CN105368735A - 青海弧菌q67b及其分离筛选和应用 - Google Patents

青海弧菌q67b及其分离筛选和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及青海弧菌Q67B(CCTCC？NO：M2010104)及其分离筛选和应用，属微生物学的发光细菌分离筛选和应用的技术领域，该菌是从青海省青海湖所产的青海鳇鱼体表采集到的发光菌，经分离纯化，再经温度适应性筛选，又经pH值适应性筛选，最后经毒物反应灵敏性筛选，得到的一种淡水发光菌。该菌在清洁水体中发光恒定，接触到毒物，其发光强度会明显衰减，据此可推定毒物的毒性大小及毒物的浓度。在用于地表水如内陆河流湖泊、地下水及排放污水的毒性检测时，可在10℃～37℃下进行，无需调节水样渗透压和pH值，10～15分钟内就可判别水样的毒性大小，快速、方便、灵敏。上述优点是海洋发光菌所不具备的。

Description

青海弧菌Q67B及其分离筛选和应用
技术领域
本发明涉及青海弧菌Q67B及其分离筛选和应用，属微生物学的发光细菌分离筛选和应用的技术领域。青海弧菌Q67B是淡水发光菌。从青海省青海湖所产的青海鳇鱼体表采集淡水发光菌，经分离、纯化、筛选后，得到一种新的淡水发光菌种菌株，16SrDNA序列分析表明，该菌属弧菌属，定名为“青海弧菌Q67B(VibrioqinghaiensisQ67B)”。2010年1月28日将其送交武汉市中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2010104，保藏中心地址为：中国武汉市武汉大学典型培养物保藏中心，邮编：430072。
背景技术
发光菌是一大类能自身发出荧光的细菌，在条件合适时，其发光恒定。若发光菌接触到有毒有害物质时，其发光就会受抑制，抑制程度与所接触的毒物的毒性大小和毒物的浓度有关。因此发光菌可用于检测样品的生物学毒性。上世纪八十年代，发光菌就己被用于环境污染的检测。我国也于1995年发布了将发光菌用于水环境污染的毒性检测的国家标准。但不管国际还是国内，均使用来源于海洋的海洋发光菌，该发光菌适应海洋的高盐度(相当于NaCl的质量百分浓度为3％)和高渗透压的环境条件，否则无法生长，更不会发光。当用于陆地淡水样品时，必须在淡水样品中添加NaCl，直至淡水样品中NaC1的最终质量百分浓度为3％，否则淡水样品中的海洋发光菌很快就丧失发光能力，甚至细菌的细胞因低渗透压而吸水破裂，无法继续进行检测。上世纪九十年代，随着发光菌应用于环境污染的毒性检测日益增多，许多研究者发现，对有些种类的淡水样品，其检测结果往往与其它生物检测结果不太吻合，尤其是那些含有重金属盐的样品。究其原因，乃对淡水样品添加NaCl所致。所以有研究者改用葡萄糖取代NaCl来调节渗透压，使之与质量百分浓度为3％的NaCl溶液等渗，但效果并不理想，检测结果的重复性较差。这是因为海洋发光菌必需要有一定浓度的Na离子存在时才能保持良好而稳定的发光性能，缺乏Na离子的环境对海洋发光菌的发光是不利的，必然影响到海洋发光菌发光的稳定性，最终导致检测结果的严重偏差。如果使用不需要Na离子并适应较低的渗透压就能正常发光的淡水发光菌作为检测用发光细菌，对淡水样品就不必添加NaCl，避免了应用海洋发光菌作为检测用发光细菌的不足。
发明内容
本发明的一个目的是公开一种青海弧菌Q67B，其特征在于，
(1)形态特征：该菌的菌体呈杆状微弯，大小介于0.5～0.7微米×1.5～2微米，革兰氏染色阴性，用利夫生鞭毛染色，观察到单极生鞭毛似蝌蚪状，细胞内累积聚β-羟基丁酸；
(2)生理生化特征：该菌适于生长的温度范围和pH范围分别为4℃～40℃和pH5～pH10，对弧菌抑制剂2，4-二氨基-6，7-二异丙基喋啶敏感，具有耐盐、耐高渗透压和低渗透压的能力，能在介于质量百分浓度0％～8％之间的NaCl溶液中生长和发光；
(3)基因特征：16SrDNA序列：
AGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTGGTGTTGTTAATAGCAGCATCATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTGGATTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAACTGGTTCACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGCGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCTACAGAATCCTGCGGAGACGCGGGAGTGCCTTCGGGAACTGTAAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTGGTTAGTTTAACCGCACTTTCTTCGGAGAGAGTGGAGGACGATCACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC。
所述的青海弧菌Q67B的进一步特征在于，该菌最适于生长的温度和pH值分别为25℃和pH9.0。
本发明的另一个目的是推出一种分离筛选青海弧菌Q67B的方法。为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案，其特征在于，该菌经过四个步骤，筛选得到：第一步获取淡水发光菌，从青海省青海湖所产的青海鳇鱼体表采集到的发光菌，经分离纯化，获得淡水发光菌；第二步温度适应性筛选，在两个不同的温度下对第一步获得的淡水发光菌进行温度适应性筛选；第三步pH值适应性筛选，在两个不同的pH值下对第二步获得的淡水发光菌进行pH值适应性筛选；第四步毒物反应灵敏性筛选，用重金属盐和有机毒物对第三步获得的淡水发光菌先后进行两次毒物反应灵敏性筛选。
所述的分离筛选青海弧菌Q67B的方法的进一步特征在于，所述的两个不同的温度是4℃和40℃。
所述的分离筛选青海弧菌Q67B的方法的进一步特征在于，所述的两个不同的pH值是pH5.0和pH11.0。
所述的分离筛选青海弧菌Q67B的方法的进一步特征在于，所述的重金属盐和有机毒物分别是HgCl2和苯酚。
青海弧菌Q67B具有宽的生长和发光的温度范围：4℃～40℃；具有宽的生长和发光的pH值范围：pH5.0～pH11.0；具有耐盐、耐高渗透压和低渗透压的能力，能在介于质量百分浓度0％～8％之间的NaCl溶液中生长和发光；对毒物的毒性反应灵敏，特别适合用于陆地淡水样品或固体样品的水相抽提物的生物毒性快速检测和淡水样品的生物毒性快速筛选。
现结合附图详细说明本发明的技术方案。一种分离筛选青海弧菌Q67B的方法，其特征在于，具体操作步骤：
第一步获取淡水发光菌
(1)取新鲜的青海省青海湖所产的青海鳇鱼，截成小段，室温下放置10小时～24小时，在暗室内检视，在发绿色荧光的亮点处，用灭菌的接种针括取，划线于培养皿内，
(2)将第一步(1)所述的培养皿置于暗室中，20℃培养10小时～18小时，从中挑取发光良好的单菌落，
(3)对第一步(2)所述的单菌落进行划线分离培养三～五次，取得单细胞纯培养物，转接于斜面试管，培养生长后得斜面菌种，即淡水发光菌，保存于4℃冰箱备用，
(4)所述的培养皿和斜面试管内需用固体培养基，该固体培养基的配方为，MgSO42.47g，MgCO30.79g，MgBr20.09g，MgCl20.109g，CaCO30.103g，KCl0.122g，NaCl8.29g，Mg(HCO3)20.50g，酵母膏5g，胰胨5g，甘油3g，琼脂20g，溶于1000mL蒸馏水中，pH9.0，121℃灭菌20分钟，贮于4℃的冰箱备用；
第二步温度适应性筛选
(1)将第一步(3)所得的斜面菌种，转接于五～十支斜面试管，
(2)将第二步(1)所述的斜面试管置于暗室中，20℃培养16小时～18小时，检查发光状况，选出发光良好的菌支，
(3)将第二步(2)选出的菌支分别转接于五～十支斜面试管，
(4)将第二步(3)所述的试管置于暗室中，20℃培养16小时～18小时，检查发光状况，选出发光良好的菌支，
(5)将第二步(4)选出的菌支分别划线转接于十个平皿，平分成两组，为第Ⅰ组和第Ⅱ组，分别于4℃和40℃培养16小时～18小时，
(6)另取十个平皿，平分成两组，为第Ⅲ组和第Ⅳ组，每组五个平皿，暗室中挑取第Ⅰ组的每一个平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于第Ⅲ组的五个平皿，暗室中挑取第Ⅱ组的每一个平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于第Ⅳ组的五个平皿，将第Ⅲ组和第Ⅳ组分别于40℃和4℃培养16小时～18小时，
