CN102507447A - 一种利用青海弧菌q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用青海弧菌Q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法。它是将待测样品稀释后，按照5～10∶1的比例与相对发光强度为10～30万RLU的青海弧菌Q67菌悬液混合，静置反应，测定发光强度，再根据萎蔫酸标准品对青海弧菌发光强度影响的标准曲线计算待测梯度稀释样品中萎蔫酸的含量，选取待测稀释样品中萎蔫酸含量为1～40μg/ml的作为标准样，以此标准样计算样品中的萎蔫酸的含量。按照本发明的方法对待测样品(固体和液体样品)进行测定，与液相色谱法测定的结果无显著差异，测定结果准确度高。本发明由于方法简单，无需大型仪器设备，测定所需的微弱发光仪设备成本较为低廉，测定结果准确，因此具有简便、快速、准确的优点，易于普及和推广应用。
Description
技术领域：
本发明属于生物分析方法领域，具体涉及一种利用青海弧菌Q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法。
背景技术：
随着人类社会发展与进步，环境和食品污染问题日趋严重，严重威胁到人类生命健康。国际上主要考虑的环境和食品污染物包括生物污染物和化学污染物这两大类。前者主要包括病原菌毒素和转基因产品的潜在影响；后者主要包括农药、重金属、亚硝酸盐类等。真菌毒素是真菌产生的小分子有毒次生代谢产物，主要包括环状肽类、萜烯类化合物、生物碱类、酯类、杂环化合物及其衍生物等。寄生真菌及其产生的真菌毒素已严重影响到农作物的产品品质，同时危害着人类健康。近年来，随着生活质量的提高和无公害农产品的普及，加强食品中的真菌毒素的监测已经成为食品安全领域的研究热点。
水果是人们日常消费最常见的食品。然而多种水果采后易受病原菌侵染而发生病害，损失严重。这些病原菌不仅能引起或加重水果病害的发生，而且还能产生真菌毒素，通过污染食品而危害人类的健康。萎蔫酸是其中较为常见的一种真菌毒素，以其较强的毒性而受到人们的关注。
目前，萎蔫酸的检测方法以仪器分析方法为主。这些方法具有检测限低、精确度高等特点，但却难以满足实时、迅速、在线分析的要求。发光细菌(如青海弧菌Q67)由于其独特的生理特性，并与现代光电检测手段匹配的特点而备受关注。利用发光细菌的发光强度作为指标来监测有毒物质，越来越受到重视，已成为生物检测领域的重要技术。
发明内容：
本发明的目的是提供一种科学、快速、准确的利用青海弧菌Q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法。
本发明的利用青海弧菌Q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测液体样品的pH调整至pH1.5～2.5，然后用乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯后溶于甲醇中，过滤后作为待测样品；或将待测固体样品加入水中，搅打粉碎，使样品中的萎蔫酸完全溶于水中，再过滤，调整滤液pH为pH1.5～2.5，然后用乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯后溶于甲醇中，过滤后作为待测样品；
(2)青海弧菌Q67(Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67)菌悬液的制备：将青海弧菌Q67置于质量分数为0.8％的氯化钠溶液中制成菌悬液，使得菌悬液的相对发光强度为10～30万RLU(Relative Light Units)；
(3)将待测样品用质量分数为0.8％的氯化钠溶液稀释成不同浓度，按照菌悬液与不同浓度的待测样品稀释液1∶5～10的体积比进行混合，于20～25℃静置10～15min，再测定发光强度，再以萎蔫酸标准品建立标准曲线，计算不同浓度的各待测样品稀释液中的萎蔫酸含量，选取待测样品稀释液中萎蔫酸含量为1～40μg/ml的作为标准样，以此标准样计算待测液体或固体样品中的萎蔫酸的含量。
