KR20000048673A

KR20000048673A - 세균의 검출방법 및 검출장치

Info

Publication number: KR20000048673A
Application number: KR1019990702621A
Authority: KR
Inventors: 노가미다카코
Original assignee: 하시모토 쯔토무; 오르가노 가부시키가이샤
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-19
Publication date: 2000-07-25
Also published as: EP0940472A4; WO1998013515A1; US20010006783A1; JP3270722B2; CN1231701A; CN1110571C; EP0940472A1; JPH10323178A; TW565616B

Abstract

본 발명은, 발효기질의 대사에 의한 색조의 변화 등에 의지하는 일 없이, 세균 그 자체에 간단하면서도 특이적으로 표지를 부착함으로써, 세균을 특정한 검출·판정을 가능하게 하고, 간단한 조작, 측정시간 단축, 효율 향상, 검출정밀도 향상이 뛰어난 세균의 검출법을 제공한다.

본 발명에 있어서는, 핵산을 형광물질로 표지한 박테리오파지를 숙주에게 세균접촉시키고, 파지 내에 존재하고 있는 상태의 형광표지핵산의 형광강도와, 이 형광표지핵산이 세균에 주입된 상태의 형광강도가 유의의 차를 나타내는 것을 이용하여, 특정세균의 존재 또는 부재를 판정한다.

Description

세균의 검출방법 및 검출장치{METHOD AND APPARATUS FOR DETECTING BACTERIA}

세균을 비롯한 미생물은 모든 환경에 생존하고, 인간의 생활과 밀접한 관계를 유지하고 있다. 그러나 미생물 중에는 인간 또는 가축에게 질병을 일으키는 것도 있어, 병원성 미생물로서 인간 또는 가축에 대한 감염에 주의가 요구되고 있다. 병원성 미생물 중에서도 특히 세균은, 증식이 빠르고, 저온, 고온, 건조 등의 환경조건에 영향을 잘 받지 않아, 그 때문에 인간의 주위에 지속적으로 존재하고, 한번 좋은 조건을 얻으면 폭발적으로 수를 늘려 감염증의 원인이 된다. 식품이나 음료수(수돗물을 포함)와 같이 인간의 체내에 직접 섭취되는 것에 대해서는 물론이고, 식품의 제조공정에서 이용되는 물, 식기 등의 세정에 이용되는 물, 하천, 호소(湖沼), 바다, 풀, 목욕탕, 그 외의 수경친수(修景親水) 이용을 위한 쾌적성 용수 등, 사람이 신체를 접촉시키는 물, 하수방류수 등 사람과 접촉할 기회가 있는 물에 대해서는, 세균에 대한 적정한 관리가 실시될 것이 요망된다.

이러한 것을 전제로 하여, 식품, 음료가 되는 수돗물에 대해서는 「대장균군(群)은 검출되지 않을 것」이라는 기준이 정해지고, 풀의 물에서는 「10㎖의 물을 5개 배양하여 대장균군 양성의 관(管)이 2개 이하일 것」이라는 기준이 정해지며, 또 수경친수 이용의 물에 대해서는 「1㎖ 중 10개 이하」, 일반배수에 대해서는 「1㎖ 중 3000개 이하」가 바람직하다는 목표치가 설정되어 있다.

또한, 세균에 의한 감염증은 사람 또는 동물을 기원으로 하는 세균에 의하여 야기되는 질병의 빈도가 가장 높고, 피해도 확대되기 쉽다. 따라서, 식품, 음료수 또는 친수시설의 쾌적성 용수를 관리하는 데에 있어서의 기준으로서, 장내(腸內) 세균 특히 대장균 및 대장균군의 유무를 조사하는 항목이 채용되고 있는 것은 매우 타당하다고 생각된다.

그런데, 이와 같은 식품, 음료수(수돗물), 풀의 물, 수경친수용수에 대한 세균의 검출은, 일반적으로는 배양법에 의하여 종래부터 실시되고 있다. 이와 같은 종래부터 행하여지고 있는 배양법에서는, 예를 들어 대장균이나 대장균군에서는 이것을 다른 일반세균으로부터 구별하기 위한 고안이 필요하며, 따라서 시험에 있어서 사용하는 검출방법으로서는, 대장균이나 대장균군이 선택적으로 증식하는 배지(培地) 또는 증식하면 색조가 변화하거나 콜로니의 색깔에 특수한 색깔이 생기는 고안이 이루어진 배지를 사용하는 경우가 많다.

또한 이상의 방법과는 별도로, 대장균 및 대장균군의 시험을 간략화한 특이효소기질배지법, 즉 대장균이나 대장균군에 특이적으로 함유되는 효소에 대한 기질의 존재하에서 시료를 배양하여, 양성이면 특징적인 색깔이나 형광이 생기도록 고안한 방법이 제안되어 있다.

또 이들 방법 외에도 PCR법(폴리머라아제 체인 리액션법), ATP를 재는 방법, 방사성 동위원소 등을 사용하는 방법(일본국 특개 평8-154700호 공보)도 알려져 있다.

그러나, 상기한 종래 법에는 이하와 같은 문제가 있다. 예를 들어, 상기 배양법에서는, 배양에 의하여 균이 증식하기까지의 시간에 부가하여, 증식한 세균이 대장균 또는 대장균군인지 여부의 판정법이 번잡하다. 즉 배양법은, 대장균이나 대장균군에 의한 오염의 유무를 추정하는 것만으로도 하루를 요하고, 혼입되어 있는 것이 대장균, 대장균군인지 여부를 확정하는 데 이틀이 필요하며, 다시 완전한 시험을 하고자 하면 균체의 특수염색 등의 시험을 되풀이할 필요가 있어 판정까지 시간이 걸린다.

이와 같이, 배양법에 의한 세균 검출은 시간을 요하고, 결과가 얻어지기보다 이전에 피해가 생겨 이것이 확대되어 버리는 케이스가 우려된다. 이상의 것과는 별개로, 배양법은 한천배지상 또는 멤브레인 필터 상에 형성한 특수한 성상을 나타내는 콜로니를 눈으로 보고 세어 정량하거나, 양성을 나타내는 시료의 최대 희석 배율로부터 원래의 시료에 포함되어 있던 균수를 산정하는 방법이 보통이기 때문에, 특수한 형상을 나타내는 콜로니의 판정은 애매한 부분도 많고, 또 최대 희석 배율로부터 구하는 방법으로는 대략의 추정치가 구해지는 것에 지나지 않아, 정량성이 부족하다는 문제도 있다.

상기의 특이효소기질배지법은, 대장균 및 대장균군의 정성(定性)시험은 24시간으로 실시할 수 있는 이점이 있다. 그러나 대장균이나 대장균군에 대해서도 전부를 검출할 수는 없고, 정량시험을 행한다고 하면 최대 희석 배율로 양성을 나타내는 값으로부터 구하는 형식으로 행할 수밖에 없어, 측정법에 유래하는 한계가 있다.

PCR법은, 감도는 예민하나, 사멸하고 있어 실제로는 무해한 세균도 검출하여 이들의 구별이 불가능하다는 문제가 있는 것 외에, 정량성도 기대할 수 없다.

또한 ATP법은, 조작이 간단하고 또한 생균만을 특이적으로 검출할 수 있는 점에서 우수하나, 검출감도가 낮고(1000개 이상의 세균이 아니면 검출할 수 없다),외인적(外因的)인 요인에 의하여 발광강도가 좌우되기 쉽기 때문에 적용할 수 있는 조건이 한정되며, 또 세균을 특정하여 검출할 수 없다는 문제가 있다.

상기한 일본국 특개 평8-154700호 공보에 기재된 방법은, 파지에 방사성 동위원소(아이소토프) 또는 효소를 표지하여 사용하는 직접표지법과, 파지에 편성한 리포터유전자가 생산하는 단백질을 측정하는 방법이 있다. 이들 방법은, 지구상의 통상의 온화한 조건하에 생식하고 있는 대부분의 세균에 대하여, 이를 숙주(宿主)로 하는 특이적인 박테리오파지가 존재하고, 또한 박테리오파지의 숙주인식은 엄밀하여 숙주세균 이외의 세균에 실질적으로 흡착 결합하는 일이 없기 때문에, 어떤 특정한 세균을 검출하고자 하는 경우에 파지를 이용하여 특정한 세균을 선택·검출할 수 있는 점에서 우수하다.

그러나 이 일본국 특개 평8-154700호 제안의 방법에는, 실제의 실시장면에서 생각하면, 처리의 신속성, 처리조작의 간편성, 검출정밀도의 높이 등의 점에서 이하와 같이 설명되는 해결하기가 매우 곤란한 문제가 있다.

즉, 전자의 직접표지법 중 방사성 동위원소를 사용하는 방법에서는, 세균에 흡착한 파지가 갖는 방사성 동위원소 표지 유래의 신호와, 비흡착 파지가 갖는 상기 표지 유래의 신호를 구별할 수 없기 때문에, 이들 흡착, 비흡착 파지를 물리적으로 분리하는 조작이 필요하게 된다. 또, 분리조작을 행하더라도 세균(또는 여과막 등의 분리수단)에 비특이적으로 흡착한 파지를 카운트하게 되는 문제가 있으며, 이와는 별도로, 세균에 흡착하여 그 핵산을 세균 내에 주입한 파지핵산이 증식하여 세균을 용균시켜 버리는 결과로서 정확한 측정이 불가능한 경우가 있다. 한편, 직접표지법 중 효소를 사용하는 방식은 방사성 동위원소를 이용하는 것과 동일한 문제가 있는 것에 부가하여, 미소량의 효소의 활성을 이용하는 방법이므로 기질(基質)에 나타나는 현상으로부터 미량 효소의 양을 정밀도 좋게 검출하는 방식을 실제로 이용하기는 매우 곤란하다는 문제도 있다.

또한, 상기 후자의 리포터유전자를 사용하는 방식은, 세균마다 특이적인 파지별로 유전자 재편성체의 리포터유전자를 조정하는 것이 필요하게 되고, 이 리포터유전자를 포함하는 파지핵산의 복제, 전사, 번역을 행하게 하며, 생산단백질을 검출하는 조작이 필요하게 되기 때문에 범용성은 거의 기대할 수 없다.

이상과 같이, 종래의 방법은 모두 문제가 있으며, 특히 신속성, 조작의 간편성, 검출정밀도 등의 점에서 아직 해결해야 할 과제가 있다.

본 발명자는, 이상과 같은 종래 법의 문제점을 해소하고, 예를 들어 발효기질의 대사에 의한 색조의 변화 등에 의지하는 일 없이, 세균 그 자체에 간단하면서도 특이적인 표지부착을 가능하게 함으로써 세균을 특정한 검출·판정을 가능하게 하고, 이에 따라 간단한 조작, 측정시간 단축, 효율 향상, 검출정밀도 향상을 비약적으로 높일 수 있는 본 발명을 이루기에 이른 것이다.

본 발명은, 예를 들어 대장균 등의 세균을 검출하는 방법 및 그 검출에 사용하는 장치 등에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 실시형태 1의 장치 구성 개요를 나타낸 순서도,

도 2는 본 발명의 실시형태 2의 장치 구성 개요를 나타낸 순서도,

도 3은 본 발명의 실시형태 3의 장치 구성 개요를 나타낸 순서도,

도 4는 본 발명의 실시형태 6의 장치 구성 개요를 나타낸 도,

도 5는 본 발명의 실시형태 7의 방법을 실시할 때의 조작 개요를 나타낸 도,

도 6은 본 발명의 실시형태 8의 방법을 실시할 때의 상태를 나타낸 도,

도 7은 본 발명의 실시형태 7의 방법을 실시한 결과의 상태를 나타낸 도,

도 8은 본 발명의 실시형태 9의 방법을 실시할 때의 구성 개요를 나타낸 도,

도 9의 (a)는 형광물질로 표지된 핵산을 가지는 파지와, 이 파지의 표지핵산이 주입되어 염색된 세균의 형광을 검출한 상태를 나타낸 현미경 사진, (b)는 상기 현미경 사진을 화상처리한 후의 도.

