CN110656038B

CN110656038B - 一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板及其应用

Info

Publication number: CN110656038B
Application number: CN201910968255.XA
Authority: CN
Inventors: 刘玉庆
Original assignee: Rec Union Qingdao Bioengineering Co ltd; Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Current assignee: Rec Union Qingdao Bioengineering Co ltd; Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date: 2019-10-12
Filing date: 2019-10-12
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2039-10-12
Also published as: CN110656038A

Abstract

本发明公开了一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板及其应用，本专利将筛选获得的噬菌体根据其对不同人畜共患病原菌的裂解效果，形成不同人畜共患病原菌的噬菌体库，并根据噬菌体库设计制备一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板，该检测板包括A噬菌体盒、B接种盒和C检测盒，利用本专利可构建高通量噬菌体筛选体系，形成一套完整的标准化操作、高通量检测、自动化识别并转化为统计数据智能化组合、信息可上传兽医抗药性云监测与噬菌体防控(Varms)数据库的筛选体系。

Description

一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板及其应用

技术领域

本发明涉及一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板及其应用，属于微生物领域。

背景技术

细菌感染和污染是我国乃至全球的经济和健康问题。抗生素近半个世纪的广泛应用，导致人畜共患病原菌，如沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、链球菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌等普遍存在多重抗药性，噬菌体防治细菌感染和防止细菌污染具有巨大的应用潜力，成为当代医疗和畜产品生产的迫切需要。

噬菌体是细菌的特异性病毒，具有种甚至菌株的高度特异性，而兽医临床流行菌株又是变异和流动的，群体小动物饲养流行菌株往往形成异质的流行菌群，因此①需要高效动态获得大范围流行菌株；②筛选相应的噬菌体，逐步建立某种细菌的菌株库和噬菌体库(均为几百株的规模)，这样，③面对某一菌株或者菌群，从噬菌体库中高效筛选相应的裂解性噬菌体，才能获得最佳的防治效果。

传统的点滴法筛选噬菌体的检测产品，存在通量小、成本高、耗时、费力、裸眼不能准确识别和统计等缺点。因此，需要建立一种标准化操作、高通量检测、自动化识别并转化为统计数据智能化组合的筛选体系，按照裂解率排序优选，根据各株噬菌体的裂解谱的互补性进行组合优化，以最少种类的噬菌体裂解最多种类的细菌

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板及其应用，本专利将筛选获得的噬菌体根据其对不同人畜共患病原菌的裂解效果，形成不同人畜共患病原菌的噬菌体库，并根据噬菌体库设计制备一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板。

一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板，包括A噬菌体盒、B接种盒和C检测盒；

所述A噬菌体盒包括噬菌体液或噬菌体冻干粉(使用时加生理盐水稀释悬浮)、第一孔板和第一不带接种针的盖板；

所述B接种盒包括第二孔板和带接种针的盖板，所述的带接种针的盖板上的接种针和带孔噬菌体板上的孔洞一一对应；

所述C检测盒包括菌种检测板和第二不带接种针的盖板。

进一步的，上述第一孔板和第二孔板为96孔板。

进一步的，上述噬菌体液放置于第一孔板的孔洞中，每个孔洞放置一种噬菌体液。

进一步的，上述菌种检测板不带孔洞。

进一步的，上述人畜共患病原菌优选为但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌中的一种。

进一步的，上述高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板的制备方法包括如下步骤：

1)人畜共患病原菌菌液的制备：划线平板法培养一种人畜共患病原菌，挑取单菌落接种于液体培养基中，36-38℃，150-180r/min震荡培养6-10h，检测菌种生长情况，菌种到达指数生长期即可；

2)获得上述人畜共患病原菌的噬菌体：取步骤1)中获得的人畜共患病原菌的菌种液，人畜共患病原菌的噬菌体，利用双层琼脂法制备含有人畜共患病原菌的菌种液及其噬菌体的平板培养基，35-37℃培养3-6h，挑取平板上透明清晰单个噬菌斑至SM缓冲液中，3-4℃过夜，滤膜过滤，获得噬菌体；

3)富集噬菌体：取80-100μl的步骤2)中获得的噬菌体和80-100μl步骤1)中获得的人畜共患病原菌菌液混合后加入液体培养基中，36-38℃，150-180r/min震荡培养10-12h，获得富集的噬菌体培养液，将上述噬菌体培养液离心后滤膜过滤，获得富集的噬菌体液；