所述的步骤(3)中的于20～25℃静置优选为于22℃静置。
本发明中调节pH值的物质可以是为氢氧化钠和盐酸。
本发明的青海弧菌Q67(Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67)属于现有技术中已知的菌株，很多期刊文献中都有记载，如魏胜非等的报道(魏胜非，陈彩云，许德玄。基于青海弧菌Q67的饮用水取水环境虚拟检测仪器。东北师范大学报(自然科学版)，2010，42(2)，143～146。)。该菌株本申请人也持有，并且保证可以自本发明申请日起20年内向公众提供。
本发明将待测样品稀释后，按照5～10∶1的比例与相对发光强度为10～30万RLU的青海弧菌Q67菌悬液混合，静置反应，测定发光强度，再根据萎蔫酸标准品对青海弧菌发光强度影响的标准曲线计算待测梯度稀释样品中萎蔫酸的含量，选取待测稀释样品中萎蔫酸含量为1～40μg/ml的作为标准样，以此标准样计算样品中的萎蔫酸的含量。按照本发明的方法对待测样品(固体和液体样品)进行测定，与液相色谱法测定的结果无显著差异，测定结果准确度高。本发明的利用青海弧菌Q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法中的菌悬液的相对发光强度控制、菌悬液与待测稀释样品的配比以及选取待测稀释样品中萎蔫酸含量为1～40μg/ml的作为标准样进行计算，这些都是为了使得本发明的方法能够准确的测定样品中萎蔫酸的含量。本发明由于方法简单，无需大型仪器设备，测定所需的微弱发光仪设备成本较为低廉，测定结果准确，因此具有简便、快速、准确的优点，易于普及和推广应用。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例中的测定发光强度的设备为BPCL-16Y微弱发光仪(中国科学院生物物理研究所，北京)
实施例1：
a)配制萎蔫酸标准液40μg/ml：每升的40μg/ml萎蔫酸标准液配制方法如下：将40mg萎蔫酸溶解于1L质量分数为0.8％的氯化钠溶液(溶剂为水)中。以此萎蔫酸标准液作为待测样品。
b)青海弧菌Q67菌悬液的制备：将青海弧菌Q67的培养液，经3000rpm离心10min，收集菌体，用质量分数0.8％的氯化钠溶液制成悬浮液，相对发光强度控制在30万RLU。
c)检测方法：按照菌悬液与待测样品(萎蔫酸标准液40μg/ml)1∶5的体积比进行混合，于20℃静置10min，取1mL测定相对发光强度，以质量分数0.8％的氯化钠溶液为对照。测定条件为：低背景管；1s计数；自动背景扣除。测试在20℃恒温室中进行。根据试验测得的相对发光强度，计算待测样品的相对发光抑制率为86.26±0.61％。相对发光抑制率(％)＝(1-试样的RLU/对照的RLU)×100％。重复三次测定。以萎蔫酸标准品建立标准曲线，对照标准曲线计算待测样品中萎蔫酸含量。
标准曲线绘制：分别配制浓度范围在1，5，10，20，30，40μg/ml的标准液(溶于0.8％NaCl)，按照上述方法进行测定，计算标准曲线为y＝1.56x+24.24，其中y表示相对发光抑制率(％)，x表示萎蔫酸浓度(μg/ml)。
根据上述标准曲线和所测的样品的相对抑光率，得到萎蔫酸含量为39.76±0.39μg/ml，与实际值经统计分析无显著差异(p＞0.05)。
实施例2：按以下方法检测萎蔫酸含量
a)配制萎蔫酸标准液1μg/ml：每升的1μg/ml萎蔫酸标准液配制方法如下：将1mg萎蔫酸溶解于1L质量分数为0.8％的氯化钠溶液中。
b)青海弧菌Q67菌悬液的制备：将青海弧菌Q67的培养液，以3000rpm离心10min，收集菌体，用质量分数0.8％的氯化钠溶液制成悬浮液，相对发光强度控制在10万RLU。