※도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명

1 : 라인 2, 6 : 반응기

3 : 검출장치 4 : 배양농축액

5 : 파지용액 7 : 필터

41, 51 : 펌프 52 : 유량계

60 : 시료액 61 : 형광여기광원

62 : 촬상장치 63 : 화상처리장치

201 : 피검수 202 : 슬라이드 글라스

203 : 슬라이드 글라스 홀더 204 : 형광현미경의 렌즈

205 : 형광현미경의 대(臺) 206 : 캐필러리

207 : 도립(倒立)현미경의 렌즈

본원은 상기의 목적을 달성하기 위하여 상기한 특허청구 범위의 각 청구항에 기재한 발명을 제공한다.

본원 청구범위 제 1 항의 세균 검출방법의 발명은, 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 숙주세균에 접촉시키고 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 광학적 검출수단으로 검출하는 것을 특징으로 한다.

또 본원 청구범위 제 15 항의 세균 검출장치의 발명은, 검출대상세균에 특이적으로 흡착하고 또한 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 포함하는 용액을 시료액[피검수(被檢水)]에 공급(첨가)하는 수단과, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 검출하는 광학적 검출수단을 구비한 것을 특징으로 한다.

또한, 이하의 설명에 있어서 「형광물질 등」이라고 하는 경우는 색소, 형광물질 쌍방을 포함하는 경우를 총칭하고, 「형광표지핵산 등」이라고 하는 경우는 색소표지핵산, 형광표지핵산 쌍방을 포함하는 경우를 총칭하는 것으로 한다.

상기에 있어서, 박테리오파지는 DNA(1중쇄, 2중쇄)로 이루어지는 유전자를 갖는 DNA 파지가 일반적이나, RNA로 이루어지는 유전자를 가지는 RNA 파지를 제외하는 것은 아니고, 형광표지핵산 등은 DNA, RNA 중의 어느 한쪽이라도 좋다. 이와 같은 형광물질 등으로 표지된 핵산을 가지는 DNA 파지, RNA 파지는, 파지핵산(이하 「파지 DNA」라고 함)에 친화성을 가지는 형광물질 등(색소 또는 형광물질)을 첨가한 배지에서 박테리오파지가 감염된 세균을 증식시킴으로써 얻을 수 있다. 형광물질 등으로서는, 파지 DNA에 결합할 수 있고, 파지로부터 세균에 주입되어 상기 세균을 염색할 수 있는 물질이라면 특별히 한정되는 일 없이 사용할 수 있으며, 일례를 들어 색소로서는, 에티듐 브로미드, 프로피듐 이오데이트 등을 예시할 수 있다. 형광물질로서는 4, 6-디아미디노-2-페닐인돌 하이드로클로라이드(DAPI)를 예시할 수 있다. 형광물질 중, 긴 파장쪽에 흡수대를 갖는 것은 색소로서도 이용할 수 있고, 이와 같은 색소로 표지한 파지를 사용하면 형광현미경 등의 형광검출기를 사용하지 않더라도 현미경, 분광광도계 등으로의 검출이 가능하다.

파지핵산에 형광물질 등을 표지시키는 방법은, 형광물질, 색소 중의 어느 한쪽을 사용하는 경우이더라도, 핵산(DNA, RNA)에 친화성을 갖는 형광물질 등을 그 친화성을 이용하여 핵산의 입체구조의 간극에 물리적으로 집어넣도록 해도 되고, 형광물질 등을 표지한 누클레오티드를 파지핵산 합성시에 끌어들여 화학적인 결합에 의하여 표지하도록 해도 된다.

검출에 사용하는 파지용액의 파지농도는, 시료액에 포함되는 세균에 대하여 소정 시간 이내에 적어도 1개의 박테리오파지가 접촉할 수 있는 농도를 가지는 것이면 되고, 그 정도는 검출하고자 하는 시료액에 포함되는 세균수의 레벨(상기한 음료수, 쾌적성 물 등)이나 검출시간 등에 따라 다르기 때문에 일률적으로는 정해지지 않으나 실험적으로 용이하게 정할 수 있다. 일례적으로 말하면, 음료수 중에 포함되는 대장균의 검출을 위해서는, 시료액(피검수) 1㎖ 당 10⁵개 내지 10¹⁴개 정도, 바람직하게는 10⁷개 내지 10¹⁴개, 최적으로는 10⁸개 내지 10¹²개 정도가 되도록 하면 되는 경우가 많다. 파지용액의 파지농도를 높게 하면 복수의 파지가 세균에 접촉할 가능성이 증가하므로, 검출하는 하나의 세균의 색소에 의한 염색농도가 증가하고, 또 하나의 세균이 나타내는 형광강도를 높게 할 수 있어 검출을 보다 고정밀도로 할 수 있으므로 바람직하다. 파지가 10⁵개/㎖ 미만에서는 파지와 세균이 접촉하는 확률이 낮아 계측에 장시간을 요하는 결과가 되나, 세균이 존재하더라도 검출할 수 없는 결과를 초래할 우려도 있다. 반대로 파지가 10¹⁴개/㎖를 넘도록 너무 많게 하면, 시료액의 점성이 증가하고, 또 백그라운드의 형광강도가 커져 계측감도가 저하하는 문제를 초래하므로 상기 범위로 하는 것이 좋다.

일반적으로 박테리오파지의 감염[용균(溶菌)감염 또는 용원화(溶原化)하는 것] 과정은, 숙주세균에 대한 흡착 결합, 파지 DNA의 숙주세포에 대한 주입, 주입된 파지 DNA를 주형(鑄型)으로 한 파지입자의 복제라는 3단계로 나누어진다.

본 발명에 있어서 형광표지핵산 등을 가지는 파지를 사용하도록 한 것은 다음의 이유에 의한다. 즉, 박테리오파지가 숙주세균에 대하여 특이적으로 흡착하는 것은 상기한 대로이나, 본 발명에서 사용하는 형광표지핵산 등은 파지 중에 존재하고 있는 경우와 세균 내에 주입된 후에서는, 파지 중에서는 빽빽한 상태로 가득 차 있는 데 대하여, 주입된 세균세포 내에서는 전개, 확산하여 그 형태가 변하는 것에 원인이 있기 때문이라고 추정되나, 예를 들어 형광물질에서는 후기한 참고예 1, 2로 확인되는 바와 같이, 검출되는 형광강도에 광학적으로 식별할 수 있는 유의(有意)한 차(差)가 생기는 것을 알아내고, 본 발명자는 이 점에 착안하여 이 차를 이용함으로써 세균에 비흡착 파지를 물리적으로 분리하는 조작을 필요로 하지 않고 파지 DNA 주입 세균만을 광학적으로 식별하여 검출하는 것을 특징으로 한 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 있어서 주목되는 다른 특징은, 대부분의 경우 세균에 흡착한 파지가 숙주세균세포 내에 파지 DNA를 주입하는 과정이 숙주세포의 에너지상태에 의존하고 있는 것에 착안한 점에 있다. 즉, 파지 DNA(핵산)의 주입은 생물활성을 잃은 숙주에 대해서는 일어나지 않고 생세포(생균)만에 있어서 일어난다는 점이다. 즉, 생균에서는 파지 DNA의 주입이 일어나므로 광학적으로 검출할 수 있게 되는 데 대하여, 흡착하더라도 파지 DNA가 주입되지 않는 사균이나 단편에서는, 검출되는 광학적 정보를 명료하게 식별할 수 있기 때문이다. 파지의 활성과 주입의 유무를 광학적으로 식별할 수 있는 현상을 이용하여 생균과 사균을 구별하는 본 발명의 작용은, 방사성 동위원소나 효소 등을 사용한 종래 법에서는 기대할 수 없는 것이며, 처리조작의 간편화나 검출정밀도 향상의 점에서 매우 유리하다.

또 비특이적으로 흡착한 파지가 있더라도 세균에 대한 파지 DNA의 주입은 생기지 않으므로, 파지 DNA가 주입된 세균만이 검출되는 본 발명방법은 고정밀도의 검출이 가능한 점에서 우수하다.

또한, 통상의 조건하에서는, 형광물질 등으로 표지한 파지 DNA는 형광물질 등이 표지되어 있음으로써 유전자의 전사가 저해되고 유전자로서의 활성을 잃는다. 이 점도 또 본 발명의 주목할 만한 작용의 하나이다. 즉, 본 발명에서 사용하는 형광물질 등으로 표지된 파지 DNA는, 통상은 세균세포 내에 주입되더라도 새로운 파지입자의 복제나 숙주세포를 파괴하여 신생파지입자를 세균세포 밖으로 방출시키는 효소군을 생성하는 일이 없으므로, 감염과정의 최종단계에 인정되는 숙주세포의 용균이 일어나지 않는다. 이 때문에, 형광물질 등으로 표지된 파지 DNA는 숙주세포 내에 안정적으로 유지되고, 따라서 처리시간의 길고 짧음이 검출정밀도에 영향을 미치는 일은 매우 작다는 이점이 얻어진다. 또한, 세균의 종류나 환경조건, 사용하는 형광물질 등의 종류 등에 따라 파지핵산의 전사가 생길 수 있는 가능성이 있는 경우에는, 적극적으로 그 전사복제를 방지하는 처리를 행할 수도 있다. 예를 들어, 시료액 중에 DNA 합성 조해제(阻害劑)나 단백질 합성 조해제를 첨가하거나 파지유전자의 일부를 넌센스 코돈으로 개량이나 변경하여 전사복제능력을 잃도록 하면 된다.

이러한 이유에 의하여, 본 발명에 의하면 형광색소로 핵산을 표지한 박테리오파지를 이용하여, 특정한 세균을 더욱이 생균만을, 이것에 특이적으로 흡착하는 박테리오파지를 이용하여 염색 또는 형광염색하여 검출하는 것이 가능하게 된다.

형광표지핵산 등을 가지는 박테리오파지의 흡착-핵산주입에 의하여 색소, 형광으로 염색된 세균은 광학적 수단에 의하여 검출할 수 있다. 광학적 수단은, 색소, 형광을 검출할 수 있는 것이라면 특별히 형식 등에는 제한되는 일은 없고, 예를 들어 색소를 표지한 경우에는 통상의 현미경이나 분광광도계 등을 사용할 수 있고, 형광물질을 표지한 경우에는 형광현미경, 형광광도계, 형광검출기 등을 사용할 수 있다. 또 검출화상을 화상해석에 의하여 염색점이나 형광점 등을 검출하는 방법, 형광광도계를 사용하여 형광강도의 차이를 검출하는 방법, 플로우셀(flow cell)을 사용하여 유동액 중의 염색입자나 형광입자의 수를 검출하는 방법 등을 사용할 수 있다.