(7)另取十支斜面试管，分别对应上述第Ⅲ组和第Ⅳ组的每个平皿，将各平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于十支对应斜面试管中，20℃培养16小时～18小时，
(8)另取五支斜面试管，选取第二步(7)所述的十支斜面试管中发光良好的五个斜面，分别转接到五支斜面试管中，得到五支斜面菌种，保存于4℃冰箱内备用，
(9)所述的斜面试管和平皿内需用固体培养基，该固体培养基与上述的第一步需用的固体培养基完全相同，
(10)经第二步温度适应性筛选操作后所得的菌种，具有耐低温4℃和耐高温40℃的性能；
第三步pH值适应性筛选
(1)取第二步的(8)所得的斜面菌种，分别转接于pH5.0和pH11.0的液体培养基中，各为五瓶，20℃振荡培养16小时～18小时，
(2)在经第三步(1)操作后的pH5.0和pH11.0液体培养物中，各选取其中发光良好的培养物，进行交换转接，即将pH5.0液体培养基中选中的菌种转接于pH11.0液体培养基中，而将pH11.0液体培养基中选中的菌种转接于pH5.0液体培养基中，20℃振荡培养16小时～18小时，
(3)另取十个平皿，在经第三步(2)操作后的液体培养基中，分别选取pH5.0和pH11.0中发光良好的培养物为菌种，将选中的菌种分别划线于平皿中，来源于pH5.0和pH11.0的各五个平皿，20℃培养16小时～18小时，
(4)取十个斜面试管，在经第三步(3)操作后的十个平皿中，各选取发光良好的单菌落，将每一个选中的单菌落各自转接于所述的斜面试管中，共十支，20℃培养16小时～18小时，选取其中发光良好的斜面试管6支，得到经pH值适应性筛选的菌种，贮于4℃的冰箱备用，
(5)第三步需用固体培养基，该固体培养基与第一步和第二步需用的固体培养基完全相同，第三步需用液体培养基，该液体培养基的配方为，MgSO42.47g，MgCO30.79g，MgBr20.09g，MgCl20.109g，CaCO30.103g，KCl0.122g，NaCl8.29g，Mg(HCO3)20.50g，酵母膏5g，胰胨5g，甘油3g，溶于1000mL蒸馏水中，分别用柠檬酸和氨水调节它们的pH，得到pH值分别为pH5.0和pH11.0的液体培养基，121℃灭菌20分钟，固体培养基和液体培养基贮于4℃的冰箱备用；
第四步毒物反应灵敏性筛选
采用两种有代表性的毒物：HgCl2和苯酚，分别以倍增梯度浓度系列观察淡水发光菌对上述毒物反应的大小，以相对发光强度和EC50大小为衡量毒物抑制淡水发光菌的指标，利用下式计算相对发光强度：
EC50指相对发光强度为50％时的毒物浓度，测光仪为生物和化学测光计，
(1)取第三步(5)得到的6支菌种，分别经二次斜面转接活化后，分别用蒸馏水洗下菌苔，充分混匀后，分别得到6支淡水发光菌液，用发光检测法评估它们对毒物的反应，先评估它们对HgCl2的反应，每次仅用1支淡水发光菌液，操作如下：
在8个测量杯中各加2mlHgCl2样品，形成浓度梯度系列，每亇浓度设2个平行，空白对照用蒸馏水，也设2个平行，然后逐个加入所述的那支淡水发光菌液的菌液，使测量杯中的淡水发光菌浓度为5×107/ml，作用15分钟，立即测定各测量的发光强度，最后以对照发光值作基准，利用公式[1]计算相对发光强度，并推算出EC50值，其余5支作相同的操作，用EC50值判断上述的6支淡水发光菌对同一毒物的反应能力，EC50值越小，表示该菌种的菌株的毒物反应越灵敏，筛选得到对HgCl2反应最为灵敏的菌种3株，分别制成斜面，进行下述测试筛选，
(2)取第四步(1)得到的3株菌种的斜面，分别经二次斜面转接活化后，分别用蒸馏水洗下菌苔，充分混匀后，分别得到3支淡水发光菌液，用发光检测法评估它们对苯酚的反应，每次仅用1支淡水发光菌液，操作如下：
在8个测量杯中各加2ml苯酚样品，使形成浓度梯度系列，每亇浓度设2个平行，空白对照用蒸馏水，也设2个平行，然后向各测量杯内逐个加入上述的那支淡水发光菌液，使测量杯中的淡水发光菌浓度为5×107/ml，作用15分钟，立即测定各测量的发光强度，最后以对照发光值作基准，利用公式[1]计算相对发光强度，并推算出EC50值，其余2支作相同的操作，比较上述检测所得的3个EC50值，取EC50值最小的，与最小EC50值对应的菌株就是分离筛选得到的青海弧菌Q67B。
本发明的另一个目的是提供一种用青海弧菌Q67B检测毒物的生物毒性的方法，其特征在于，具体操作步骤：
