67菌悬液，放置15min后用发光检测仪(BPCL-16Y ultra-weakluminescence analyzer)依次(相隔1s)检测各测试比色皿的发光强度，每个毒素浓度检测3个生物学重复，每个生物学重复检测3次，每次间隔1s。计算相对发光强度。
发光细菌的抑制率的计算依据国际标准ISO 11348-3:2007(E)，并且利用如下公式：lgct＝blgΓt+lga，其中
其中，Γ是测定值，c是测试样本的百分率，b是斜率，lga是斜距
结果如表1所示：
表1
由表1可见，本发明的方法测定目标真菌毒素，其相关性非常好。
依据专利号：ZL201110328458.6，发明名称为：一种利用青海弧菌Q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法的检测方法，检测其它真菌毒素。
计算公式：E(％)＝(I0-I)/I0×100，其中I0为对照组RLU值，I为毒素组RLU值
结果如表2所示：
表2
其结果显示，依据此方法计算的相关性(R2值)并不理想，不适应所有检测的真菌毒素。因此，我们的方法是在已有专利基础上的改进，适应所有真菌毒素的检测。
实施例2：
分别将Fusarium proliferatum、Fusarium semitectum、Fusarium oxvsporium接种到PDA培养基中培养，28℃180rpm培养4天，得到发酵培养物，分离出菌液。
伏马毒素提取：取20mL的菌液，与20mL体积分数70％甲醇水溶液混合，超声1h，用0.1M的氢氧化钠溶液调节pH值到5.8-6.5之间，得到超声液。利用强离子交换柱子(500mg,6mL)纯化萃取物。纯化过程：用8mL的100％甲醇，8mL的体积分数75％甲醇水溶液依次活化柱子，将10mL超声液过柱后，依次用8mL的体积分数75％甲醇水溶液，8mL的100％甲醇清洗柱子，最后用0.1％乙酸的甲醇溶液冲柱子并收集该部分溶液，40℃旋蒸干燥后，溶于100％的甲醇(分析纯级别)，用0.22μm有机相滤膜过滤后放在－20℃冰箱内待测。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇/玉米赤霉烯酮毒素提取：取20mL的菌液，与20mL正己烷混合分层后，除去上层正己烷相。加入20mL乙酸乙酯提取，混合后离心3000g，4℃，5min分层。用乙酸乙酯提取3次后，对所得乙酸乙酯相进行旋蒸得到样品，溶于100％甲醇(分析纯级别),用0.22μm有机相滤膜过滤后放在－20℃冰箱内待测。待测样品分别采用液相色谱法和发光细菌法检测各真菌毒素的含量。
发光细菌法检测程序：
发光强度在100,000至300,000RLU之间的青海弧菌Q67菌悬液的制备同实施例1。
检测方法：
初始时，检测0.1mL青海弧菌Q67菌悬液的发光强度RLU为0min发光量(I0)。用质量分数0.8％NaCl水溶液稀释待测样品至一定浓度梯度(5,10,15,20,25and 30μg/mL)，按照青海弧菌Q67菌悬液与不同浓度的待测样品稀释液1：9的体积比进行混合，于22℃静置15min，测定相对发光强度，每个浓度设三个平行样,取平均值为15min发光量(I15)。以质量分数为0.8％的氯化钠溶液为对照。测定条件为：低背景管；1s计数；自动背景扣除。测试在22℃恒温室中进行。根据试验测得的相对发光强度，计算样品的相对发光抑制率。重复三次测定。参照实施例1的方法，以相应的病原真菌培养物对应的抑光值建立标准曲线，浓度设置分别为：如果原始菌液的抑光值超过50％，其浓度进一步稀释成5,10,20,40,60,and80％，反侧(原始菌液的抑光值没有超过50％)，其浓度进一步稀释成20,40,60,80,and90％。数据处理如上实施例1，结果如表3所示。
表3
液相色谱法检测程序：
在高效液相色谱-串联质谱系统(AB SCIEX公司，美国)即HPLC-MS/MS上进行。色谱柱为C18色谱柱，100×2.1mm，3μm颗粒大小，Thermo,USA。
伏马毒素检测：流动相(A：乙腈和B：5mM醋酸铵)。流动相中的A0.5分钟内从0％增加至10％，1到8分钟增加至50％，然后从8至8.5分钟下降到10％，并于该浓度持续额外的0.5分钟，最后返回到初始条件。泵的流量为0.4mL/min，在450℃条件下以氮气作为雾化气体。在多重反应检测模式下，选定阳电喷雾电离(ESI)[M+H]+为质谱检测用以确定最佳的参数。FB1的母离子设置为m/z 722.5，子离子设置为m/z 352.4和334.4。FB2的母离子设置为m/z 706.4，子离子设置为m/z 336.4和318.4。质谱分析最佳条件为：离子喷雾电压5500V，入口电压10V，出口电压14V，锥孔电压60/65V及碰撞能量50V。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇/玉米赤霉烯酮毒素检测：流动相(A：乙腈和B：0.1％乙酸)。流动相中A1分钟内从10％增加至15％，1到7.5分钟增加至65％，然后从7.5至9.5分钟下降到10％，并于该浓度持续额外的0.5分钟，最后返回到初始条件。泵的流量为0.5mL/min，在450℃条件下以氮气作为雾化气体。电喷雾电离(ESI)选择[M-H]-。DON的母离子设置为m/z295.1，子离子设置为m/z 265.1和138。的质谱分析条件为：离子喷雾电压-4500V，入口电压-10V，出口电压-17V，锥孔电压-60V及碰撞能量-15/-21V。ZEN的母离子设置为m/z317.2，子离子设置为m/z 175.0和273.1。质谱分析条件为：离子喷雾电压-4500V，入口电压-10V，出口电压-17V，锥孔电压-66V及碰撞能量-32/-28V。
以真菌毒素标准液制作标准曲线，结果如表4所示。
表4
由此表明，采用发光细菌法鉴定的菌液毒性大小分别为Fusarium proliferatum(IC50＝17.49)>Fusarium oxysporium(IC50＝33.33)>Fusarium semitectumv(IC50＝92.56),这与HPLC所测定的结果无显著差异(p>0.05)，由此说明用本发明的利用青海弧菌Q67可以定性或者半定量的检测真菌培养液(发酵产物)的毒性。

Claims (2)

1.一种利用青海弧菌Q67检测真菌毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、青海弧菌Q67(Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67)菌悬液的制备：将青海弧菌Q67置于质量分数为0.8％的氯化钠溶液中制成菌悬液，使得菌悬液的相对发光强度为10～30万RLU；
b、将待测样品用质量分数为0.8％的氯化钠溶液稀释成不同浓度，按照菌悬液与不同浓度的待测样品稀释液1：9的体积比进行混合，于22±2℃静置15min，再测定发光强度，再以真菌毒素标准品建立标准曲线，建立标准曲线时真菌毒素标准品和待测样品的发光细菌的抑制率是依据公式lgct＝blgГt+lga进行计算，其中，Γ是测定值，c是测试样本的百分率，b是斜率，lga是斜距，由此根据真菌毒素标准品的标准曲线拟合获得回归方程，选取待测样品稀释液中真菌毒素含量为1～40μg/ml的作为标准样，计算不同浓度的各待测样品稀释液中的真菌毒素含量，以此标准样计算待测液体或固体样品中的真菌毒素的含量；
所述的真菌毒素为：Fumonisin b1、呕吐毒素、玉米烯酮、棒曲霉素和/或桔青霉素。
2.根据权利要求1所述的利用青海弧菌Q67检测真菌毒素的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的于22±2℃静置为于22℃静置。
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