표지로서 형광물질을 사용하였을 경우에는, 가장 간단하게는 예민한 감도를 구비한 형광검출기를 채용하는 예를 들 수 있다. 예를 들어, 형광표지한 파지용액과 영양염류(榮養鹽類)를 시료액에 공급(첨가)하고 일정 시간 후에 약간이라도 형광강도의 증가가 인정되는지 여부에 의하여 특정한 세균의 존부를 간단하게 조사할 수 있다. 또 세균을 포함하는 시료액에 영양염류와 과잉의 파지액을 첨가하고, 일정 시간 후에 원심분리나 막 여과에 의하여 세균과 파지를 분리한 후에 세균의 획분(劃分)에 대하여 형광강도를 측정함으로써도 간단하게 세균의 존재 또는 부재를 조사할 수 있다.

상기의 방법 또는 장치를 사용함으로써, 예를 들어 각종 세균마다 특이적인 색소 또는 형광물질을 표지한 파지를 준비해 두고 세균과 접촉시킴으로써 종(種)이 불명한 세균이더라도 대장균 특이적 파지에 의하여 염색되면 대장균, 살모넬라 특이적 파지에 의하여 염색되면 살모넬라 등과 같이, 간단하게 세균의 동정(同定)이 가능하게 된다. 이에 의하면, 종래와 같이 발효기질의 분해성을 조사하는 방법(최저 이틀을 요함)과 비교하여 단시간(1시간 이내)에 확실하게 동정시험을 행할 수 있는 이점이 있다.

세균의 동정이 특별히 요청되는 경우로서는, 식중독, 병원의 원 내 감염 등의 세균감염증의 원인이 되는 세균의 동정을 행하는 경우나, 식품공장 등에서의 용수 등의 오염세균의 동정을 행하는 경우 등을 들 수 있으며, 구체적으로 말하면, 예를 들어, 세균의 검출이 요청되는 환경수나 환경공기, 식품이나 상하수, 병원(특히 임상장면), 정밀기기 제조공장 등에 있어서 존재가 기피되는 세균을 검출하는 경우를 들 수 있다. 기피되는 주된 세균과 파지의 조합을 예시하면, 대장균과 T 계 파지, λ 파지 등, 살모넬라와 P계 파지 등, 슈도모나스와 P계 파지 등, 클레브시아라(Klebsiella)와 스탠포드대학 60, 92의 각 파지, 클로스트리듐(Clostridium)과 70, 71, 72의 각 파지, 시게라(Shigella)와 ø80, 스탠포드대학 37, D20, 코리네박테리움과 C계 파지, 마이크로코커스와 N계 파지, ML53-40 파지 등을 들 수 있고, 이 경우에는 미량세균을 검출하기 위하여 농축공정이 필요하게 되는 경우가 많다.

또 본 발명은, 유용세균을 검출하는 데에도 유효하게 사용된다. 즉, 미생물(세균)을 이용하여 식품이나 의약품 등을 제조하는 분야에 있어서는, 본 발명의 생균만을 검출할 수 있는 방법을 사용함으로써 활성이 있는 생균수를 확인할 수 있기 때문이다. 이에 따라 예를 들어 맥주제조공정에서의 활성이 있는 효모량의 관리나 요구르트제조공정에서의 활성이 있는 유산균량의 관리에 사용할 수 있고, 또는 아미노산 등을 생산하는 미생물의 활성 확인 등에 이용할 수 있다. 또한 유용세균을 검출하는 경우에는, 세균농도가 농후한 용액을 적당한 배율로 희석하는 공정이 필요하게 되는 경우가 많다.

파지를 세균에 감염시키는 조건은, 호기성 조건하에서, 균의 종류에도 의하나 호열성 세균에서는 0 내지 120℃, 일반 균, 파지에서는 활성을 잃지 않는 50℃ 이하로 된다. 이들 범위 내라면 온도가 높은 쪽이 감염 속도가 빨라진다. 또 시료액을 교반하여 세균과 파지의 접촉효율을 높이는 것도 바람직하다.

세균을 검출하는 시료액은, 수계 시료라면 그대로 검출에 제공할 수 있다. 시료액이 유분을 포함하는 액상시료일 경우에는, 유분이 적으면 비이온성 계면활성제로 유분을 분산시킨 후에 수계 시료와 동일하게 검출에 제공할 수 있다. 유분이 많을 경우에는, 물을 첨가하여 수층에 세균을 추출하고, 얻어진 수층을 시료액으로서 수계 시료와 동일하게 검출에 제공할 수 있다. 시료가 고체일 경우에는 물을 첨가하여 갈아 뭉갠 후, 고형분을 원심분리나 여과 등에 의하여 분리한 후, 얻어진 상청(上淸)액을 시료액으로서 수계 시료와 동일하게 검출에 제공할 수 있다. 시료액에 색소, 형광색소가 포함될 경우에는, 예를 들어 생리식염수에 대하여 투석을 행하여 색소를 제거한 후에 검출을 행하는 것이 바람직하다. 마이크로 필터에서의 농축을 필요로 하는 경우에는, 농축 후 동일 농축조에 생리식염수를 첨가하면서 액을 교환하는 방법으로 대체하는 방법을 사용할 수 있다.

광학적 수단에 의하여 검출한 정보에 의하여, 예를 들어 형광강도가 일정치를 넘은 점을 세균으로서 카운트하는 등의 방법으로 세균의 유무, 세균수를 측정할 수 있다. 이와 같은 장치로서는, 마이크로 컴퓨터(MPU) 등을 사용한 화상처리기술에 의하여 구성할 수 있다.

본원의 청구범위 제 2 항의 검출방법의 발명은, 공기 또는 액체에 포함되는 세균을 여과 또는 흡착 등의 포착수단으로 포착함과 동시에 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 상기의 포착한 세균에 접촉시켜, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 광학적 검출수단을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하고, 청구범위 제 16 항의 세균 검출장치의 발명은, 공기 또는 액체에 포함되는 세균을 막 상에 포착하는 포착수단과, 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 포함하는 파지용액을 상기의 포착한 세균에 접촉시키는 파지용액 접촉수단과, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 검출하는 광학적 검출수단을 구비한 것을 특징으로 한다.

상기 포착수단으로서는 활성탄이나 중공사막(中空絲膜), 마이크로 필터, 울트라 필터, 역침투막 등의 여과막이 예시되고, 흡착수단으로서는 부직포, 섬유형상 여과재, 이온교환수지, 모래여과재 등 세균을 흡착할 수 있는 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 의하면, 예를 들어 수처리장치 중에 설치한 여과용 필터에 피처리수를 통과시켜 세균을 필터 상에 포착하고, 필터에 직접 파지용액을 접촉시키거나 또는 필터를 생리식염수 또는 영양원을 포함하는 물에 침지하여 세균을 파괴하지 않을 정도의 초음파로 세균을 박리하여, 얻어진 상청액을 시료액으로서 파지용액을 공급함으로써 피처리수 중의 세균을 검출, 동정할 수 있다. 또 세균을 막 등의 여과수단 위에 포착한 후에 광학적으로 검출하므로, 확실한 세균검출이 가능하다. 특히 신속성의 요구가 비교적 낮으나, 고정밀도로 간단한 검출이 요청되는 경우에 적절하게 적용할 수 있다.

또한, 막에 부착된 세균을 액 중에 박리시킨 후 파지용액을 첨가하는 방법은, 세균과 파지가 만날 기회가 액상 중에서 고비율로 부여되므로, 막 부착상태의 세균에 파지용액을 접촉시키는 경우에 비하여 바람직하다.

본 발명의 방법은, 상기한 바와 같이 시료액(피검수) 중의 세균의 검출에 이용되는 것 외에, 공기중의 부유세균의 검출에도 이용할 수도 있다. 예를 들어 세균이 부유하고 있는 기체(공기)를 수중에서 확산(버블링)시켜 수중에 세균을 트랩하여 샘플액으로 해도 되고, 흡인공기를 필터로 여과하여 상기와 동일하게 필터 상에 포착하고 필터에 직접 파지용액을 접촉시키거나, 또는 필터를 생리식염수 등에 침지하여 세균을 박리하여 얻어진 상청액에 파지용액을 공급하면 된다. 이 방법에 의하면, 예를 들어 에어컨디셔너나 그 외의 공기청정설비 내에 설치한 필터를 검사함으로써, 병원, 식품공장 등의 세균오염이 문제가 되는 환경공간의 상태를 조사하는 것에 적절하게 적용할 수 있다.

본원의 청구범위 제 3 항의 검출방법의 발명은, 검출하고자 하는 세균을 희박하게 포함하는 시료용액중에서 상기 세균을 농축함과 동시에, 상기 세균을 숙주로 하고 또한 핵산을 형광물질 등으로 표지한 박테리오파지를 상기 세균을 농축한 액중에 공급함으로써 숙주세균에 접촉시키고, 형광표지핵산 등이 주입된 세균을 광학적 수단을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하며, 청구범위 제 17 항의 검출장치의 발명은, 시료액중의 세균을 농축하는 수단과, 핵산을 형광물질 등으로 표지한 박테리오파지를 포함하는 파지용액을 상기의 농축한 시료액에 공급하는 파지용액 공급수단과, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 검출하는 광학적 검출수단을 구비한 것을 특징으로 한다.

상기에 있어서는, 농축은 예를 들어 막을 사용하여 행할 수 있고, 피검체인 세균의 통과를 저지하는 막이라면 막의 종류, 재질은 특별히 한정되는 일 없이 사용할 수 있다. 또한 피검체를 포함하는 샘플액의 여과를 행할 경우에는 세균은 통과시키나 그보다 큰 SS의 통과는 저지하는 막을 사용하여 전(前)여과를 하는 것이 바람직하다. 이와 같은 세균의 농축법을 사용한 장치의 구체예로서는, 예를 들어 흐르는 샘플수를 일정시간마다 일정량씩 자동적으로 채수(採水)하여 막이 있는 챔버에 넣어 자동적으로 농축하고, 농축한 샘플수를 자동적으로 인출하여 자동계측하도록 하는 경우를 예시할 수 있다.

본 발명에 의하면, 시료용액중에 희박하게 존재하는 세균을 농축하여 검출을 유효하게 행할 수 있다.

상기에 있어서의 세균의 농축은, 액 전체에 대하여 세균을 농축하는 경우 또는 액 중에서 세균을 일부에 편재시켜 부분적으로 농축시키는 경우 중의 어느 쪽이더라도 좋고, 본원의 청구범위 제 4 항의 발명은, 막 분리 또는 원심분리에 의하여 세균을 농축한 액중에 핵산을 형광물질 등으로 표지한 박테리오파지를 공급하는 것을 특징으로 한다.

세균을 농축하는 다른 방법으로서는, 청구범위 제 5 항의 발명과 같이, 시료용액중의 좁은 영역 내에 검출하고자 하는 특정 세균의 유인물질을 공급할 수 있으며, 청구범위 제 6 항의 발명과 같이, 유인물질을 캐필러리(모세관)를 사용하여 공급할 수도 있다. 상기 유인물질로서는, 예를 들어 아미노산이라면 세린, 아스파라긴산 등, 당이라면 글루코오스, 갈락토오스, 말토오스, 리보오스 등, 유기산이라면 구연산, 사과산 등을 들 수 있다. 또 상기 유기물질 이외에도 호흡연쇄의 전자수용체가 되는 산소, 푸마르산, 질산 등을 들 수 있다.