c)检测方法：按照菌悬液与待测样品(萎蔫酸标准液0.1μg/ml)1∶10的体积比进行混合，于25℃静置15min，取1mL测定相对发光强度，以质量分数0.8％的氯化钠溶液为对照。测定条件为：低背景管；1s计数；自动背景扣除。测试在25℃恒温室中进行。根据试验测得的相对发光强度，计算样品的相对发光抑制率为24.12±0.30％。相对发光抑制率(％)＝(1-试样的RLU/对照的RLU)×100％。重复三次测定。参照实施例1的方法以萎蔫酸标准品建立标准曲线，对照标准曲线计算样品中萎蔫酸含量。
测得萎蔫酸含量为1.16±0.24μg/ml，与实际值经统计分析无显著差异(p＞0.05)。
实施例3：按以下方法检测萎蔫酸含量
a)配制萎蔫酸标准液20μg/ml：每升的20μg/ml萎蔫酸标准液配制方法如下：将20mg萎蔫酸溶解于1L质量分数为0.8％的氯化钠溶液中。
b)青海弧菌Q67菌悬液的制备：将青海弧菌Q67的培养液，经3000rpm离心10min，收集菌体，用质量分数为0.8％的氯化钠溶液制成悬浮液，相对发光强度控制在20万RLU。
c)检测方法：按照菌悬液与待测样品(萎蔫酸标准液20μg/ml)1∶8的体积比进行混合，于22℃静置15min，取1mL测定发光强度，以质量分数为0.8％的氯化钠溶液为对照。测定条件为：低背景管；1s计数；自动背景扣除。测试在22℃恒温室中进行。根据试验测得的相对发光强度，计算样品的相对发光抑制率为55.69±0.37％。相对发光抑制率(％)＝(1-试样的RLU/对照的RLU)×100％。重复三次测定。参照实施例1的方法，以萎蔫酸标准品建立标准曲线，对照标准曲线计算样品中萎蔫酸含量。
测得萎蔫酸含量为20.16±0.34μg/ml，与实际值经统计分析无显著差异(p＞0.05)。
实施例4：本方法与液相色谱法比较检测层出镰刀菌的萎蔫酸含量
a)用1M HCl或NaOH分别将100mL察氏培养液的pH调到4、5、6、7、8、9后，分别加入层出镰刀菌，进行振荡培养(25℃，150rpm)10天后，过滤获得菌液100ml。将滤液pH值调至1.5，然后用等量的乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯后的浸膏溶于10ml甲醇，过滤后作为待测样品。分别采用液相色谱法和发光细菌法检测萎蔫酸含量。
发光细菌法检测程序：
青海弧菌Q67菌悬液的制备：将青海弧菌Q67的培养液，经3000rpm离心10min，收集菌体，用质量分数为0.8％的氯化钠溶液制成悬浮液，相对发光强度控制在30万RLU。
检测方法：用质量分数为0.8％氯化钠溶液将待测样品稀释成不同浓度(10倍、50倍、100倍、500倍)，按照菌悬液与不同浓度的待测样品稀释液1∶10的体积比进行混合，于22℃静置15min，取1mL测定相对发光强度，以质量分数为0.8％的氯化钠溶液为对照。测定条件为：低背景管；1s计数；自动背景扣除。测试在22℃恒温室中进行。根据试验测得的相对发光强度，计算样品的相对发光抑制率。重复三次测定。参照实施例1的方法，以萎蔫酸标准品建立标准曲线，对照标准曲线计算各不同浓度的待测样品稀释液中萎蔫酸含量，选择萎蔫酸含量在1～40μg/ml之间的待测样品稀释液作为标准样，计算待测样品中的萎蔫酸含量，结果如表1所示。
液相色谱法检测程序：
在日本岛津Shimadzu LC-20A系统上进行。色谱柱为C18反相柱(250×4.6mm，5μm)。流动相A为含0.1％三氟乙酸(v/v)，流动相B为乙腈。梯度洗脱：0-3min，10％B；3-25min，10％-100％B；25-30min，100％B。流速1.0mL/min，上样量为10μL，检测波长254nm。以萎蔫酸标准液制作标准曲线，结果如表1所示。
表1：两种方法测定不同pH值培养条件下层出镰刀菌萎蔫酸产量
表1表明，不同pH值培养条件下层出镰刀菌的萎蔫酸产量不同。采用HPLC法与发光细菌法所测定的结果无显著差异(p＞0.05)，由此说明用本发明的利用青海弧菌Q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法进行测定，测定结果准确。