第一步菌液制备：取青海弧菌Q67B的菌种斜面1支，转接于试管斜面上，20℃培养18小时，再转接一次，20℃培养18小时，发光明亮，用蒸馏水1ml～2ml洗下斜面上的菌苔，转入烧杯，稀释至光密度0D600为0.03，得到菌液，立即用于以下操作；
第二步被测样品溶液制备：
若被测样品为固体，用质量百分浓度介于0％～8％的NaCl溶液配制浓度分别为0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L的被测样品溶液，若被测样品为液体，用质量百分浓度介于0％～8％的NaCl溶液稀释成如下浓度梯度的被测样品溶液：100％(V/V)、75％(V/V)、50％(V/V)、25％(V/V)、10％(V/V)；
第三步发光检测：取测光仪的专用测量杯12个，将第二步所述的每种浓度的被测毒物溶液注入2个测量杯，注入量为2ml，在余下的2个测量杯，各注入2ml质量百分浓度介于0％～8％的NaCl溶液，作空白对照，为每个测量杯注入第一步制备的菌液，注入量为50μl，15分钟后，用测光仪测量各测量杯的发光强度，按下式计算各测量杯的相对发光强度：
第四步得到被测毒物的EC50值：以相对发光强度为纵座标，被测样品浓度为横座标，将第三步的计算得到的相对发光强度分别记在各自的对应的被测毒物溶液的浓度位点上，依次通过所述浓度位点画出一根光滑的曲线，利用所述的曲线找出相对发光强度50％对应的被测毒物溶液的浓度，就是被测毒物的EC50值。
与背景技术相比，本发明有以下优点：
1、本发明所涉的青海弧菌Q67B具有宽的生长和发光的温度范围：4℃～40℃，温度适应性强，无论在高温的夏天还是寒冷的冬天，只要气温在4℃～40℃的范围内，就能正常使用。而海洋发光菌的温度适应范围为15℃～20℃。
2、本发明所涉的青海弧菌Q67B具有宽的生长和发光的pH值范围：pH5.0～pH11.0。
3、本发明所涉的青海弧菌Q67B具有较强的耐盐、耐高渗透压和低渗透压的能力，能在质量百分浓度介于0％～8％之间的NaCl溶液中生长和发光。
4、本发明所涉的青海弧菌Q67B，当被用于检测淡水或陆地样品的毒性时，不需要添加NaCl和将NaCl溶液的质量百分浓度调节至3％，而是直接就可检测，因此避免了由于添加NaCl而导致样品毒性发生变化，使检测结果发生偏离。
5、本发明所涉的青海弧菌Q67B对毒物的反应灵敏，对各类污染源有良好的毒物反应性能，可在15min～30min内作出其毒性大小的判断，适于在现场(野外或室内外)做即时快速检测。
6、本发明所涉的青海弧菌Q67B生长和发光的pH值范围为pH5.0～pH11.0，几乎覆盖了允许排放的各类污水的pH值，因而对污水样品，无需考察其pH值，不必调节水样的pH值，直接就能进行检测，不仅方便，而且可避免由调节pH值可能带来的对样品生物毒性的改变。海洋发光菌只能在中性pH值时才可应用，由于pH值不同带来的偏差就无法避免了。
综上，本发明所涉的青海弧菌Q67B特别适合用于陆地淡水样品或固体样品的水相抽提物的生物毒性快速检测或淡水样品的生物毒性快速筛选，不论在野外、现场或室内外，均可应用。
附图说明
图1是青海弧菌Q67B的菌体及其单极生鞭毛(利夫森鞭毛染色，相差显微镜观察×1000)。
图2是青海弧菌Q67B的菌体及其单极生鞭毛(电子显微镜负染色照片)。
图3是青海弧菌Q67B的分离筛选的流程图。
图4是用青海弧菌Q67B检测毒物的生物毒性的流程图。
具体实施方式
现结合实施例详细说明本发明的技术方案。实施例1～3是上文中的“发明内容”所述的分离筛选青海弧菌Q67B的方法的三个实施方式，完全按该方法的操作步骤进行操作。为使行文简洁，下文中实施例1～3中的每一个仅罗列关键的技术数据。
实施例1分离筛选青海弧菌Q67B的方法的第一种实施方式
第一步，(1)中，室温下放置10小时，(2)中，20℃培养10小时，(3)中，进行划线分离培养重复三次；
第二步，(1)中，转接于五支斜面试管，(2)中，20℃培养16小时，(3)中，分别转接于五支斜面试管，(4)中，20℃培养16小时，(5)中，第Ⅰ组和第Ⅱ组分别于4℃和40℃培养16小时，(6)中，第Ⅲ组和第Ⅳ组分别于40℃和4℃培养16小时，(7)中，20℃培养16小时；
第三步，(1)中，20℃振荡培养16小时，(2)中，20℃振荡培养16小时，(3)中，20℃振荡培养16小时，(4)中，20℃培养16小时，(5)中，20℃培养16小时；
