CN101952457B - 流体样品分析的微生物系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于检测液体样品中目标微生物存在的方法和系统。所述方法包括以下步骤：使所述液体样品通过表面过滤器，让所述表面过滤器与培养装置接触，将所述培养装置温育一段时间，并检测目标微生物的存在。所述方法可与自动检测系统一起使用。

Description

流体样品分析的微生物系统和方法
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求于2007年12月21日提交的美国临时申请No.61/016,265的优先权。
背景技术
大肠菌类或其他指示菌的存在是食品和水质量的重要证据。在许多国家和/或自治区都规定了允许存在于饮用水或某些食品(例如乳品)中的大肠菌数量。大肠菌包括来自于大自然的细菌，例如存在于土壤中的那些。大肠菌也包括粪便大肠菌，例如大肠杆菌。样品中存在粪便大肠菌是食品或水最近受到了粪便污染以及可能存在病原生物体的主要指标。
对水样中的微生物计数的方法可见于(例如)美国公共卫生协会(the American Public Health Association)、美国自来水工程协会(theAmerican Water Works Association)和水环境联合会(the WaterEnvironment Federation)联合出版的第21版纲要“Standard Methods forthe Examination of Water and Wastewater”(SMEWW)(水和废水检验标准方法)。SMEWW介绍了一种用以获得水中微生物的直接计数的膜过滤技术。膜过滤技术可用于监测样品的微生物品质，这些样品来自旨在生产饮用水的工艺，以及来自于各种天然的、未处理的水源。
食品样品中的微生物计数的方法通常有所差别，这取决于食品的性质和可能存在于样品中的生物体的类型。若干检验食品样品的方法概要包括：由美国公共卫生协会(Washington，D.C.)公布的第27版“Standard Methods for the Examination of Dairy Products”(乳品检验标准方法)；以及由美国食品药品管理局(the U.S.Food and DrugAdministration，Washington，D.C.)公布的“Bacteriological AnalyticalManual”(BAM)(细菌学分析手册)。通常将固体食品悬浮在水性介质中，并混合和/或研磨以得到可用在微生物定量分析方法中的食品材料的液态匀浆。
上述各种方法通常都需要非常熟练的技术人员来观察和解释检验结果。需要简单、准确的方法来测定液体样品中微生物的数量。
发明内容
在一个实施例中，本发明包括检测样品中目标微生物存在的方法。该方法可包括提供疑似含有目标微生物的样品、表面过滤器和含有培养基的培养装置。该方法还可包括在过滤器上收集目标微生物、使表面过滤器与培养基接触、将培养装置温育一段时间以及检测目标微生物的存在。目标微生物可任选用自动化检测系统检测。
在另一个实施例中，本发明包括检测液体样品中目标微生物存在的方法。该方法可包括提供疑似含有目标微生物的液体样品、含有培养基的培养装置以及当与培养装置中的水合培养基接触时基本上透明的过滤器。该方法可进一步包括在过滤器上收集目标微生物、让过滤器与培养基接触、将培养装置温育一段时间以及检测目标微生物的存在。目标微生物可任选用自动化检测系统检测。
在另一个实施例中，本发明包括检测产气微生物的方法。该方法可包括提供疑似含有产气微生物的样品、表面过滤器、包括含有能发酵营养物质的培养基的平膜培养装置。该方法还可包括在表面过滤器上收集来自样品的产气微生物、使表面过滤器与培养基接触、将与培养基接触的表面过滤器温育一段时间以及检测产气微生物的存在。目标微生物可任选用自动化检测系统检测。