유인물질을 이용하여 세균을 농축하는 구체적 방법으로서는, 이하의 방법을 예시할 수 있다. ① : 시험용액에 글루코오스, 세린 등의 유인물질과 형광표지핵산 등을 가지는 파지가 공존하는 액을 캐필러리를 사용하여 공급하여, 캐필러리 끝단 근방에 세균을 농축시켜 파지와 접촉시킨다. ② : 시험용액에 캐필러리를 사용하여 유인물질을 공급하고, 상기 캐필러리의 끝단 근방에 세균이 농축된 것을 현미경 등으로 확인한 후에 다른 캐필러리를 사용하여 상기 파지를 공급한다. ③ : 시험용액에 상기 파지를 공급한 후, 캐필러리를 사용하여 유인물질을 공급한다.

본원의 청구범위 제 7 항의 발명은, 검출하고자 하는 세균을 농후하게 포함하는 시료액을 희석하고, 상기 세균을 숙주로 하고 또한 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 상기 세균의 희석시료액중에 공급함으로써 숙주세균에 접촉시켜, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 광학적 검출수단을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 한다. 시료액의 희석에는 적절한 희석액 주입장치를 사용할 수 있다.

본 발명에 의하면, 세균을 농후하게 포함하는 용액중의 활성이 있는 세균수를 검출, 측정할 수 있으므로, 예를 들어 유용세균을 사용한 식품제조공정 등에 있어서 세균의 활성관리 등에 이용할 수 있다.

본원의 청구범위 제 8 항의 발명은, 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 시료액중에서 숙주세균에 접촉시켜, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 유동세포계측법에 의하여 검출하는 것을 특징으로 하며, 청구범위 제 21 항의 검출장치의 발명은, 시료액을 플로우셀 중에 연속적으로 통과시키는 액체공급수단과, 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 포함하는 파지용액을 상기 플로우셀의 전단에서 시료액에 첨가하는 파지용액 첨가수단과, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 플로우셀로 검출하는 광학적 검출수단을 구비한 것을 특징으로 한다.

이들 발명에 의하면, 플로우셀을 통과하는 유동하는 용액중의 형광입자수, 즉 세균수를 검출할 수 있고, 온라인 실시간 검출을 연속적으로 행할 수 있다.

본원의 청구범위 제 9 항의 검출방법의 발명은, 상기한 어느 하나의 방법 발명에 있어서, 박테리오파지의 숙주세균에 대한 감염 초기의 흡착-핵산주입에 필요한 영양원을 상기 숙주세균에 공급하는 것을 특징으로 하며, 청구범위 제 23 항의 검출장치의 발명은, 박테리오파지의 숙주세균에 대한 감염 초기의 흡착-핵산주입에 필요한 영양원을 시료액에 공급하는 영양원 공급수단을 가지도록 설치한 것을 특징으로 한다.

상기 조작은, 시료액중의 영양염류 등(주로 탄소원)이 이미 충분히 존재하고 있는 경우에는 필요 없다. 그러나 영양염류가 부족한 경우에는 세균의 대사가 없는 결과 감염불량으로 되어 파지 DNA의 세균에 대한 주입이 행하여지지 않는 일이 있으므로, 상기 발명에 의하여 이 문제를 해소할 수 있다.

본원의 청구범위 제 11 항의 발명은, 상기한 각 발명에 있어서, 종류가 다른 파지의 핵산을 각각 색상이 다른 색소 또는 여기파장 또는 형광파장이 다른 형광물질로 표지하고, 이들 종류가 다른 파지가 각각 특이적으로 흡착하는 복수 종류의 세균을 포함하는 시료액에 첨가하여 복수의 세균을 동시에 검출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에 의하면, 예를 들어 대장균, 살모넬라균, 그 외의 세균 등이 혼재하고 있는 액 등에 대하여, 이들 각 균에 특이적으로 흡착할 수 있고 또한 각각 여기파장 또는 형광파장이 다른 형광물질로 핵산을 표지한 파지를 사용함으로써 동시적이면서 일괄하여 이들 균 검출을 위한 조작을 행할 수 있다.

본원의 청구범위 제 12 항의 발명은, 상기한 각 발명에 있어서, 종류가 다른 파지의 핵산을 동일 색소 또는 동일 형광물질로 표지하고, 이들 종류가 다른 파지가 각각 특이적으로 흡착하는 복수 종류의 세균을 포함하는 시료액에 첨가하여 복수의 세균의 총수를 검출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에 의하면, 예를 들어 검사하고자 하는 복수의 세균이 대상으로 되는 액 등 속에 존재하는지 여부를 용이하게 측정할 수 있다.

이상의 각 발명의 방법은, 특히 위생시험 등으로, 병원성 세균을 검출 동정할 때에 유효하다. 예를 들어, 주된 식중독의 원인으로 되어 있는 병원성 장내세균인 대장균, 대장균군 세균, 이질균, 콜레라균, 살모넬라균, 비브리오균, 보툴리누스균, 웰치균, 포도상구균, 세레우스균 등을 동일 또는 다른 색소, 형광물질로 핵산을 표지하고, 이들 세균을 숙주로 하는 파지를 사용하여 용이하게 검출할 수 있다.

상기한 각 발명은 식중독 이외의 감염증의 원인이 되는 세균, 예를 들어 결핵균, 폐렴쌍구균, 녹농균, 레지오넬라균, 그 외의 세균에도 적용할 수 있고, 또 세균의 콜로니를 채용하여 파지용액에 현탁하고 형광염색의 유무로 세균을 동정하는 확인시험에도 유효하게 사용할 수 있다.

본원의 청구범위 제 13 항의 발명은, 상기의 각 방법 발명에 있어서, 형광표지핵산이 주입된 세균의 형광강도 또는 형광광원의 크기를 계측하고, 그 계측치와 미리 정한 역치를 비교함으로써 역치를 넘은 광원을 세균으로서 검출하는 것을 특징으로 한다. 또 청구범위 제 14 항의 발명은, 광학적 검출수단을 사용하여 계측한 형광강도 또는 형광광원의 크기가, 미리 정한 형광강도 역치 또는 광원의 크기 역치 이하의 광원을 제거하는 화상처리를 한 후, 처리후의 화상으로부터 세균의 유무 또는 세균수를 검출하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 한다. 또한, 청구범위 제 21 항의 발명은, 상기의 각 장치 발명에 있어서, 광학적 검출수단을 촬상수단으로 하고, 이 촬상수단으로 얻은 촬상화상으로부터 미리 정한 형광강도 역치 이하 또는 형광광원의 크기 역치 이하의 광원을 제거하는 화상처리수단을 설치한 것을 특징으로 한다.

이들 발명에 의하면, 형광물질이 세균에 주입되었을 때의 예를 들어 광원의 크기는, 상기 형광물질이 파지중에 존재하고 있을 때 광원의 크기에 비하여 유의의 차를 가지고 구별할 수 있으므로, 면적이나 길이 등의 크기를 나타내는 지표로서 전자보다 작고 또한 후자보다 큰 값으로서 미리 정한 역치를 기준으로 하여 세균의 유무나 수를 계수할 수 있다. 또 촬상한 화상에 대하여, 역치 이하의 크기의 광원을 제거하는 화상처리를 행하도록 하면, 형광을 발하는 세균만의 화상을 얻을 수 있어 고정밀도의 검출이 가능하게 되고, 또 검출의 자동화를 도모하기 위해서도 유효하다. 또한, 역치 이하의 크기의 광원을 「제거하는」 화상처리란, 예를 들어 역치 이하의 광원을 배경과 동일하게 간주하도록 하는 것을 말한다. 이 역치와의 비교는 광원의 크기에 한정되지 않고 광원의 형광강도를 사용하여 동일하게 행할 수 있다.

본원의 청구범위 제 24 항, 제 25 항의 휴대형 세균검출용 키트의 발명은, 검출대상인 균이 자화(資化)할 수 있는 탄소원을 포함하는 세균검출용 보조제, 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지 시약 및 측정대상시료를 첨가하기 위하여 준비된 반응용기로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

상기의 세균검출용 보조제, 박테리오파지 시약은, 예를 들어 각각의 용기에 충전하여 준비할 수 있다.

상기의 세균검출용 보조제는, 적어도 균이 자화할 수 있는 탄소원을 포함하며, 이와 같은 탄소원으로서는, 예를 들어 글루코오스 등의 단당류 내지 2, 3당 당류 등의 탄수화물을 사용할 수 있고, 또 파지의 흡착성을 향상시키는 트립토판 등을 첨가할 수도 있다. 본 발명에 의하면, 재료조정의 수고가 불필요하고 상기 검출에 필요한 설비가 없는 실험실 등에 있어서도 효율적으로 작업을 행할 수 있다. 또 상기 키트에 휴대형 광학적 검출수단을 조합해도 좋다. 휴대형 광학적 검출수단으로서는 소형 현미경, 분광광도계, 형광광도계 등을 들 수 있다.

이 경우, 옥외의 검출작업시에 그 장소에서 검출을 행할 수 있어 작업을 효율적으로 행할 수 있다.

또한, 본 발명은 이상의 방법 및 장치의 구성으로 한정되는 것이 아니라, 필요에 따라 다른 구성을 부가할 수도 있다. 예를 들어 세균에 대한 파지의 흡착성을 향상시키기 위하여 트립토판, 마그네슘, 칼슘 등의 2가의 양이온 등을 보조제로서 첨가할 수 있다.

이어서 상기 검출방법 및 이를 실시하기 위한 검출장치에 대하여 설명한다.

실시형태 1

도 1은 본 발명방법을 실시하기 위한 장치의 일례 개요를 순서도로 나타낸 것으로서, 이 도면에 있어서, 부호 1은 세균을 검출하고자 하는 시료액(이하 「피검수」라 함)이 흐르는 라인을 나타내고, 이 하류에는 피검수 중에 파지용액이 첨가된 액을 혼합하는 코일형상의 반응기(2), 이어서 세균을 검출하는 형광검출장치(3)가 차례로 접속되어 있다. 또, 상기 라인(1)의 반응기(2) 상류쪽에는 아미노산, 당류, 무기염류 등을 포함하는 배양농축액(영양원 용액)(4)을 공급하기 위한 펌프(41) 및 핵산을 형광물질 등(색소 또는 형광물질)으로 표지한 파지를 포함하는 용액(이하 「파지용액」이라 함)(5)을 공급하기 위한 펌프(51)가, 각각 접속되어 있다.

본 예의 이 장치를 사용한 세균의 검출조작에 대하여 설명하면, 먼저 세균을 검출하고자 하는 피검수가 흐르고 있는 수계의 라인(1)에 상기 배양농축액(4)과 파지용액(5)을 각각 펌프(41, 51)에 의하여 연속적으로 첨가한다.

상기의 각 액이 첨가된 피검수는, 라인(1)을 흐르면서 두 종류의 첨가액과 혼합되고, 미생물반응의 최적환경인 37℃로 유지한 코일형상의 반응기(2)로 들어가고, 피검수 중에 특정한 세균이 존재하고 있는 경우에는 파지와 상기한 특정 세균이 반응하고, 색소표지 또는 형광표지된 파지핵산(예를 들어 파지 DNA)이 세균세포 내에 주입된다.

이어서 반응기(2)를 나간 세균은, 그 하류에 설치되어 있는 색소검출용 현미경, 분광광도계 또는 형광검출용 형광검출장치 등의 검출장치(3)로 유입되어, 여기서 파지의 핵산주입에 의하여 형광물질 등으로 염색된 특정 세균의 검출이 행하여진다. 이 검출장치(3)의 형식은, 현미경이나 형광현미경과 같이 정지한 시료액 중의 염색된 입자를 검출하는 방식의 것이라도 좋고, 또 플로우셀 중을 유동하는 염색입자를 검출하는 것이라도 좋으며, 정지, 유동 어느 쪽의 경우에도 CCD 카메라 등의 촬상장치를 사용하여 시료액의 화상을 촬영하여 광전변환한 신호를 얻도록 한 방식의 것을 사용할 수 있다.