第四步，(2)中，与最小EC50值对应的菌株就是分离筛选得到的青海弧菌Q67B。
实施例2分离筛选青海弧菌Q67B的方法的第二种实施方式
第一步，(1)中，室温下放置17小时，(2)中，20℃培养14小时，(3)中，进行划线分离培养重复三次；
第二步，(1)中，转接于八支斜面试管，(2)中，20℃培养17小时，(3)中，分别转接于八支斜面试管，(4)中，20℃培养17小时，(5)中，第Ⅰ组和第Ⅱ组分别于4℃和40℃培养17小时，(6)中，第Ⅲ组和第Ⅳ组分别于40℃和4℃培养17小时，(7)中，20℃培养17小时；
第三步，(1)中，20℃振荡培养17小时，(2)中，20℃振荡培养17小时，(3)中，20℃振荡培养17小时，(4)中，20℃培养17小时，(5)中，20℃培养17小时；
第四步，(2)中，与最小EC50值对应的菌株就是分离筛选得到的青海弧菌Q67B。
实施例3分离筛选青海弧菌Q67B的方法的第三种实施方式
第一步，(1)中，室温下放置24小时，(2)中，20℃培养18小时，(3)中，进行划线分离培养五次；
第二步，(1)中，转接于十支斜面试管，(2)中，20℃培养18小时，(3)中，分别转接于十支斜面试管，(4)中，20℃培养18小时，(5)中，第Ⅰ组和第Ⅱ组分别于4℃和40℃培养18小时，(6)中，第Ⅲ组和第Ⅳ组分别于40℃和4℃培养18小时，(7)中，20℃培养18小时；
第三步，(1)中，20℃振荡培养18小时，(2)中，20℃振荡培养18小时，(3)中，20℃振荡培养18小时，(4)中，20℃培养18小时，(5)中，20℃培养18小时；
第四步，(2)中，与最小EC50值对应的菌株就是分离筛选得到的青海弧菌Q67B。
实施例4～6完全按照上文中的“发明内容”所述的用青海弧菌Q67B检测毒物的生物毒性的方法的操作步骤进行操作，为使行文简洁，下文中实施例4～6中的每一个仅罗列关键的技术数据。
实施例4应用青海弧菌Q67B检测HgCl2的生物毒性
第一步中，用质量百分浓度为0.85％的NaCl溶液1ml～2ml洗下斜面上的菌苔；
第二步中，被测样品是HgCl2；
第三步中，结果显示，青海弧菌Q67B与HgCl2接触15min的EC50值是0.05mg/L。
实施例5应用青海弧菌Q67B检测苯酚的生物毒性
第一步中，以质量百分浓度为0.85％的NaCl溶液1ml～2ml洗下斜面上的菌苔；
第二步中，被测样品是苯酚；
第三步中，结果显示，青海弧菌Q67B与苯酚接触15min的EC50值是150mg/L。
实施例6应用青海弧菌Q67B检测污染源的水样毒性
第一步中，用质量百分浓度为0.85％的NaCl溶液1ml～2ml洗下斜面上的菌苔；
第二步中，被测样品是焦化行业等13个行业排放的污水，按照国家标准(GB/T15441—1955)采集水样，采样点是各个企业的排污口，并在采样2小时内检测完毕，临检测前用质量百分浓度为0.85％的NaCl溶液稀释水样，浓度分别为：100％(V/V)、75％(V/V)、50％(V/V)、25％(V/V)、10％(V/V)；
第三步，发光检测：
结果显示，青海弧菌Q67B与各类水样接触15min的EC50值见表1，另附以HgCl2和苯酚的相当毒物浓度作为毒性评价对照。
表1各行业排放的污水的发光菌毒性测定结果和评价
上述13个行业中，农药工业排放的污水，毒性最强，其EC50值和HgCl2的相当毒物浓度分别为0.11％和5.99mg/L，漂染工业排放的污水，毒性最小，其EC50值和HgCl2的相当毒物浓度分别为92.09％和0.12mg/L，其他行业排放的污水，毒性介于两者之间。
SEQUENCELISTING
<110>朱文杰
<120>青海弧菌Q67B及其分离筛选和应用
<130>
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>1219
<212>DNA
<213>VibrioQ67BQinghai
<400>1

Claims (8)

1.一种青海弧菌Q67B，其特征在于，
(1)形态特征：该菌的菌体呈杆状微弯，大小介于0.5～0.7微米×1.5～2微米，革兰氏染色阴性，用利夫生鞭毛染色，观察到单极生鞭毛似蝌蚪状，细胞内累积聚β-羟基丁酸；
