CN108690863A - 一种利用便携式血糖仪测定污泥重金属微生物毒性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种评价污泥重金属微生物毒性的方法，主要是通过多次传代培养获得活性稳定的大肠杆菌，将其培养至稳定期后期收集并离心；然后使用生理盐水将上述菌液连续清洗两遍，再将其重悬制备成大肠杆菌液混合于含有葡萄糖的污泥重金属毒性液，使用便携式血糖仪测定培养30min前后混合液的葡萄糖浓度，当混合液中有重金属离子存在时，大肠杆菌生长受到抑制，消耗葡萄糖量相对减少，将葡萄糖消耗量折算成大肠杆菌生长抑制率。本发明方法采用大肠杆菌作为实验微生物，采用便携式血糖仪测定葡萄糖浓度，可在较短的反应时间内灵敏高效、稳定准确地评价污泥重金属的微生物毒性。

Description

一种利用便携式血糖仪测定污泥重金属微生物毒性的方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种利用便携式血糖仪测定污泥重金属微生物毒性的方法。
背景技术
污泥是污水处理的副产物，是在给水和废水不同处理过程产生的各类沉淀物、漂浮物。随着经济发展水平的提高，城镇化进程的加快，城市污泥产量与日俱增，截至2015年年底，我国的污泥产量(含水率80％)已达3807万吨/年，预计2020年末污泥产量4547万吨/年，急需无害化处理和资源化处置。污泥成分复杂，含有很多丰富的营养物质，经过适当处理可以作为肥料，改良土壤，促进植物生长；经过处理产生的沼气，可以作为能源物质，解决一定的能源问题。同时，污泥中也含有多种对环境有毒有害的重金属，这些重金属含量较高且不能经过有效降解作用被土壤吸收，如处理不当，容易对环境造成十分严重的破坏，从而影响到公共健康。
现有的污泥重金属毒性测定方法主要包括污泥重金属总量测定法和有效态测定法，然而这些方法均需对样品进行大量的前处理，使用贵重仪器对样品进行检测，操作复杂且成本较高。评估环境污染物的急性生物毒性在环境监测与早期预警系统中发挥了重要作用，传统的生物毒性评价主要依靠植物、无脊椎动物和鱼类，但是，这些方法大多数都十分昂贵和耗时。无处不在的微生物提供了一种替代方案来解决这些问题，基于微生物的生物毒性评估方法可以分为光学方法和电化学方法，光学方法基于酶相关的颜色反应或生物发光微生物自然产生的生物发光，毒物的存在抑制了生物发光微生物的酶活性或呼吸活性，导致颜色深度或生物发光强度的下降，1995年国家环保局颁布了《水质急性生物毒性发光细菌法》即国标GB/T15441-1955，并于1995年3月1日开始在全国实行，然而，光学方法由于需要复杂的光学仪器和稀有的微生物菌株而成本高，这阻碍了它们的实际应用和普及。传统的电化学方法通过将微生物呼吸强度转换为电信号来评估生物毒性，然而，这种方法容易受到温度，压力和盐度的影响导致准确度不高。因此，本研究使用便携式血糖仪测定微生物培养体系前后葡萄糖浓度大小，以微生物毒性为评价指标，评价污泥重金属毒性，既节省了测试成本，也提高了毒性测试的准确性和稳定性，为污泥安全利用提供重要的评价方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种一种评价污泥重金属微生物毒性的方法，本发明方法采用活性稳定的大肠杆菌作为实验微生物，可以在较短的反应时间内灵敏高效、稳定准确的评价污泥重金属的微生物毒性。
本发明一种评价污泥重金属微生物毒性的方法，包括如下步骤：
(1)取污泥，经提取液提取后获得污泥重金属毒性液；
(2)制备微生物悬液；
(3)将LB培养基、葡萄糖溶液和污泥重金属毒性液按照一定比例混合制成培养液，然后加入微生物悬液，培养微生物，分别测定培养前和培养后培养液中的葡萄糖浓度；
(4)根据培养前后葡萄糖浓度折算出微生物生长抑制率，由此评价污泥中重金属微生物毒性大小。
作为优选，所述步骤(1)中，提取液为HCl。
作为优选，所述步骤(1)中污泥重金属毒性液的提取条件为：室温下，取适量干污泥于离心管中，加入0.1mol/L HCl，经振荡器振荡再静置后过滤得污泥重金属毒性液。
本发明方法中的污泥为自然风干后的污泥
作为优选，所述微生物为大肠杆菌。