또 이 검출장치(3)를 촬상장치로서 검출하여 얻은 광전변환한 신호를, 특정 세균의 유무를 조사하거나 양을 정량하는 프로그램을 편성한 MPU(도시생략) 등의 연산처리장치로 보내어, 세균의 유무 또는 세균수를 검출하도록 해도 된다.

또한, 플로우 사이토미터(flow cytometer)와 같이, 플로우셀 중에서 형광입자의 수를 측정하는 형식의 형광검출장치를 이용하면, 상하수, 음료수, 청량음료수 등의 제조, 처리에 관한 라인수(水) 중의 세균수를 연속적으로 검출하는 측정장치를 설계할 수 있다. 「플로우 사이토미터」는 플로우셀을 통과하는 형광을 발하는 입자의 수를 측정하는 유동세포검출법에 사용하는 장치를 말하며, 이 장치로는 형광강도별로 입자의 수를 측정하고 표시할 수 있다.

실시형태 2

도 2는 본 발명의 다른 장치의 일례 개요를 플로우도로 나타낸 것으로서, 본 예의 특징은, 상기한 도 1의 코일형상의 반응기(2) 대신에 필터(7)를 내장한 반응기(6)를 사용한 것 외에는 실시형태 1과 동일 구성으로 한 것을 특징으로 한다. 따라서 다른 구성은 상기한 실시형태 1과 동일하므로, 동일한 구성에 대해서는 동일 부호를 붙이고 설명은 생략한다.

이 장치를 사용한 세균의 검출조작에 대하여 설명하면, 실시형태 1과 동일하게, 세균을 검출하고자 하는 피검수가 흐르고 있는 수계의 라인(1)에 상기 배양농축액(4)과 파지용액(5)을 각각 펌프(41, 51)에 의하여 연속적으로 첨가한다.

그리고 이 배양농축액(4)과, 파지용액(5)이 첨가된 피검수는, 두 종류의 첨가액과 혼합되면서 37℃로 유지된 반응기(6) 속에 설치된 필터(7)를 통과한다. 이 필터(7)로서는, 세균은 포착하나 파지는 투과시키는 것이 사용되고, 예를 들어 포아 사이즈 0.2μm 내지 0.45μm의 것이 바람직하게 사용된다.

피검수 중에 검출대상의 세균이 존재하고 있을 경우에는, 라인(1) 중에서 또는 포착된 필터(7) 상에서 핵산이 색소 또는 형광물질로 표지된 파지와 세균이 접촉하여 반응하고 세균세포 내에 파지 DNA가 주입된다. 일정량의 피검수의 여과 후, 필터를 떼어 내고 현미경이나 형광현미경에 의하여 관찰하거나, 형광강도를 측정하는 다른 검출장치에 의하여 특정 세균의 존재의 유무 등을 판정할 수 있다.

또한 본 예에 있어서는, 파지용액(5)의 공급량을 유량계(52)로 계측하여 공급펌프(51)의 유량을 피드 포워드 또는 피드 백 제어하도록 하고 있다. 이것은, 세균의 검출조건을 가능한 한 일정화하는 것이 바람직하기 때문이며, 유량제어로서는 유량을 일정하게 하는 제어하는 방법, 형광물질의 여기형광발생능력의 경시적 변화에 따라 피드량을 증·감제어방법 등을 적절히 선택하여 채용할 수 있다.

실시형태 3

도 3은 본 발명의 또다른 장치의 일례 개요를 순서도로 나타낸 것으로서, 본 예는, 상기한 실시형태 2에 비하여, 라인(1)에 대하여 파지용액의 첨가를 행하지 않도록 한 점이 다르나, 그 밖의 구성은 실시형태 2와 동일하므로 동일한 구성에 대해서는 동일 부호를 붙이고 설명은 생략한다.

이 장치를 사용한 세균의 검출조작에 대하여 설명하면, 세균을 검출하고자 하는 피검수가 흐르는 수계의 라인(1)에 배양농축액(4)을 첨가하고, 37℃로 유지된 반응기(6) 내의 필터(7)에 일정량의 피검수를 여과시킨다. 본 예의 방식에서는, 이 필터(7) 상에 포착된 세균은 첨가된 배양액에 의하여 증식한다.

다음으로, 소정 시간 경과후 필터(7)를 떼어 내고, 필터(7)에 포착된 세균에 파지용액을 접촉(예를 들어 이 필터를 파지용액에 침지)시킨다. 그리고 소정 시간 후에, 색소표지의 경우는 현미경, 형광물질표지의 경우는 형광현미경을 사용하여 상기 필터를 관찰하여 염색입자수를 계수하거나 촬상장치를 사용하여 화상을 촬영한다.

본 예의 방식은, 필터 상에 포착한 세균을 증식시켜 검출하므로, 매우 미소량이기 때문에 특정 세균의 존재 유무를 확인하는 데 대량의 시료액을 대상으로 해야만 하는 경우에 유효하다.

실시형태 4

상기한 도 3을 이용하여 설명한 실시형태 3의 세균을 포착한 필터(7)를 세균영양원을 포함하는 액에 침지시킴과 동시에 상기 액을 교반 또는 원심분리하여 세균을 필터(7)로부터 박리하고 필터(7)를 제거한 후의 액에 파지용액을 첨가하여, 현미경이나 형광현미경 등의 검출장치에 의하여 관찰하거나 형광강도를 측정하는 다른 검출장치를 사용하여 형광강도를 측정한다.

본 예에 의하면, 필터로부터 박리한 세균을 포함하는 액상 중에서 세균과 파지의 접촉을 행하게 하므로, 교반조작 등을 병용하여 세균과 파지의 접촉기회를 고비율로 부여할 수 있어, 실시형태 3에 비하여 보다 확실한 세균검출이 가능하다.

실시형태 5

본 예는, 상기한 도 3을 이용하여 설명한 실시형태 3의 수계의 라인(1)을, 환경공기를 흡인 통기시키는 기체유통계로 바꾸어, 필터(7)에 공기중의 부유세균을 포착시키도록 한 예를 나타낸다. 단 이 경우에는 배양농축액(4) 및 피드 펌프(41)는 생략된다.

상기와 같이 하여 공기중의 부유세균을 포착한 필터(7)는, 실시형태 3과 동일하게, 필터와 직접 파지용액을 접촉시키거나 또는 실시형태 4와 동일하게 세균을 필터로부터 박리하고 나서 파지용액을 접촉시킴으로써 공기중에 부유하는 세균을 검출할 수 있다.

실시형태 6

도 4에 나타난 본 예는, 세균은 투과할 수 없는 필터를 사용하여 시료액을 농축하는 경우의 예를 나타내고 있다.

즉, 예를 들어 특정한 세균의 존재 또는 부재를 검출하고자 하는 시료액(100)의 소정량을 채취하여 밀폐된 압력용기(101)에 충전함과 동시에 상기 압력용기(101)의 시료액(100)에 가압기체(예를 들어 가압공기 또는 가압질소 등)를 작용시킴으로써 모세관(102)을 거쳐 시료액(100)을 소량씩 다음단 압력챔버(103)로 이송하고, 이 다음단 압력챔버(103)에 있어서 마이크로 필터(104)를 통하여 물을 여과하고, 이에 따라 세균이 농축된 농축액(105)을 만든다. 얻어진 액은 세균이 농축된 피검수가 된다. 이 세균농축액(105)에 대하여 파지용액을 첨가한 후, 예를 들어 현미경이나 형광현미경을 사용하여 세균을 검출한다. 또한 이 도 4에 있어서, 부호 106은 압력용기(101)에 가압기체를 공급하는 노즐, 부호 107은 마이크로 필터(104)를 통하여 유출한 액의 배수계를 나타내고 있다.

이 예에 의하면, 막 여과에 의하여 세균이 농축된 상태의 시료액에 대하여 파지용액을 첨가하는 조작을 행할 수 있어, 본 발명에서 중요한 세균과 파지의 접촉기회를 고비율로 실현할 수 있다.

실시형태 7

도 5에 나타낸 본 예는, 유인물질을 사용하여 세균을 피검수 중에서 농축시켜 검출감도를 높이도록 한 예를 나타낸 것이다.

본 예에 있어서는, 슬라이드 글라스(202)의 밑면에, 영양염류를 첨가한 피검수(201)를 액체방울형상으로 부착시키고(도 5(b) 참조), 이것을 슬라이드 글라스 홀더(203)에 장착하여, 예를 들어 현미경의 대(臺)(205) 위에 올려놓고 현미경의 렌즈(204)를 통하여 세균을 검출할 때에, 슬라이드 글라스(203)의 측방(側方)으로부터 캐필러리(206)의 끝단을 피검수 중의 렌즈초점위치에, 예를 들어 세린, 아스파라긴산, 글루코오스, 갈락토오스 등의 유인물질과 파지를 포함하는 용액을 공급한다. 또한 슬라이드 글라스의 피검수 부착면은 조면(粗面)화하여 피검수 부착량을 많게 할 수 있도록 하는 것이 바람직하다.

이상의 조작에 의하여, 유인물질을 포함하는 용액을 주입한 위치(현미경의 렌즈초점위치)에 세균이 모이고, 유인물질과 함께 공급된 파지가 이 세균에 흡착하여 색소 또는 형광물질로 표지된 파지 DNA가 세균 내에 주입되어, 캐필러리 끝단 근방에 있어서 세균이 모인 상태가 관찰된다.

또한 본 예에 있어서 슬라이드 글라스(202)의 밑면에 피검수(201)를 액체방울형상으로 부착시키도록 하고 있는 것은, 슬라이드 글라스 상에 적하한 피검수를 관찰하는 방법에서는 피검수를 커버 글라스로 피복하나, 이 때문에 피검수 중이 곧 O₂부족으로 되어 세균은 유인물질보다 주위의 공기에 유인되는 경향이 강해지므로, 피검수를 개방상태로 관찰하는 것이 요망되기 때문이다. 또한, 유인물질에 의한 세균유인의 속도는 매우 신속하므로 피검수의 건조는 특별히 문제가 되지 않는다.

본 예에 있어서는, 도 7(a)에 나타낸 바와 같이 하나의 캐필러리(206)에 의하여 유인물질과 파지를 함께 피검수에 공급하는 것으로 하였으나, 이것은 도 7(b)에 나타낸 바와 같이 두개의 캐필러리를 사용하여 유인물질의 공급에 의하여 세균이 모이는 것을 현미경으로 확인한 후에 파지용액을 공급할 수도 있다.

실시형태 8

도 6은 도립(倒立)현미경을 사용하여, 슬라이드 글라스(202) 윗면에 부착시킨 피검수(201)에 실시형태 7과 동일하게 캐필러리(206)를 사용하여 유인물질과 파지용액을 공급하도록 한 예를 나타내고 있다. 부호 207은 도립현미경의 렌즈이다.

이 예에 의하면, 슬라이드 글라스(202)의 윗면에 피검수를 부착시키는 방식 이기 때문에, 비교적 대량의 피검수를 부착시킬 수 있다는 이점이 있다.

실시형태 9

본 예는, 예를 들어 도 1 내지 도 3의 라인(1)에 흐르게 하는 피검수(시료액)를, 세균을 농후하게 포함하는 용액을 수십배 내지 수천배의 소정의 희석배율로 희석한 피검수로 한 경우를 나타낸 것으로서, 세균검출을 위한 조작은 상기 실시형태와 동일하게 행할 수 있다.