(2)生理生化特征：该菌适于生长的温度范围和pH范围分别为4℃～40℃和pH5～pH10，对弧菌抑制剂2，4-二氨基-6，7-二异丙基喋啶敏感，具有耐盐、耐高渗透压和低渗透压的能力，能在介于质量百分浓度0％～8％之间的NaCl溶液中生长和发光；
(3)基因特征：16SrDNA序列：
AGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTGGTGTTGTTAATAGCAGCATCATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTGGATTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAACTGGTTCACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGCGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCTACAGAATCCTGCGGAGACGCGGGAGTGCCTTCGGGAACTGTAAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTGGTTAGTTTAACCGCACTTTCTTCGGAGAGAGTGGAGGACGATCACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC。
2.根据权利要求1所述的青海弧菌Q67B，其特征在于，该菌最适于生长的温度和pH值分别为25℃的和pH9.0。
3.一种分离筛选权利要求1所述的青海弧菌Q67B的方法，其特征在于，该菌经过四个步骤，筛选得到：第一步获取淡水发光菌，从青海省青海湖所产的青海鳇鱼体表采集到的发光菌，经分离纯化，获得淡水发光菌；第二步温度适应性筛选，在两个不同的温度下对第一步获得的淡水发光菌进行温度适应性筛选；第三步pH值适应性筛选，在两个不同的pH值下对第二步获得的淡水发光菌进行pH值适应性筛选；第四步毒物反应灵敏性筛选，用重金属盐和有机毒物对第三步获得的淡水发光菌先后进行两次毒物反应灵敏性筛选。
4.根据权利要求3所述的分离筛选方法，其特征在于，所述的两个不同的温度是4℃和40℃。
5.根据权利要求3所述的分离筛选方法，其特征在于，所述的两个不同的pH值是pH5.0和pH11.0。
6.根据权利要求3所述的分离筛选方法，其特征在于，所述的重金属盐和有机毒物分别是HgCl2和苯酚。
7.根据权利要求3、4、5或6所述的分离筛选方法，其特征在于，具体操作步骤：
第一步获取淡水发光菌
(1)取新鲜的青海省青海湖所产的青海鳇鱼，截成小段，室温下放置10小时～24小时，在暗室内检视，在发绿色荧光的亮点处，用灭菌的接种针括取，划线于培养皿内，
(2)将第一步(1)所述的培养皿置于暗室中，20℃培养10小时～18小时，从中挑取发光良好的单菌落，
(3)对第一步(2)所述的单菌落进行划线分离培养三～五次，取得单细胞纯培养物，转接于斜面试管，培养生长后得斜面菌种，即淡水发光菌，保存于4℃冰箱备用，
(4)所述的培养皿和斜面试管内需用固体培养基，该固体培养基的配方为，MgSO42.47g，MgCO30.79g，MgBr20.09g，MgCl20.109g，CaCO30.103g，KCl0.122g，NaCl8.29g，Mg(HCO3)20.50g，酵母膏5g，胰胨5g，甘油3g，琼脂20g，溶于1000mL蒸馏水中，pH9.0，121℃灭菌20分钟，贮于4℃的冰箱备用；
第二步温度适应性筛选
(1)将第一步(3)所得的斜面菌种，转接于五～十支斜面试管，
(2)将第二步(1)所述的斜面试管置于暗室中，20℃培养16小时～18小时，检查发光状况，选出发光良好的菌支，
(3)将第二步(2)选出的菌支分别转接于五～十支斜面试管，
(4)将第二步(3)所述的试管置于暗室中，20℃培养16小时～18小时，检查发光状况，选出发光良好的菌支，
(5)将第二步(4)选出的菌支分别划线转接于十个平皿，平分成两组，为第Ⅰ组和第Ⅱ组，分别于4℃和40℃培养16小时～18小时，
(6)另取十个平皿，平分成两组，为第Ⅲ组和第Ⅳ组，每组五个平皿，暗室中挑取第Ⅰ组的每一个平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于第Ⅲ组的五个平皿，暗室中挑取第Ⅱ组的每一个平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于第Ⅳ组的五个平皿，将第Ⅲ组和第Ⅳ组分别于40℃和4℃培养16小时～18小时，