作为优选，所述步骤(4)中步骤(4)中，微生物悬液：LB培养基：葡萄糖溶液：重金属毒性液的体积比为8:10:1:1。
作为优选，所述步骤(4)的培养条件为：混合液中葡萄糖浓度为7mmol/L，温度为30℃，摇床转速为150r/min，培养时间为30min。培养前后，分别测定葡萄糖浓度。
作为优选，所述大肠杆菌(Escherichia.coli)选自保藏号为：CGMCC 1.1564的大肠杆菌。作为优选，大肠杆菌悬液制备方法如下：
1)对大肠杆菌进行传代培养，传代培养时每次培养到稳定期前期收集菌体，进行下一次传代培养，通过3～7次传代培养获得活性稳定的大肠杆菌，将其培养至稳定期后期收集并离心；
2)将离心过后的大肠杆菌用适量生理盐水清洗，然后用生理盐水重悬制备成大肠杆菌悬液。
作为优选，所述传代培养的条件为：每次按照10％接种量(v/v)将大肠杆菌培养基接种于新鲜培养基进行培养，培养温度为30℃，摇床转速为150r/min。
作为优选，所述大肠杆菌悬液中成菌密度为2×108个/mL。
本发明方法中，当混合液中无重金属离子时，大肠杆菌生长代谢消耗葡萄糖，当混合液中有重金属离子存在时，大肠杆菌生长代谢受到抑制，消耗葡萄糖量相对减少；混合液中重金属离子浓度越高，大肠杆菌生长代谢受抑制越大。
本发明方法中，经过传代培养的大肠杆菌，将其培养至稳定期后期并离心，离心后获得大肠杆菌，然后制备成大肠杆菌液。稳定期后期的菌体细胞总数达到最高峰，处于较为饥饿状态，菌体活性稳定，可以提高大肠杆菌在后续处理过程中的耐受能力。具体过程为：将处于稳定后期的大肠杆菌培养液在5000～6000r/min转速下离心并收集菌体。
本发明方法中，离心后收集的大肠杆菌应加入生理盐水进行清洗，最后用生理盐水重悬后制备成大肠杆菌悬液，使用生理盐水清洗菌体的主要原因为排除原培养基中杂质对后期实验的干扰。具体过程为：离心后收集的大肠杆菌加入适量生理盐水，在5000～6000r/min转速下离心并收集菌体，此过程重复两次。
本发明方法中，应当用生理盐水将收集的大肠杆菌重悬，制备成菌密度为2×108个/mL的大肠杆菌菌悬液，在实验前4h于4℃条件下保存。大肠杆菌清洗或稀释采用去离子水、生理盐水或磷酸盐缓冲液，优选生理盐水。
本发明方法中，应设置对照实验，具体为大肠杆菌悬液、LB培养基、葡萄糖溶液和污泥重金属毒性液混合培养时，用生理盐水替换污泥重金属毒性液进行培养，培养条件不变，培养时间结束后，使用血糖仪测定葡萄糖浓度。
本发明方法中，将污泥重金属毒性液培养实验的葡萄糖浓度与对照实验的葡萄糖浓度进行对比分析，计算污泥重金属毒性液对大肠杆菌生长的抑制率。
本发明方法中，需排除pH在内的污泥重金属微生物毒性，应调节测试样品pH值至7.0。重金属毒性液的稀释液为去离子水。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.通过多次传代培养获得活性稳定、处于饥饿状态的大肠杆菌，将该大肠杆菌悬液用于污泥重金属微生物毒性评价，实验结果表明大肠杆菌用于污泥重金属的毒性评价，灵敏度高、实验效果好。
2.葡萄糖作为介质添加到大肠杆菌生长的混合液，能够作为大肠杆菌生长所需的第一碳源被消耗。培养结束后，葡萄糖含量的高低，能够准确地反映出污泥重金属毒性液对大肠杆菌生长代谢的影响，准确性高、稳定性好。
3.选用便携式血糖仪测定混合液的葡萄糖浓度，具有仪器简易、操作简单快速、能够现场实时测定和成本低廉等特点。
综上所述，本发明所述方法具有快速高效、精确量化、真实可靠、成本低廉等诸多优点，具有很高的实用价值和广泛的推广应用前景，有望成为污泥重金属污染的重要检测评价手段。
附图说明
图1为反应原理及步骤示意图。
图2为Cu2+污水对大肠杆菌生长的抑制情况。
图3为Zn2+污水对大肠杆菌生长的抑制情况。
图4为Cd2+污水对大肠杆菌生长的抑制情况。
图5为Pb2+污水对大肠杆菌生长的抑制情况。
图6为不污泥重金属毒性液对大肠杆菌生长的抑制情况。
具体实施方式
本发明中，使用紫外－可见分光光度计调节大肠杆菌悬液菌密度为2×108个/mL。使用便携式血糖仪测定葡萄糖浓度，从而计算出污泥重金属毒性液对大肠杆菌生长的抑制率。
1、调节大肠杆菌悬液浓度