이 예에 의하면, 예를 들어 미생물(세균)의 대사활성을 이용하여 소정의 산물을 얻는 제조설비 등에 있어서 이용미생물의 활성 상태를 관리할 수 있다.

실시형태 10

본 예는, 예를 들어 도 8에 나타난 바와 같이, 예를 들어 도 1과 동일한 처리를 행하여 얻은 시료액(60)에 대하여 형광여기광원(61)으로부터 광원광(光源光)을 조사함과 동시에, 이 여기광의 조사로, 파지로부터 주입된 형광물질표지 핵산을 가지는 세균이 나타내는 형광을, 예를 들어 형광현미경의 기능을 가지도록 설치된 촬상장치(62)로 촬상하고, 이 촬상정보를 화상처리장치(일반적으로는 컴퓨터)(63)에 있어서 소정의 화상처리를 함으로써, 기계적, 자동적으로, 형광물질로 염색된 세균을 검출하도록 한 예를 나타내고 있다.

또한 본 예의 방법은, 상기에서 설명한 형광검출에 의한 검출방법으로 한정되는 것이 아니라, 표지물질이나 검출방식이 다른 방법으로 실시할 수 있어, 그러한 몇 가지 예를 이하에 든다.

① : CCD 카메라 등에 의하여 촬상된 화상을 xy 방향으로 소정 해상도로 분해하여 배경과 형광점을 구별하여 각 픽셀(화소)을 검출함과 동시에, 각 형광점의 광 강도를, 예를 들어 계조성(階調性)분석법으로서 일반적으로 사용되고 있는 0 내지 255의 계조(階調)로 각 픽셀마다 분류하여, 미리 정한 광 강도의 역치와 비교하여 역치를 웃도는 광원을 세균으로 한다. 이 경우, 역치를 웃도는 광원 픽셀이 연속하는 경우는 하나의 세균이라고 판정한다.

② : CCD 카메라 등에 의하여 촬상된 화상을 xy 방향으로 소정 해상도로 분해하여, 각 픽셀(화소)을 배경과 형광점으로 나누어 검출하고, 형광점으로서 검출된 픽셀의 x 방향이나 y 방향의 연속길이나 면적을 연산하여, 이 연산결과와 미리 정한 길이나 면적의 역치를 비교함으로써 세균을 검출한다.

③ : CCD 카메라 등에 의하여 촬상된 소정 색상의 분광화상을 xy 방향으로 소정 해상도로 분해하여 각 픽셀(화소)을 배경과 색소검출점으로 나누어 검출하고, 색소검출점으로서 검출된 픽셀의 x 방향이나 y 방향의 연속길이나 면적을 연산하여, 이 연산결과와 미리 정한 길이나 면적의 역치를 비교함으로써 세균을 검출한다.

④ : 상기의 ① 내지 ③의 형광검출점 또는 색소검출점 중, 역치 이상의 픽셀을 검출점으로서 남김과 동시에, 역치 이하의 픽셀을 배경과 동일하다고 간주하여 취소하는(배경과 동일 레벨로 함) 화상처리를 행한다.

또한, 도 8의 예에서는, 광학적 검출수단을 구성하는 것으로서 형광여기광원(61)과 촬상장치(62)만을 도시하고 있으나, 그 밖의 렌즈계나 필터 등이 필요에 따라 설치되는 것은 당연하다. 또 상기의 화상처리 등은 공지의 컴퓨터나 화상처리기술을 사용하여 행할 수 있다.

실시예

참고예 1

하기 (1-1)의 파지조제예에 따라 조제한 대장균 특이적 파지 T4의 핵산을 형광표지한 파지를 사용하여, 파지핵산이 파지입자 내에 충전된 상태에 있는 경우에 대하여, 입자로부터 방출되어 확산한 상태에 있는 경우에 형광강도가 증가하는 것을 확인하기 위하여 다음의 시험을 행하였다.

즉, 농도 3×10⁸/㎖의 파지용액(형광표지핵산을 가지는 파지용액)의 샘플 I과, 이와 동일 농도의 파지용액을, 계면활성제와 알칼리로 처리하여 파지입자를 파괴한 샘플 Ⅱ의 용액의 형광강도를 각각 측정했다.

그 결과, 샘플 Ⅰ의 용액의 형광강도는 24.4인 데 대하여, 샘플 Ⅱ의 용액의 형광강도는 52.3이고, 형광표지된 파지핵산은 확산함으로써 형광강도가 2배 이상으로 증가함을 알 수 있다.

참고예 2

대장균을 10⁸/㎖가 되도록 생리식염수와 영양배지에 각각 현탁하고, 또 따로 슈도모나스도 동일 농도가 되도록 영양배지에 현탁하였다.

다음으로, 제조한 각각에, 참고예 1에서 사용한 형광표지핵산을 가지는 대장균 특이적 파지 T4를 3×10⁹/㎖가 되도록 첨가하고, 37℃, 10분간 방치한 후, 각각의 형광강도를 측정했다.

결과는, 생리식염수에 현탁한 대장균 샘플의 형광강도는 25.2, 영양배지에 현탁한 대장균 샘플의 형광강도는 119.7, 영양배지에 현탁한 슈도모나스 샘플의 형광강도는 28.7이었다.

이러한 점때문에, 생리식염수 중에 현탁한 대장균 샘플에서는, 대장균의 영양부족(대사에너지 부족) 때문에 파지의 대장균에 대한 흡착은 일어나더라도 파지핵산의 대장균 중으로의 주입은 일어나지 않고, 형광강도는 참고예 1과 대략 동일한 값으로 형광강도의 증가가 인정되지 않음을 알 수 있다.

한편, 영양배지에 현탁한 대장균 샘플에서는, 파지의 흡착-파지핵산의 대장균 중으로의 주입(방출-확산)이 일어나고, 형광강도의 현저한 증가가 인정되었다.

또, 영양배지에 현탁한 슈도모나스 샘플에서는, 대장균 특이적 파지 T4의 슈도모나스에 대한 흡착이 일어나지 않고, 또 파지핵산의 방출도 일어나지 않기 때문, 유의차가 있는 형광강도의 증가는 인정되지 않음을 알 수 있다.

이상의 결과로부터, 소정 영양원의 존재에 의하여 대사활성이 있는 세균에, 형광표지핵산을 가지는 세균 특이적 파지를 접촉시킨 후, 형광강도를 측정함으로써, 그 파지에 특이적인 세균의 존재 또는 부재의 판정을 간편하면서도 확실하게 행할 수 있음을 알 수 있다.

또, 예를 들어 형광광도와 세균수의 관계를 미리 확인한 검량선 등을 사용함으로써 특정 세균의 정량을 할 수 있음도 알 수 있다.

(1) 실시예 1. 박테리오파지 T4를 사용한 대장균의 검출

(1-1) 형광표지핵산을 가지는 파지의 조제

대장균 B주(株)를 L브로스 배지(1리터 중에 박토트립톤 10g, 효모엑기스 5g, 염화나트륨 5g을 포함) 중, 37℃에서 호기적으로 배양하여, 대수(對數)증식기 중기에서 IFO(Institution for fermentation, 0saka)로부터 입수한 박테리오파지 T4(No.20004)를 첨가하여 파지를 증식시켰다. 파지의 증식배양에 사용하는 배지는 영양이 풍부한 배지라면 특별히 한정되지 않는다.

DNA를 형광표지한 파지입자를 조제하기 위하여, 배지에 파지를 첨가하는 동시에, 형광색소로서 4, 6-디아미디노-2-페닐이미돌 하이드로클로라이드(DAPI)를 배지 1리터당 1mg 첨가하였다. 또한 형광색소는 파지 DNA에 친화성을 가지는 물질이라면 특별히 한정되지 않는다.

파지가 대장균 세포 내에서 증식하여, 세포를 녹여 배지중에 방출될 때까지 37℃에서 호기적으로 배양을 계속하였다. 그 후, 파지를 포함하는 배양액을 저속원심(3000rpm 10분)하여 세포의 잔사를 제거하고, 염화나트륨을 1M이 되도록 첨가하여 용해하고, 다시 폴리에틸렌글리콜을 10%가 되도록 첨가하여 용해하고, 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 방치후 생긴 응집물을 원심(15000rpm 20분)에 의하여 회수하고, 이 침전을, 5mM 황산마그네슘을 포함하는 20mM 트리스염산완충액의 소량에 현탁하였다. 현탁액에 등량의 클로로포름을 첨가하여, 30초간 격심하게 교반한 후, 원심하여 클로로포름층과 수층을 분리하였다. 파지를 포함한 수층을 채취하여, 30000rpm, 30분의 원심에 의하여 파지를 회수하였다. 얻어진 침전을 소량의 5mM 황산마그네슘-20mM 트리스염산완충액에 현탁하였다.

이 현탁액을, 밀도를 57%, 46%, 33%로 한 염화 세슘의 불연속 밀도 구배의 위에 올려놓고, 수평로터로 30000rpm, 4℃에서 3시간 원심하였다. 형성된 파지의 밴드를 채취하여 투석하여 염화 세슘을 제거하고, 형광표지파지의 정제 제품으로 하였다. 얻어진 파지의 정제 제품의 농도는 10¹²개/㎖였다.

(1-2) 대장균의 검출

상기 형광표지파지 정제 제품을 배양대장균 함유용액(대장균 농도가 10⁸개/㎖) 1㎖에 대하여 2㎕ 첨가하여 형광현미경하에서 관찰한 바, 대장균세포가 형광염색되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 파지를 첨가한 대장균 함유용액에 대하여 형광화상을 낙사(落射)형광현미경(Epifluoreseence Microscope) BH2-RFL(올림푸스사 제품)에 의하여 촬상한 현미경 사진을 도 9(a)에 나타내고, 이 화상에 있어서의 형광점의 x, y 방향 연속성의 길이를 연산하여, 미리 정한 역치 이하의 형광점을 취소하는 화상처리를 행한 결과를 도 9(b)에 나타냈다.

한편, 다른 세균주에 상기 형광표지파지 정제 제품을 첨가하더라도 세균세포는 형광염색되지 않았다. 이러한 점에서, 파지의 숙주의 인식이 엄밀한 것이 확인된다.

또, 대장균을 염소살균하고, 상기 형광표지파지 정제 제품을 첨가한 바 형광은 관찰되지 않았다. 이 결과로부터, 사멸한 대장균(사균 대장균)은 형광염색되지 않고, 파지 DNA가 생균에만 주입되는 것이 확인되었다.

이상의 결과에 의해, 본 발명의 방법에 의하면, 형광표지핵산을 가지는 대장균파지를 사용하면, 대장균을 그 생물활성을 가지는 세포만을 특이적으로 검출할 수 있음이 확인되었다.

(2) 실시예 2. 플로우 사이토미터에 의한 대장균수의 측정

실시예 1의 (1-1)에서 얻은 형광표지한 T4 파지를, 10¹⁰개/㎖ 농도가 되도록 pH 7.5, 20mM 트리스염산(Tris-HCl), 5mM MgSO₄용액으로 희석한 것을, 유동세포계측법을 사용하는 플로우 사이토미터(바이오래드 제품 : BRYTE HS)로 측정한 바, 형광입자는 거의 검출되지 않았다.

이에 대하여, 상기한 플로우 사이토미터를 사용하여, 동수(同數)의 파지를 포함하는 파지용액에 상기 파지의 숙주인 대장균을 첨가한 것 외에는 완전히 동일한 조건으로 측정시험을 행한 바, 형광강도가 강한 영역에 많은 형광입자가 검출되었다.