在另一个实施例中，本发明包括检测产气微生物的方法。该方法包括提供疑似含有产气微生物的样品、包括含有能发酵营养物质的培养基的培养装置，以及当与培养装置中的水合培养基接触时基本上透明的过滤器以及自动检测系统。该方法可进一步包括在过滤器上收集来自样品的产气微生物、让过滤器与培养基接触、将与培养基接触的表面过滤器温育一段时间以及检测产气微生物的存在。目标微生物可任选用自动化检测系统检测。
术语“培养装置”指用于在允许至少一个细胞发生分裂的条件下繁殖微生物的装置。培养装置包括使造成意外污染的可能性降至最低的壳体(如带盖的培养皿)以及支持微生物生长的营养物质源。
术语“过滤器”是指由上下主表面构成的相对平坦的膜式过滤器。膜式过滤器由上下主表面以及由孔、流路或通道构成，流体和颗粒可通过这些孔、流路或通道从过滤器的上表面流向下表面。如本文所用，“上主表面”是指流体样品(如具有悬浮颗粒的液体或气体)透过它进入过滤器的过滤器主表面。术语“下主表面”是指滤液透过它离开过滤器的过滤器主表面。
如本文所用，“表面过滤器”或“表面型过滤器”是指这样的一类过滤器，其中在过滤器表面的各个通道开口的横截面积与过滤器内任何其他点的所述通道的横截面积通常具有大致相同的尺寸。表面过滤器使大于各个通道的开口的粒子无法进入或通过过滤器，因此这些粒子通常保留在过滤器的表面上。
术语“优选的”和“优选地”是指本发明的实施例在某些情况下可提供一定的益处。然而，在相同的或其他情况下，其他实施例也可以是优选的。此外，详述一个或多个优选的实施例并非表明其他实施例不可用，也并非旨在将其他实施例排除在本发明的范围之外。
术语“包含”和其变型形式在说明书和权利要求书中出现时不具有限制性意义。
本文所用的“一种”、“一个”、“所述”“至少一种”、“一种或多种”可交替使用。因此，例如，疑似包含“一种”目标微生物的液体样品可被理解为是指该液体样品可包含“一种或多种”目标微生物。
术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或更多个的组合。
另外，在本文中，由端点界定的数值范围包括该范围内所含的所有数值(如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
本发明的上述发明内容并非意图描述本发明的每个公开的实施例或每种实施方式。下面的说明书更为具体地举例说明了示例性实施例。在本专利申请中的许多地方，通过实例的列表给出具体指示，其实例可采用各种组合方式来应用。在每个例子中，所引用的列表只是用作代表性的组，并不应该被解释为是排他性的列表。
附图说明
将参照下面列出的附图来进一步说明本发明，其中在全部视图中类似的结构由类似的数字标注。
图1为根据本发明的一个实施例的打开的平膜培养装置的透视图，其中平膜培养装置具有垫片，垫片带有孔，而滤膜插入孔中。
图2为根据本发明的一个实施例的打开的平膜培养装置的透视图，其中平膜培养装置具有插入其中的滤膜。
图3为根据本发明的一个实施例的培养皿的透视图，其中培养皿包含半固体培养基，而滤膜设置在培养基上。
图4为根据本发明的一个实施例的培养皿的透视图，其中培养皿包含多孔载体，而滤膜设置在载体上。
具体实施方式
本发明涉及用于对液体样品中的微生物进行检测和/或计数的方法。本发明还涉及使用膜式过滤器(结合培养装置)对液体样品中的微生物进行检测和/或计数。诸如3M PETRIFILM平板(3M公司，St.Paul，MN)之类的培养装置为可用于微生物繁殖和检测的样品即用型(sample-ready)装置。另外，PETRIFILM平板包含方便某些目标微生物检测和计数的指示剂。