取适量大肠杆菌悬液于比色管中进行梯度稀释，将稀释的菌液样品滴在血细胞计数板上，在显微镜下计算4～5个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再以此为依据，估算总菌数。然后按比例加入生理盐水稀释大肠杆菌悬液，使大肠杆菌悬液菌密度为2×108个/mL。最后，按上述稀释比例对大肠杆菌悬液浓度进行调节，在实验前4h于4℃条件下保存，以便用于后期的污泥重金属微生物毒性评价。
2、计算污泥重金属毒性液对大肠杆菌生长的抑制率
处于饥饿状态的大肠杆菌，由于新陈代谢需消耗混合液中的营养物质。此时，葡萄糖作为大肠杆菌生长所需的第一碳源而被消耗，混合液中葡萄糖浓度逐渐降低。对照实验中的大肠杆菌，由于新陈代谢较为稳定，葡萄糖消耗量较多，而受到污泥重金属毒性液干扰，大肠杆菌新陈代谢受到抑制，葡萄糖消耗量少。
大肠杆菌生长抑制率的计算方法：
(1)对照实验中，初始葡萄糖浓度为C0，培养时间结束后葡萄糖浓度为C1。
(2)污泥重金属毒性液实验中，初始葡萄糖浓度为C0，培养时间结束后葡萄糖浓度为C2。
(3)大肠杆菌生长抑制率(％)＝(C0-C2)/(C0-C1)×100％。
下面结合实施例对本发明方法的具体过程及效果进行说明，但不局限于以下实施例。
实施例1
选择大肠杆菌(Escherichia.coli)购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 1.1564。
大肠杆菌培养基组分含量如下：牛肉浸出膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L。
1、供试大肠杆菌的获得
(1)从菌种保藏斜面上取5接种环大肠杆菌接种至装有100mL经121℃、20min灭菌的250mL三角瓶中，培养温度30℃，摇床转速150r/min，培养24h得到大肠杆菌种子液。
按照10％接种量(v/v)，取10mL大肠杆菌种子液接种于250mL三角瓶中进行传代培养，培养基体积100mL，培养条件同上。重复上述传代培养操作3次，最后一次传代培养将酵母菌培养至稳定期后期。取4支50mL灭菌后的离心管，将100mL处于稳定期后期的大肠杆菌在6000r/min转速下离心5min，收集大肠杆菌。
(2)离心收集的大肠杆菌加入0.85％生理盐水进行清洗，具体过程为：上述收菌的离心管中分别加入20mL生理盐水，在6000r/min转速力下离心5min。重复上述清洗操作2次并收集菌体，收集到的大肠杆菌用10mL生理盐水重新悬浮制得大肠杆菌液。
制得的大肠杆菌悬液中加入生理盐水进行稀释，使大肠杆菌菌悬液的菌密度为2×108个/mL，用于后期的毒性评价。
2、采用上述大肠杆菌悬液用于污泥重金属微生物毒性评价
(1)含重金属污水样品的制备
取城市生活污水处理厂污水离心并过滤，用过滤后的污水(几种重金属浓度极低，可忽略不计)配制不同浓度梯度(至少五个浓度梯度)的重金属污水，每个浓度三次重复。
(2)大肠杆菌与含重金属污水样品接触
取多支5mL离心管并进行编号，每支离心管中均加入0.8mL大肠杆菌悬液、0.1mL葡萄糖溶液和1mL的LB培养基，随后1-3号管中加入0.1mL的生理盐水作为对照，其他离心管中分别加入不同浓度的重金属污水。将上述离心管放入摇床中30min，温度为30℃，转速为150r/min。
(3)用血糖仪快速测定每只离心管中培养液的葡萄糖浓度，通过公式计算污泥重金属毒性液对大肠杆菌生长抑制率。
(4)实验结果及分析
本实验通过铜、锌、镉、铅4种重金属污水对大肠杆菌进行微生物毒性实验，所得结果如图2－图5。
由实验结果可以看出，四种重金属对大肠杆菌均存在毒性作用，使大肠杆菌生长代谢受到抑制，且重金属毒性的大小和其离子浓度存在着正相关关系，重金属离子浓度越大，对大肠杆菌生长抑制作用越强。
由实验结果可以看出铜、锌、镉、铅四种重金属离子对大肠杆菌生长的半抑制浓度分别为10.7、13.3、23.7和160.3mg/L，毒性大小顺序为：Cu2+>Zn2+>Cd2+>Pb2+。
实施例2
与实施例1不同之处在于使用不同来源污泥的重金属毒性液作为测试样品。
1、供试大肠杆菌的获得：具体方法同实施例1。