이들 파지입자 이외의 형광물질을 첨가하고 있지 않은 두 가지 측정시험의 결과로부터, 대장균을 새로이 첨가하였을 때에 출현한 형광강도가 강한 입자는, 박테리오파지에 의하여 주입된 파지 DNA로 형광염색된 대장균에 유래하는 것임은 명백하다.

또한, 상기 장치에 있어서 대장균을 첨가하지 않은 파지용액에 있어서 형광이 검출되지 않은 것은, 상기한 파지 DNA를 가지는 파지입자가 매우 미세하기 때문인지, 또는 파지중에 존재하는 파지 DNA의 형태에 유래하기 때문인지 반드시 명확하지는 않으나, 해당 장치의 검출한계능력 이하이기 때문이라고 생각된다. 따라서, 사용하는 광학적 검출장치에 따라서는, 파지 중 및 세균 중의 어느 쪽의 형광표지파지 DNA를 모두 검출함과 동시에 그 형광강도의 차에 따라 양자의 상태의 차이를 판별하는 방식의 광학적 수단과 정보처리수단을 사용할 수 있다.

또 이상의 파지 DNA에 의한 대장균의 형광검출의 확인을 위하여, 대장균을 파지를 사용하는 일 없이 직접 형광색소로 형광하여 측정했다. 또한 대장균의 직접형광염색은, DAPI를 1μg/㎖로 되도록 배양대장균에 첨가함으로써 대장균의 DNA를 염색하였다.

이 결과, 파지로 형광하였을 때에 출현한 것과 동일한 형광강도를 나타내는 입자가 거의 동수 검출되었다.

이상에 따라, 본 발명방법에 의하면, 대장균을 직접 형광색소로 표지하는 종래 법과 동일 정도의 형광검출이 가능하고, 또한 본 발명의 파지에 의한 세균의 형광염색에 의하면, 세균을 직접 형광색소로 염색하는 방법과 달리 엄밀하게 선택된 특정한 세균만을 특이적으로 염색할 수 있다는 이점이 얻어지고, 세균의 정량성이 비약적으로 향상한다.

(3) 실시예 3. 박테리오파지 T4에 의한 대장균의 선택적 검출

본 예에 있어서는, 환경보다 장내 세균을 단리하여 박테리오파지 T4에 의한 동정이 가능한지 여부를 시험하였다.

오사카부(大阪府)의 하수를 피검수로 하여 데속시콜레이트 한천배지(에이켄가가쿠주식회사)에 도포하였다. 이 한천배지는, 대장균 및 대장균군에 포함되는 세균이 빨강색의 콜로니를 형성하므로 다른 일반세균과 구별할 수 있는 것이다.

하수를 직접 도포한 이한천배지 상에 생긴 콜로니 중, 대장균 및 대장균군이 포함되어 있다고 생각되는 붉은 콜로니로부터 50개 골라내어, DAPI에서 표지한 박테리오파지 T4에 의한 형광성과 β-글루쿠로니다아제의 활성을 조사하였다. β-글루쿠로니다아제는 대장균에 특이적인 효소이고, 이 효소의 유무에 의하여 대장균군과 대장균을 구별할 수 있다(상수시험법 ; 특정효소기질배지법).

또 동시에, 바이오테스트 1호(에이켄가가쿠주식회사)로 코드(Code)에 의한 균종의 동정을 행하였다. 결과를 하기 표 1에 나타낸다. 표 1은 대장균 및 대장균군에 포함되는 세균이라고 생각되는 균을 동정한 결과이다.

또한, 표 1에 있어서 「+」는 활성반응이 있었던 것을 나타내고(양성), 「-」는 활성반응이 없었던 것을 나타낸다(음성). 또, 균종 란의 빈 란은 바이오테스트에 있어서의 Code에 해당하는 균이 발견되지 않았던 것을 의미하고, 균종명 뒤에 적은 '*'는, ***로 나타낸 균종에 대해서는 10% 이상의 적합률, **은 1% 이상, *은 0.2% 이상, 표시가 없는 것은 0.2% 미만의 적합률임을 의미하고 있다.

상기한 표 1의 결과로부터, β-글루쿠로니다아제의 활성반응방법과 바이오테스트와의 적합률은 16%였던 것에 대하여, 본 발명에 의한 방법과 바이오테스트와의 적합률은 94%였다.

이 때문에, 본 발명방법에 의한 정량성은 종래 법과 비교하여 각별히 높은 것이 확인된다.

(4) 실시예 4. 유인물질에 의한 세균의 농축

배양대장균(대장균 농도10⁸개/㎖)을 포함하는 피검수 0.1㎖와, 실시예 2에서 조제한 형광표지핵산을 가지는 박테리오파지 T4의 정제 제품과, 유인물질로서 세린을 1mM의 농도로 포함하는 유인물질용액을 준비하고, 실시형태 7과 같이 하여 슬라이드 글라스의 밑면에 피검수를 부착시켜 형광현미경에 세트하고, 그 피검수에, 캐필러리(유리관을 버너로 뜨겁게 하여 늘려 제작한 캐필러리)를 사용하여 T4 파지 정제 제품 및 유인물질용액을 주입하여 형광현미경으로 관찰하였다.

그 관찰결과를 도 7에 나타냈다. 도 7(a)는 T4 파지 정제 제품 및 유인물질용액을 혼합하여 하나의 캐필러리로 피검수에 주입하였을 경우, 도 7(b)는 T4 파지 정제 제품과 유인물질용액을 각각의 캐필러리로 주입한 경우의 결과를 나타내고 있다. 이들 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 세균은 캐필러리 끝단 근방에 모여 있어, 감도가 좋은 검출을 할 수 있음이 확인되었다.

(5) 실시예 5. 파장이 다른 두 종류의 형광색소로 표지한 두 종류의 파지를 사용한 두 종류의 세균의 동시검출

(5-1) 형광표지핵산을 가지는 파지의 조제

상기한 실시예 1(1-1)의 파지의 조제조작에 비하여, 형광색소를 DAPI로부터 아크리딘 오렌지로 변경한 것 이외에는 동일한 조작에 의하여 아크리딘 오렌지로 표지한 대장균 특이적 파지 T4를 조제하고, 또 동일하게 실시예 1(1-1)의 파지의 조제조작에 비하여, 파지를 IFO로부터 입수한 살모넬라균 특이적 파지 P22(No20023)로 변경한 것 이외에는 동일한 조작에 의하여 DAPI로 표지한 살모넬라균 특이적 파지 P22를 조제하였다.

상기의 아크리딘 오렌지로 표지한 대장균 특이적 파지 T4는 형광현미경하에서 여기파장 492nm으로 관찰하면 황녹색의 형광입자로서 관찰되고, DAPI로 표지한 살모넬라균 특이적 파지 P22는 여기파장 345nm로 관찰하면 청색의 형광입자로서 관찰되었다. 또 이들 파지를 혼합하여 관찰하더라도, 각각의 형광색소의 여기파장 및 형광파장이 다르기 때문에 서로의 관찰을 간섭하는 일은 없었다.

(5-2) 대장균과 살모넬라균의 검출

영양 브로스에서 각각 배양한 균체 농도 10⁹개/㎖의 대장균과 살모넬라균을 등량씩 혼합한 것을 시험액으로 하고, 이것에 아크리딘 오렌지로 표지한 대장균 특이적 파지 T4와 DAPI로 표지한 살모넬라균 특이적 파지 P22를 각각 10¹⁰개/㎖가 되도록 첨가하여, 37℃에서 10분간 정치한 후, 형광현미경하에서 관찰하여 여기파장 492nm로 아크리딘 오렌지로 표지한 파지 T4에 의하여 염색된 대장균을 확인하고, 또 여기파장 345nm로 DAPI로 표지한 파지 P22에 의하여 염색된 살모넬라균을 확인하여, 각각 10시야 균의 수를 세었다. 여기파장 492nm에서 확인된 대장균의 수는 20, 15, 27, 22, 28, 42, 30, 18, 22, 22로 평균 24.6이었다. 또 여기파장 345nm에서 확인된 살모넬라균의 수는 19, 33, 27, 35, 38, 14, 48, 25, 18, 22로 평균 27.9이고, 관찰된 균체의 수는 최초에 균체비 1:1로 혼합한 시험액의 비와 잘 일치하였다.

이상의 결과로부터, 파장(여기파장 또는 형광파장)이 다른 두 종류(내지 그 이상)의 형광색소로 염색한 두 종류(내지 그 이상)의 파지를 사용함으로써 두 종류(내지 그 이상)의 특정한 균을 동시에 검출할 수 있음이 확인되었다.

(6) 실시예 6. 동일 형광색소로 염색한 두 종류의 파지에 의한 두 종류의 세균의 총수 측정

(6-1) 형광표지핵산을 가지는 파지의 조제

실시예 1 (1-1)에서 조제한 DAPI로 표지한 대장균 특이적 파지 T4와, 실시예 5 (5-1)에서 조제한 DAPI로 표지한 상기한 살모넬라균 특이적 파지 P22를 형광표지핵산을 가지는 파지로 하였다.

(6-2) 대장균과 살모넬라균의 검출

영양 브로스에서 각각 배양한 균체 농도 10⁸개/㎖의 대장균과 살모넬라균을 등량씩 혼합한 것을 시험액으로 하고, 이것에 상기 형광표지한 파지 T4와 파지 P22를 각각 10¹⁰개/㎖가 되도록 첨가하여, 37℃에서 10분간 정치한 후, 플로우 사이토미터에 의하여 균체수를 측정했다. 이 형광입자의 측정치는 8×10⁷/㎖였다.

이에 대하여, 대장균의 배양액 및 살모넬라균을 포함하지 않은 배양액을 등량 혼합한 경우의 액에 대하여 마찬가지로 하여 플로우 사이토미터에 의하여 균체수를 측정한 바 형광입자수의 측정치는 3×10⁷/㎖이고, 또 살모넬라균의 배양액 및 대장균을 포함하지 않은 배양액을 등량 혼합한 경우의 액에 대하여 마찬가지로 하여 플로우 사이토미터에 의하여 균체수를 측정한 바, 형광입자수의 측정치는 3×10⁷/㎖이고, 각각 상기한 양 균을 포함하는 시험액에 대하여 행한 균체수의 측정치의 약 절반으로 잘 일치하였다.

이들 결과로부터, 두 종류 이상의 파지를 동일 색소로 표지함으로써 두 종류 이상의 특정한 세균의 총수를 구할 수 있음을 알 수 있다.

(7) 실시예 7. 첨가하는 파지농도의 검출결과에 대한 영향

첨가하는 파지농도를 변화시킴으로써, 검출되는 세균의 갯수나 검출할 수 있게 되기까지의 시간에 영향이 생기는지 여부를 확인하는 시험을 행하였다.

(7-1) 대장균을 L브로스 중에 10⁶개/㎖가 되도록 조제하고, 이 배양 대장균 함유용액 중에 파지농도 10⁴개/㎖, 10⁸개/㎖, 10⁹개/㎖, 10¹⁰개/㎖가 되도록 각각 실시예 1의 (1-1)에서 얻은 형광표지한 T4 파지를 첨가하였다.

(7-2) 37℃에서 배양하고, 일정시간마다 일정량(60㎕)의 샘플을 채취하여, 플로우 사이토미터로 대장균의 계측을 행하였다.