(7)另取十支斜面试管，分别对应上述第Ⅲ组和第Ⅳ组的每个平皿，将各平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于十支对应斜面试管中，20℃培养16小时～18小时，
(8)另取五支斜面试管，选取第二步(7)所述的十支斜面试管中发光良好的五个斜面，分别转接到五支斜面试管中，得到五支斜面菌种，保存于4℃冰箱内备用，
(9)所述的斜面试管和平皿内需用固体培养基，该固体培养基与上述的第一步需用的固体培养基完全相同，
(10)经第二步温度适应性筛选操作后所得的菌种，具有耐低温4℃和耐高温40℃的性能；
第三步pH值适应性筛选
(1)取第二步的(8)所得的斜面菌种，分别转接于pH5.0和pH11.0的液体培养基中，各为五瓶，20℃振荡培养16小时～18小时，
(2)在经第三步(1)操作后的pH5.0和pH11.0液体培养物中，各选取其中发光良好的培养物，进行交换转接，即将pH5.0液体培养基中选中的菌种转接于pH11.0液体培养基中，而将pH11.0液体培养基中选中的菌种转接于pH5.0液体培养基中，20℃振荡培养16小时～18小时，
(3)另取十个平皿，在经第三步(2)操作后的液体培养基中，分别选取pH5.0和pH11.0中发光良好的培养物为菌种，将选中的菌种分别划线于平皿中，来源于pH5.0和pH11.0的各五个平皿，20℃培养16小时～18小时，
(4)取十个斜面试管，在经第三步(3)操作后的十个平皿中，各选取发光良好的单菌落，将每一个选中的单菌落各自转接于所述的斜面试管中，共十支，20℃培养16小时～18小时，选取其中发光良好的斜面试管6支，得到经pH值适应性筛选的菌种，贮于4℃的冰箱备用，
(5)第三步需用固体培养基，该固体培养基与第一步和第二步需用的固体培养基完全相同，第三步需用液体培养基，该液体培养基的配方为，MgSO42.47g，MgCO30.79g，MgBr20.09g，MgCl20.109g，CaCO30.103g，KCl0.122g，NaCl8.29g，Mg(HCO3)20.50g，酵母膏5g，胰胨5g，甘油3g，溶于1000mL蒸馏水中，分别用柠檬酸和氨水调节它们的pH，得到pH值分别为pH5.0和pH11.0的液体培养基，121℃灭菌20分钟，固体培养基和液体培养基贮于4℃的冰箱备用；
第四步毒物反应灵敏性筛选
采用两种有代表性的毒物：HgCl2和苯酚，分别以倍增梯度浓度系列观察淡水发光菌对上述毒物反应的大小，以相对发光强度和EC50大小为衡量毒物抑制淡水发光菌的指标，利用下式计算相对发光强度：
EC50指相对发光强度为50％时的毒物浓度，测光仪为上海植物生理研究所出品的生物和化学测光计，
(1)取第三步(5)得到的6支菌种，分别经二次斜面转接活化后，分别用蒸馏水洗下菌苔，充分混匀后，分别得到6支淡水发光菌液，用发光检测法评估它们对毒物的反应，先评估它们对HgCl2的反应，每次仅用1支淡水发光菌液，操作如下：
在8个测量杯中各加2mlHgCl2样品，形成浓度梯度系列，每亇浓度设2个平行，空白对照用蒸馏水，也设2个平行，然后逐个加入所述的那支淡水发光菌液的菌液，使测量杯中的淡水发光菌浓度为5×107/ml，作用15分钟，立即测定各测量的发光强度，最后以对照发光值作基准，利用公式[1]计算相对发光强度，并推算出EC50值，其余5支作相同的操作，用EC50值判断上述的6支淡水发光菌对同一毒物的反应能力，EC50值越小，表示该菌种的菌株的毒物反应越灵敏，筛选得到对HgCl2反应最为灵敏的菌种3株，分别制成斜面，进行下述测试筛选，
(2)取第四步(1)得到的3株菌种的斜面，分别经二次斜面转接活化后，分别用蒸馏水洗下菌苔，充分混匀后，分别得到3支淡水发光菌液，用发光检测法评估它们对苯酚的反应，每次仅用1支淡水发光菌液，操作如下：
在8个测量杯中各加2ml苯酚样品，使形成浓度梯度系列，每亇浓度设2个平行，空白对照用蒸馏水，也设2个平行，然后向各测量杯内逐个加入上述的那支淡水发光菌液，使测量杯中的淡水发光菌浓度为5×107/ml，作用15分钟，立即测定各测量的发光强度，最后以对照发光值作基准，利用公式[1]计算相对发光强度，并推算出EC50值，其余2支作相同的操作，比较上述检测所得的3个EC50值，取EC50值最小的，与最小EC50值对应的菌株就是分离筛选得到的青海弧菌Q67B。