4)制备人畜共患病原菌噬菌体检测板：将该种人畜共患菌所有的噬菌体按照上述步骤1)-步骤3)的方法制备其富集的噬菌体液，标号，依次注入带孔噬菌体板中，盖上第一不带接种针的盖板，放置于超净工作台，获得A噬菌体盒；准备和第一孔板类似的第二孔板，灭菌后盖上带有接种针的盖板，放置于超净工作台，获得B检测盒；另准备尺寸和第一孔板类似但不带孔洞的菌种检测板，灭菌后盖上不带有接种针的盖板，放置于超净工作台，获得C检测盒；即可获得高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板。

进一步的，上述培养基指LB培养基。

进一步的，上述高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板的使用方法包括如下步骤：

1)取出上述制备好的筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板，用排枪或者移液工作站在装有噬菌体液的A盒第一孔板的每孔中都加入80-90μl的生理盐水，并震荡混匀2分钟；

2)高压灭菌固体培养基倾倒于上述C检测盒中的菌种检测板上，待凝固后，加入添加有待检人畜共患病原菌菌液的半固体培养基，做成人畜共患病原菌的双层琼脂检测板；

3)用B检测盒的带接种针的盖板蘸取第一孔板中噬菌体液，对准接种到步骤2)获得的人畜共患病原菌的双层琼脂检测板上，盖上第二不带接种针的盖板，倒置35-37℃培养5-6h；

4)用图像自动识别仪拍照步骤3)中接种了噬菌体的的菌种检测板，定位识别每个孔对应位置有无噬菌斑，并记录其对应的噬菌体编号，录入兽医抗药性云监测与噬菌体防控(Varms)数据库；

5)统计分析：对于每一株人畜共患病原菌统计裂解性噬菌体；对于每一株噬菌体统计其对该待检菌群的裂解率，从高到低排序；根据每一株噬菌体对该种人畜共患病原菌的裂解谱互补性，选择能裂解最多人畜共患病原菌的最少株噬菌体组合。

上述高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板在筛选人畜共患病原菌的噬菌体中的应用。

上述高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板在构建人畜共患病原菌的噬菌体库中的应用。

上述高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板在针对待检菌群从噬菌体库中高效筛选裂解性噬菌体中的应用。

有益效果：

(1)实现人畜共患病原体的噬菌体筛选的高通量性。传统的点滴法筛选噬菌体单次筛选量小，且总体筛选过程成本高、耗时、费力，本发明的筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板可以单次筛选多个裂解性噬菌体，并根据每一株噬菌体对该种病原菌的裂解谱互补性，选择能裂解最多株该病原菌的最少株噬菌体组合。

(2)本专利可应用于构建高通量噬菌体筛选体系，形成一套完整的标准化操作、高通量检测、自动化识别并转化为统计数据智能化组合、信息可上传兽医抗药性云监测与噬菌体防控(Varms)数据库的筛选体系。

附图说明

图1沙门氏菌在培养基上的形态。

图2形成的检测板产品照片。

图3点阵沙门氏菌噬菌体检测板上的噬菌斑图。

图4噬菌体裂解不同菌种的情况。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1制备96点阵沙门氏菌噬菌体检测深孔板

一、材料和方法

①沙门氏菌培养：在LB琼脂培养基划线接种沙门氏菌，37℃恒温培养12h。挑取单菌落，置于装有1ml的LB液体培养基的灭菌管中，37℃，180r/min震荡培养6h，待液体浑浊，菌液到达指数期即可。

②双层平板活化噬菌体：取无菌5ml EP管，加入100μl培养好的沙门氏菌液，同时也加入对应的已稀释到合适梯度的沙门氏菌噬菌体100μl，随后加入事先冷却至45-55℃半固体LB培养基(NaCl 1g/ml，胰蛋白胨1g/ml，酵母浸液0.5g/ml，0.6％琼脂粉，蒸馏水)3ml，迅速颠倒混匀，防止半固体凝结，倾倒于事先准备好的LB固体培养基(NaCl1g/ml，胰蛋白胨1g/ml，酵母浸液0.5g/ml，1.2％琼脂粉，蒸馏水)上，在超净工作台中冷却凝固，37℃培养3-6h。挑取双层板上透明清晰的单个噬菌斑至1ml SM缓冲液中，4℃过夜。利用0.22μm滤膜过滤，获得噬菌体。