2、采用上述大肠杆菌悬液用于污泥重金属微生物毒性评价。
(1)含重金属污水样品的制备
本发明中待评价重金属微生物毒性的3种污泥分别来自电镀厂污泥、钢铁厂污泥和生活污泥。室温条件下，分别取2g干污泥样品加入20mL 0.1mol/L的盐酸，放于振荡器中振荡2h，振荡器转速为180r/min。振荡结束后将其静置过滤可得污泥重金属提取液。为排除pH对本毒性实验的干扰，应调节测试样品pH值至7.0，每种污泥三次重复。
(2)大肠杆菌与污泥中含重金属污水样品接触
取12支5mL离心管，每支离心管中均加入0.8mL大肠杆菌悬液、0.1mL葡萄糖溶液和1mL的LB培养基，随后1-3号管中加入0.1mL的生理盐水作为对照、4-6号管中加入0.1mL电镀厂污泥重金属毒性液、7-9号管中加入0.1mL钢铁厂污泥重金属毒性液、10-12号管中加入0.1mL生活小区污泥重金属毒性液。培养条件同实施例1。
(3)用血糖仪快速测定每支离心管中培养液的葡萄糖浓度，通过公式计算污泥重金属毒性液对大肠杆菌生长抑制率。
(4)实验结果及分析
本实验通过对电镀厂、钢铁厂和生活小区污泥重金属毒性液对大肠杆菌进行微生物毒性实验，所得结果如图6。
由实验结果可以看出，三种污泥重金属毒性液对大肠杆菌均存在毒性作用，电镀厂、钢铁厂和生活小区污泥对大肠杆菌生长的抑制率分别为41.4％、35.6％和17.7％，毒性大小顺序为：电镀厂污泥>钢铁厂污泥>生活小区污泥。

Claims (9)

1.一种评价污泥重金属微生物毒性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取污泥，经提取液提取后获得污泥重金属毒性液；
(2)制备微生物悬液；
(3)将LB培养基、葡萄糖溶液和污泥重金属毒性液按照一定比例混合制成培养液，然后加入微生物悬液，培养微生物，分别测定培养前和培养后培养液中的葡萄糖浓度；
(4)根据培养前后葡萄糖浓度折算出微生物生长抑制率，由此评价污泥中重金属微生物毒性大小。
2.根据权利要求1所述的一种利用微生物评价污泥重金属毒性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取液为HCl。
3.根据权利要求2所述的一种评价污泥重金属微生物毒性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中污泥重金属毒性液的提取条件为：室温下，取适量干污泥于离心管中，加入0.1mol/L HCl，经振荡器振荡再静置后过滤得污泥重金属毒性液。
4.根据权利要求1所述的一种评价污泥重金属微生物毒性的方法，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌。
5.根据权利要求1所述的一种评价污泥重金属微生物毒性的方法，其特征在于，所述步骤(4)中步骤(4)中，微生物悬液：LB培养基：葡萄糖溶液：重金属毒性液的体积比为8:10:1:1。
6.根据权利要求1所述的一种评价污泥重金属微生物毒性的方法，其特征在于，所述步骤(4)的培养条件为：混合液中葡萄糖浓度为7mmol/L，温度为30℃，摇床转速为150r/min，培养时间为30min。培养前后，分别测定葡萄糖浓度。
7.根据权利要求4所述的一种评价污泥重金属微生物毒性的方法，其特征在于，大肠杆菌悬液制备方法如下：
1)对大肠杆菌进行传代培养，传代培养时每次培养到稳定期前期收集菌体，进行下一次传代培养，通过3～7次传代培养获得活性稳定的大肠杆菌，将其培养至稳定期后期收集并离心；
2)将离心过后的大肠杆菌用适量生理盐水清洗，然后用生理盐水重悬制备成大肠杆菌悬液。
8.根据权利要求8所述的一种评价污泥重金属微生物毒性的方法，其特征在于，所述传代培养的条件为：每次按照10％接种量(v/v)将大肠杆菌培养基接种于新鲜培养基进行培养，培养温度为30℃，摇床转速为150r/min。
9.根据权利要求9所述的一种评价污泥重金属微生物毒性的方法，其特征在于，所述大肠杆菌悬液中成菌密度为2×108个/mL。
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