实施例5：检测腐烂香蕉中的萎蔫酸含量
萎蔫酸的提取：将腐烂香蕉样品(50g)加入200ml蒸馏水中，搅打粉碎，过滤，将滤液pH值调至2.5，然后用等量的乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯后浸膏溶于0.5ml甲醇，经过滤后作为待测样品。
发光细菌法：
青海弧菌Q67菌悬液的制备：将青海弧菌Q67的培养液，经3000rpm离心10min，收集菌体，用质量分数为0.8％的氯化钠溶液制成悬浮液，相对发光强度控制在20万RLU。
检测方法：用质量分数为0.8％氯化钠溶液将待测样品稀释成不同浓度(5倍、20倍、50倍、100倍)，按照菌悬液与各不同浓度的待测样品稀释液1∶5的体积比进行混合，于22℃静置15min，取1mL测定发光强度，以质量分数为0.8％的氯化钠溶液为对照。测定条件为：低背景管；1s计数；自动背景扣除。测试在22℃恒温室中进行。根据试验测得的相对发光强度，计算样品的相对发光抑制率。重复三次测定。参照实施例1的方法，以萎蔫酸标准品建立标准曲线，对照标准曲线计算各不同浓度的待测样品稀释液中萎蔫酸含量，选择萎蔫酸含量在1～40μg/ml之间的待测样品稀释液作为标准样，计算待测样品中的萎蔫酸含量。测定腐烂香蕉样品中的萎蔫酸含量为5.2±0.4μg/g。
液相色谱法检测程序：
在日本岛津Shimadzu LC-20A系统上进行。色谱柱为C18反相柱(250×4.6mm，5μm)。流动相A为含0.1％三氟乙酸(v/v)，流动相B为乙腈。梯度洗脱：0-3min，10％B；3-25min，10％-100％B；25-30min，100％B。流速1.0mL/min，上样量为10μL，检测波长254nm。测得萎蔫酸含量为4.9±0.3μg/g。
发光细菌法所测萎蔫酸含量，经统计分析与液相色谱法结果无显著差异(p＞0.05)。由此说明本发明的利用青海弧菌Q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法能准确测定样品中萎蔫酸的含量。
Claims (2)
1.一种利用青海弧菌Q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测液体样品的pH调整至pH1.5～2.5，然后用乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯后溶于甲醇中，过滤后作为待测样品；或将待测固体样品加入水中，搅打粉碎，使样品中的萎蔫酸完全溶于水中，再过滤，调整滤液pH为pH1.5～2.5，然后用乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯后溶于甲醇中，过滤后作为待测样品；
(2)青海弧菌Q67(Vibrio-qinghaiensis sp.-Q67)菌悬液的制备：将青海弧菌Q67置于质量分数为0.8％的氯化钠溶液中制成菌悬液，使得菌悬液的相对发光强度为10～30万RLU；
(3)将待测样品用质量分数为0.8％的氯化钠溶液稀释成不同浓度，按照菌悬液与不同浓度的待测样品稀释液1∶5～10的体积比进行混合，于20～25℃静置10～15min，再测定发光强度，再以萎蔫酸标准品建立标准曲线，计算不同浓度的各待测样品稀释液中的萎蔫酸含量，选取待测样品稀释液中萎蔫酸含量为1～40μg/ml的作为标准样，以此标准样计算待测液体或固体样品中的萎蔫酸的含量。
2.根据权利要求1所述的利用青海弧菌Q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，按照菌悬液与不同浓度的待测样品稀释液1∶5～10的体积比进行混合，再于22℃静置。
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