8.一种用权利要求1所述的青海弧菌Q67B检测毒物的生物毒性的方法，其特征在于，具体操作步骤：
第一步菌液制备：取青海弧菌Q67B的菌种斜面1支，转接于试管斜面上，20℃培养18小时，再转接一次，20℃培养18小时，发光明亮，用蒸馏水1ml～2ml洗下斜面上的菌苔，转入烧杯，稀释至光密度0D600为0.03，得到菌液，立即用于以下操作；
第二步被测样品溶液制备：
若被测样品为固体，用质量百分浓度介于0％～8％的NaCl溶液配制浓度分别为0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L的被测样品溶液，若被测样品为液体，用质量百分浓度介于0％～8％的NaCl溶液稀释成如下浓度梯度的被测样品溶液：100％(V/V)、75％(V/V)、50％(V/V)、25％(V/V)、10％(V/V)；
第三步发光检测：取测光仪的专用测量杯12个，将第二步所述的每种浓度的被测毒物溶液注入2个测量杯，注入量为2ml，在余下的2个测量杯，各注入2ml质量百分浓度介于0％～8％的NaCl溶液，作空白对照，为每个测量杯注入第一步制备的菌液，注入量为50μl，15分钟后，用测光仪测量各测量杯的发光强度，按下式计算各测量杯的相对发光强度：
第四步得到被测毒物的EC50值：以相对发光强度为纵座标，被测样品浓度为横座标，将第三步的计算得到的相对发光强度分别记在各自的对应的被测毒物溶液的浓度位点上，找出的相对发光强度50％时对应的被测毒物溶液的浓度，就是被测毒物的EC50值。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108362532A (zh) * 2017-12-27 2018-08-03 深圳市有为环境科技有限公司 一种渗透压调节液及利用其进行毒物检测的方法
CN110484591A (zh) * 2019-08-25 2019-11-22 桂林理工大学 一种应用青海弧菌q67测试磺胺类抗生素生物毒性的方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105274017A (zh) * 2014-06-25 2016-01-27 陆祖军 一种耐高温产聚羟基丁酸酯细菌的分离筛选方法
CN105624260B (zh) * 2014-10-28 2019-11-12 中国石油化工股份有限公司 一种采用酵母菌评价油田钻井液生物毒性的方法
CN106755286B (zh) * 2016-12-17 2018-11-06 桂林理工大学 一种利用青海弧菌q67测试采油废水生物毒性的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1187537A (zh) * 1997-01-07 1998-07-15 华东师范大学 青海弧菌干粉制剂
CN102507447A (zh) * 2011-10-25 2012-06-20 中国科学院华南植物园 一种利用青海弧菌q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1187537A (zh) * 1997-01-07 1998-07-15 华东师范大学 青海弧菌干粉制剂
CN102507447A (zh) * 2011-10-25 2012-06-20 中国科学院华南植物园 一种利用青海弧菌q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周世明: "应用青海弧菌Q67检测水质急性毒性的研究", 《中国优秀学位论文全文数据库(电子期刊)医药卫生辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108362532A (zh) * 2017-12-27 2018-08-03 深圳市有为环境科技有限公司 一种渗透压调节液及利用其进行毒物检测的方法
CN110484591A (zh) * 2019-08-25 2019-11-22 桂林理工大学 一种应用青海弧菌q67测试磺胺类抗生素生物毒性的方法

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