파지농도 10¹⁰개/㎖, 10⁹개/㎖의 샘플은, 배양후 15분에 현저한 형광입자가 계측되고, 그 계측치는 모두 10⁶개/㎖이며, 최초에 조제한 배양 대장균 농도와 잘 일치하였다. 이들 샘플에 있어서는 배양 시간을 연장하더라도 이 이상 측정치에 변화는 인정되지 않았다.

파지농도 10⁸개/㎖의 샘플에 있어서는, 배양후 15분의 시점에서는 현저한 형광입자의 측정치는 10⁵개/㎖이고, 실제 값의 10% 정도의 갯수밖에 측정되지 않았다. 그러나, 이 샘플에 있어서도, 배양 30분의 시점에서 계측하면 대략 10⁶개/㎖의 입자수가 계측되었다.

파지농도 10⁴개/㎖의 샘플에 있어서는, 배양 15분의 시점 또 30분의 시점에서도 현저한 형광입자가 확인되지 않았다. 배양 시간을 더 연장하더라도 현저한 형광입자는 확인할 수 없었다.

이상의 결과에 따르면, 샘플에 첨가하는 파지의 농도가 희박하면, 검출에 시간을 요하게 되고, 또 검출할 수 없는 세균의 갯수가 증가한다.

본 발명은, 박테리오파지가 숙주세균을 특이적으로 인식하고, 생물활성을 유지하고 있는 숙주세균(생균)에만 DNA를 주입한다는 성질을 이용함으로써, 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 파지 DNA를 가지는 박테리오파지를 특정한 세균에 접촉시키는 것만으로 세균을 염색할 수 있고, 또한 이 염색된 세균을 분광분석하거나 또는 형광검출함으로써, 파지 DNA를 가지는 박테리오파지와 세균을 광학적으로 유의하게 식별할 수 있는 것이기 때문에, 염색된 세균과 박테리오파지를 물리적으로 분리하는 조작을 필요로 하지 않는다는 이점이 얻어지며, 특정한 세균을, 더욱이 생균만을, 신속하면서도 간단한 조작으로 검출·동정할 수 있어, 예를 들어 환경수, 환경공기, 식품이나 상하수, 병원, 정밀기계공장, 식품제조·가공공장의 용수나 공기에 있어서 존재가 기피되는 미량의 세균을 검출할 수 있다는 효과를 나타내는 것이다.

또, 본원의 청구범위 제 2 항, 제 16 항의 발명에 의하면, 막 상에 포착한 세균에 주입된 파지 DNA는 형광물질의 결합(표지)에 의하여 유전자의 전사가 저해되어, 새로운 파지입자의 복제나 세균을 용균하는 효소군을 생성하지 않고, 세균을 형광염색한 상태가 안정적으로 유지되므로 처리시간의 영향을 받지 않고 정밀도 높은 검출을 할 수 있다는 효과가 나타난다.

본원의 청구범위 제 3 항 내지 제 6 항, 제 17 항 내지 제 19 항의 발명에 의하면, 세균을 농축하여 검출하므로 정밀도 높은 확실한 검출을 실현할 수 있다.

본원의 청구범위 제 7 항, 제 20 항의 발명에 의하면, 식품제조공장이나 약품제조공장에 있어서 사용하는 유용세균의 활성관리에 이용할 수 있다는 효과를 나타낸다.

본원의 청구범위 제 8 항, 제 21 항의 발명에 의하면, 플로우셀 중을 흐르는 피검수 중의 세균의 유무 또는 세균수를 실시간으로 연속하여 검출·동정할 수 있다는 효과를 나타낸다.

본원의 청구범위 제 9 항, 제 23 항의 발명에 의하면, 필요에 따라 영양염류를 첨가함으로써, 대사를 행하고 있는 상태로 세균을 유지하여 형광표지한 파지 DNA를 상기 세균에 확실하게 주입시킬 수 있다.

본원의 청구범위 제 10 항의 발명에 의하면, 파지가 세균에 접촉할 가능성이 증가하고, 검출하는 하나의 세균의 색소에 의한 염색농도가 증가하며, 또 하나의 세균이 나타내는 형광강도를 증가시킬 수 있다. 따라서 보다 정밀도 높은 검출을 할 수 있다는 효과가 나타난다.

본원의 청구범위 제 11 항의 발명에 의하면, 종류가 다른 파지가 각각 특이적으로 흡착하는 복수 종류의 세균을 포함하는 시료액에, 핵산을 다른 여기파장 또는 형광파장의 형광물질로 표지한 각 세균에 특이적인 파지를 첨가하여, 각 여기파장마다 또는 형광파장마다 각 세균을 검출할 수 있으므로, 다른 종류의 복수의 세균을 검출하는 조작을 동시에 행할 수 있다.

본원의 청구범위 제 12 항의 발명에 의하면, 종류가 다른 복수의 세균에 대하여 각각 특이적으로 흡착하는 파지를 동일 형광물질로 표지하고 있으므로, 예를 들어 검사하고자 하는 세균이 검사대상의 액 중에 존재하는지 여부를 용이하게 조사할 수 있다.

본원의 청구범위 제 13 항, 제 14 항, 제 22 항의 발명에 의하면, 촬상한 화상에 의거하여, 미리 정한 역치를 기준으로 하여 세균과 파지를 명료하게 구별할 수 있고, 화상처리기술을 이용하여 자동계측에 이용할 수 있다.

본원의 청구범위 제 24 항, 제 25 항의 발명에 의하면, 옥외의 검출작업시에 그 장소에서의 검출을 효율적으로 행할 수 있다.

이상의 효과를 나타내는 본원의 각 발명에 의하면, 상하수, 환경수, 식품의 세균검사를 비약적으로 향상시킬 수 있다.

Claims

핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 숙주세균에 접촉시키고, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 광학적 검출수단을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
공기 또는 액체에 포함되는 세균을 포착수단에 포착함과 동시에, 상기 세균을 숙주로 하고 또한 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 상기 포착한 세균에 접촉시켜, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 광학적 검출수단을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
검출하고자 하는 세균을 희박하게 포함하는 시료액 중에서 상기 세균을 농축함과 동시에, 상기 세균을 숙주로 하고 또한 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 상기 세균을 농축한 액 중에 공급함으로써 숙주세균에 접촉시켜, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 광학적 검출수단을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
제 3 항에 있어서,

세균의 농축이, 막 분리 또는 원심분리에 의하는 것을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
제 3 항에 있어서,

세균의 농축이, 검출하고자 하는 특정 세균의 유인물질을 시료액 중의 한정된 좁은 영역에 공급하는 방법임을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
제 5 항에 있어서,

유인물질을 캐필러리로 공급하는 것을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
검출하고자 하는 세균을 농후하게 포함하는 시료액을 희석하고, 상기 세균을 숙주로 하고 또한 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 상기 세균의 희석시료액 중에 공급함으로써 숙주세균에 접촉시켜, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 광학적 검출수단을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 시료액 중에서 숙주세균에 접촉시켜, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 유동세포계측법에 의하여 검출하는 것을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서,

박테리오파지의 숙주세균에 대한 감염초기의 흡착-핵산주입에 필요한 영양원을 상기 숙주세균에 대하여 공급하는 것을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중의 어느 한 항에 있어서,

형광물질로 표지한 파지가 세균을 포함하는 시료액 중에서 10⁵내지 10¹⁴개/㎖가 되도록 하는 것을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중의 어느 한 항에 있어서,

종류가 다른 파지의 핵산을 각각 색상이 다른 색소 또는 여기파장 또는 형광파장이 다른 형광물질로 표지한 파지시약을 사용하고, 이들 종류가 다른 파지가 각각 특이적으로 흡착하는 복수 종류의 세균을 포함하는 시료액에 상기 파지시약을 첨가하여 복수의 세균을 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중의 어느 한 항에 있어서,

종류가 다른 파지의 핵산을 동일 색소 또는 동일 형광물질로 표지한 파지시약을 사용하고, 이들 종류가 다른 파지가 각각 특이적으로 흡착하는 복수 종류의 세균을 포함하는 시료액에 상기 파지시약을 첨가하여 복수의 세균의 총수를 검출하는 것을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 있어서,

형광표지핵산이 주입된 세균의 형광강도 또는 형광광원의 크기를 계측하고, 그 계측치와 미리 정한 역치를 비교함으로써 역치를 넘은 광원을 세균으로서 검출하는 것을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 있어서,

광학적 검출수단을 사용하여 계측한 형광강도 또는 형광광원의 크기가, 미리 정한 형광강도 역치 또는 광원의 크기 역치 이하의 광원을 제거하는 화상처리를 한 후, 처리후의 화상으로부터 세균의 유무 또는 세균수를 검출하는 것을 특징으로 하는 세균의 검출방법.
검출대상세균에 특이적으로 흡착하고 또한 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 포함하는 용액을 시료액에 첨가하는 수단과, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 검출하는 광학적 검출수단을 구비한 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 14 항의 방법에 사용하는 세균의 검출장치.
공기 또는 액체에 포함되는 세균을 막 상에 포착하는 포착수단과, 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 포함하는 파지용액을 상기 포착한 세균에 접촉시키는 파지용액 접촉수단과, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 검출하는 광학적 검출수단을 구비한 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 14 항의 방법에 사용하는 세균의 검출장치.
시료액 중의 세균을 농축하는 수단과, 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 포함하는 파지용액을 상기 농축한 시료액에 공급하는 파지용액 공급수단과, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 검출하는 광학적 검출수단을 구비한 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 14 항의 방법에 사용하는 세균의 검출장치.
제 17 항에 있어서,

농축수단이, 막분리장치 또는 원심분리장치임을 특징으로 하는 세균의 검출장치.
제 17 항에 있어서,

농축수단이, 시료액 중의 한정된 좁은 영역 내에 세균유인물질을 공급하는 수단임을 특징으로 하는 세균의 검출장치.
세균을 농후하게 포함하는 시료액을 희석하는 수단과, 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 포함하는 파지용액을 상기 희석한 시료액에 공급하는 파지용액 공급수단과, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 검출하는 광학적 검출수단을 구비한 것을 특징으로 하는 세균의 검출장치.
시료액을 플로우셀 중에 연속적으로 통과시키는 액체공급수단과, 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지를 포함하는 파지용액을 상기 플로우셀의 전단에 있어서 시료액에 첨가하는 파지용액 첨가수단과, 색소표지핵산 또는 형광표지핵산이 주입된 세균을 플로우셀로 검출하는 광학적 검출수단을 구비한 것을 특징으로 하는 세균의 검출장치.
제 15 항 내지 제 21 항 중의 어느 한 항에 있어서,

광학적 검출수단이 촬상수단이고, 이 촬상수단으로 얻은 촬상화상으로부터 미리 정한 형광강도 역치 또는 형광광원의 크기 역치 이하의 광원을 제거하는 화상처리수단을 설치한 것을 특징으로 하는 세균의 검출장치.
제 15 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서,

박테리오파지의 숙주세균에 대한 감염초기의 흡착-핵산주입에 필요한 영양원을 시료액에 공급하는 영양원 공급수단을 설치한 것을 특징으로 하는 세균의 검출장치.
검출대상 균이 자화할 수 있는 탄소원을 포함하는 세균검출용 보조제, 핵산을 색소 또는 형광물질로 표지한 박테리오파지시약 및 측정대상시료를 첨가하기 위하여 준비된 반응용기로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 14 항의 방법에 사용하는 휴대형 세균검출용 키트.
제 24 항에 있어서,

세균검출용 보조제는, 파지의 세균에 대한 흡착을 촉진하는 흡착보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 휴대형 세균검출용 키트.