③富集噬菌体：将100μl菌液与100μl噬菌体加入装有30ml LB液体培养基的50ml离心管中，37℃、180r/min震荡培养过夜。将富集好的噬菌体10000rpm离心10min，0.22μm滤膜过滤，滤液存放在4℃冰箱。

④制备沙门氏菌噬菌体盒：所有噬菌体按照上述方法制备，编号，依序用移液器取2ml加入96深孔板中，盖上盖子，4℃冷藏。

⑤准备空96孔板和相应盖板。

二、结果

(1)从图1中可以看出，沙门氏菌在沙门氏菌显色培养基上呈现为紫色菌落，在LB固体上为白色菌落。

(2)图2可见形成的检测板成品。

实施例2利用高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板的筛选病原菌噬菌体的实验

一、材料与步骤

①活化待检沙门氏菌：将140株沙门氏菌在LB琼脂培养基中划线培养，挑取单菌落在LB液体培养基中，震荡过夜，培养成菌悬液。

②制备沙门氏菌双层检测板：高压灭菌LB固体培养基15ml，倾倒于96点阵检测板中，水平放置凝固。LB半固体培养基加热融化后分装于5ml EP管，高压灭菌后冷却至45-55℃，加入100μl待检沙门氏菌液，迅速摇匀倾倒，平铺于LB固体板中，做成沙门氏菌双层检测板。

③点种噬菌体：在上述制备好的96点阵沙门氏菌噬菌体检测板，用排枪或者移液工作站在每孔中都加入90μl的生理盐水，并震荡混匀2分钟。用96点阵接种针蘸取的沙门氏菌噬菌体，对准接种到沙门氏菌的双层检测板。接种时轻轻触碰半固体面，注意不要将半固体刺破，并确保每种噬菌体都成功接种。盖上盖子在超净工作台上静置晾干，倒置37℃培养6h。

④识别统计噬菌斑：用图像自动识别仪拍照沙门氏菌双层检测板，定位识别每个孔对应位置有无噬菌斑，并记录其对应的噬菌体编号，录入兽医抗药性云监测与噬菌体防控(Varms)数据库。

⑤统计分析：对于每一株沙门氏菌统计裂解性噬菌体；对于每一株噬菌体统计其对该待检菌群的裂解率，从高到低排序；根据每一株噬菌体对沙门氏菌的裂解谱互补性，选择能裂解最多株沙门氏菌的最少株噬菌体组合。

二、结果

(1)分离鉴定的140株沙门氏菌相关信息见表1。

表1沙门氏菌信息

(2)在双层板上的61株噬菌体的噬菌斑形态见图3。

从图3中可以看出，检测板上长出的噬菌斑形态各不相同：有的噬菌斑呈圆形；有的噬菌斑形态破碎，不成圆形；有的噬菌斑不透亮，非常模糊；没有噬菌斑。根据噬菌体的形态，将其分为4种情况如图3中的F:圆形噬菌斑、破碎噬菌斑、模糊噬菌斑、无噬菌斑，统计结果时，按照这4类进行统计。一块检测板上能出现大部分的噬菌斑，说明61株沙门氏菌噬菌体对沙门氏菌的裂解率较高。

(3)整理统计结果，统计噬菌体裂解率，结果如表2。

表2沙门氏菌噬菌体裂解情况

注●代表圆形噬菌斑、★代表破碎噬菌斑、*代表模糊噬菌斑、○代表无噬菌斑

表2-4中，第一列为噬菌体名称，第二列中每个单元格中的数据分别代表一种噬菌体裂解140株沙门氏菌，其中圆形噬菌斑所占的比例。第三、四、五列中每个单元格中的数据分别代表一种噬菌体裂解140株沙门氏菌，其中破碎噬菌斑、模糊噬菌斑、不裂解所占的比例。从表格中的数据可以看出，噬菌体不裂解的比例在4.29％-26.43％之间，其裂解率在73.57％-95.71％，每种噬菌体的裂解水平还是比较高的。其中，裂解率最高的五株噬菌体为105ys、106ys、XZ-6、CJT-6、140ys，裂解率分别为95.71％、95％、95％、94.29％、94.29％。CJZ-3、XZ-8、XFI-6、87ys、LYW这五株噬菌体的裂解率也在93％以上。另外，在裂解的三种噬菌斑形态中，圆形的噬菌体占较大的比例，破碎及模糊的噬菌斑占比较小。但也存在例外，如噬菌体LY费上3G破碎的噬菌斑占50％的比例。

(4)针对不同企业的沙门氏菌，统计噬菌体裂解率，结果如表3。

表3噬菌体针对各个企业沙门氏菌裂解率统计

从表3中也可看出噬菌体对于益生的沙门氏菌裂解率为29.55％-97.73％，而对民和的沙门氏菌裂解率略低2.94％-97.06％，可见噬菌体对每个地区的沙门氏菌的裂解率有一定的区别。另外，根据每个地区噬菌体裂解率的高低，选择噬菌体的最佳组合。组合结果如下：针对民和的沙门氏菌，105ys、XZ-8、87ys、XFI-9、18080这五株噬菌体的裂解率都在94％以上，可单株或组合使用。针对益生的沙门氏菌，105ys、106ys、XFI-6、CJT-6、87ys这五株噬菌体的裂解率在95％以上，可单株或组合使用。针对大象的沙门氏菌，105ys、CJT-6、MG-1、106ys、XFI-6这五株噬菌体的裂解率在90％以上，可将105ys单株使用或这几株组合使用。针对于六和的沙门氏菌，105ys、18080、XZ-8、MG-1、XZ-6这五株噬菌体裂解率都为70％。针对和康源的沙门氏菌，105ys、XZ-8、18080、DZ陵9G、JZ-7这五株噬菌体的裂解率都为100％。

(5)利用沙门氏菌噬菌体裂解15株大肠杆菌、15株金黄色葡萄球菌、15株克雷伯菌、15株铜绿假单胞菌的结果如图4。

实施例3构建高通量噬菌体筛选体系

(1)病原菌高效采样快递汇集系统

制备采样管，内装无菌运输半固体培养基，管盖内部连接小铲，可以刮取病料上的细菌样本，然后插入运输培养基；管盖外面打二维码，其主要信息为Varms管理人员与采样人员沟通确定的采样养殖场、屠宰场信息，已经储存，采样管分类装自封口袋，所有的采样管装包裹袋，贴二维码，与采样管的信息相同，增加采样任务量。采样人用手机APP扫描包裹二维码确认任务，扫描每个采样管二维码后，在手机上只要输入采样的部位即可。

具备完整采样信息的采样管分类装自封口袋和包裹袋，交由顺丰快递，寄送到Varms检测中心。

Varms检测中心扫描审核采样管信息和数量，用血平板和相应的选择培养基分离培养目的菌株，用MODI-TOFF-MAS鉴定验证菌株分类种属，入菌株库，实现菌株定名、定位。

(2)病原菌高效药敏试验系统

采用专利《一种细菌抗药性检测系统》(ZL201621167158.9)方法。

(3)筛选病原菌噬菌体并上传数据

同实施例2中操作。

(4)高效互动交流系统

所有的检测信息和数据处理结果，均由Varms数据库在www.varmscloud.cn展示，用户可凭账户和密码登录，与Varms管理人员互动交流，确定相对敏感的抗生素、裂解率高噬菌体和互补性好噬菌体组合，定制噬菌体制剂。使用效果及时反馈Varms。具体见软件著作权。

Claims

1.一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板的使用方法，其特征在于，

所述高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板，包括A噬菌体盒、B接种盒和C检测盒；

所述A噬菌体盒包括噬菌体液、第一孔板和第一不带接种针的盖板；

所述C检测盒包括菌种检测板和第二不带接种针的盖板；

其使用方法包括如下步骤：

1)取出所述高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板，用排枪或者移液工作站在装有噬菌体液的A盒第一孔板的每孔中都加入80-90μl的生理盐水，并震荡混匀2分钟；

2)高压灭菌固体培养基倾倒于所述C检测盒中的菌种检测板上，待凝固后，加入添加有待检人畜共患病原菌菌液的半固体培养基，做成人畜共患病原菌的双层琼脂检测板；

4)用图像自动识别仪拍照步骤3)中接种了噬菌体的的菌种检测板，定位识别每个孔对应位置有无噬菌斑，并记录其对应的噬菌体编号，录入兽医抗药性云监测与噬菌体防控Varms数据库；

2.如权利要求1所述的使用方法，其特征在于，所述第一孔板和第二孔板为96孔板。

3.如权利要求1所述的使用方法，其特征在于，所述的噬菌体液放置于带孔噬菌体板上的孔洞中，每个孔洞放置一种噬菌体液。

4.如权利要求1所述的使用方法，其特征在于，所述的菌种检测板不带孔洞。

5.如权利要求1所述的使用方法，其特征在于，所述的人畜共患病原菌为大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌中的一种。