图1示出了可根据本发明使用的平膜培养装置10。培养装置10包括具有自承基底12的主体构件11，自承基底12具有上表面14和下表面16。基底12在其上表面14上涂覆有粘合剂组合物18的层。可冷水复水的干培养基20(含有至少一种选自一种或多种胶凝剂和一种或多种营养物质的成分)以薄的、相对均匀的层粘附至粘合剂组合物18上。垫片23部分地覆盖基底12和干培养基20的表面，并具有暴露干培养基20的一部分的孔24。覆盖片22覆盖垫片23和孔24。如果提起覆盖片22使干培养基20暴露，则可将液体样品已通过其的膜式过滤器26放在孔24中暴露的干培养基20上。膜式过滤器26可以任一取向(即，膜式过滤器26的上主表面朝向干培养基20或膜式过滤器26的上主表面朝向覆盖片22)置于干培养基20上。将膜式过滤器26置于干培养基20上后，可向孔24中加入合适体积的水性溶剂(如无菌水)，然后可放低覆盖片22至膜式过滤器26和/或垫片23上。覆盖片22还可包括粘合剂层和干培养基层，如美国专利No.5,089,413的图2中所示。一旦与可含溶质的水性溶剂(未示出)水合后，可冷水复水的干培养基20层就迅速形成复水的培养基(未示出)，其继而能够使存在于膜式过滤器26表面上的微生物生长。在可供选择的实施例中，在将膜式过滤器26插入培养装置前，干培养基20可用水性溶剂水合，从而形成复水的培养基。
图2示出了可根据本发明使用的平膜培养装置110。培养装置110包括具有自承基底112的主体构件111，自承基底112具有上表面114和下表面116。基底112在其上表面114上涂覆有粘合剂组合物118的层。可冷水复水的干粉121(含有至少一种选自一种或多种胶凝剂和一种或多种营养物质的成分)以薄的、相对均匀的层粘附至粘合剂组合物118上。覆盖片122覆盖干粉121。如果提起覆盖片122，则可将液体样品已通过其的膜式过滤器126置于干粉121上。膜式过滤器126可以任一取向(即，膜式过滤器126的上主表面朝向干粉121或膜式过滤器126的上主表面朝向覆盖片122)置于干粉121上。将膜式过滤器126置于干粉121上后，可向膜式过滤器126上添加合适体积的水性溶剂(如无菌水)，然后可放低覆盖片122至膜式过滤器126上。一旦与水性溶剂(未示出)水合后，可冷水复水的干粉121层就迅速形成复水的培养基(未示出)，其继而能够使存在于膜式过滤器126表面上的微生物生长。在可供选择的实施例中，在将膜式过滤器126插入培养装置之前，干粉121可用水性溶剂水合，从而形成复水的培养基。
图3示出了可根据本发明使用的可供选择的培养装置210。培养装置210由包含半固体培养基230的容器260构成。有许多本领域已知的合适容器260。合适的容器260包括培养皿、烧瓶、瓶、管、烧杯等等。容器优选为无菌的或可进行灭菌，以防止污染样品或培养基230。容器260可用封盖、顶盖等覆盖，以防止污染样品或培养基230和/或防止样品或培养基230变干。可将液体样品已通过其的膜式过滤器226置于培养基230上。膜式过滤器226可以任一取向(即，膜式过滤器226的上主表面朝向培养基230或膜式过滤器226的下主表面朝向培养基230)置于培养基230上。图3示出了在合适的条件下温育后可在膜式过滤器226上观察到的微生物集落250。
图4示出了可根据本发明使用的培养装置310。培养装置310由容器360和过滤器载体340构成。有许多本领域已知的合适容器360。合适的容器360包括培养皿、烧瓶、瓶、管、烧杯等等。容器优选为无菌的或可进行灭菌，以防止污染样品或多孔载体340。容器360优选可用封盖、顶盖等覆盖(未示出)，以防止污染样品或多孔载体340和/或防止样品或多孔载体340变干。多孔载体340可由能够支承膜式过滤器326的材料制成，使得当多孔载体340用水性溶剂饱和时，多孔载体340在膜式过滤器326下表面的至少一部分与水性溶剂之间提供接触。在一些实施例中，多孔载体340在膜式过滤器326的整个下表面与水性溶剂之间提供接触。水性溶剂可包含含有营养物质的溶液以支持目标微生物的生长和/或可包含含有试剂的溶液以检测目标微生物。作为另外一种选择，多孔载体可包括含有营养物质的粉末以支持目标微生物的生长和/或包括含有试剂的粉末以检测目标微生物的存在。本领域的普通技术人员熟悉培养和/或检测目标微生物的合适营养物质和试剂。适用于多孔载体340的材料的非限制性例子包括纤维素材料，例如滤纸；泡沫，例如聚氨酯泡沫；水凝胶；烧结玻璃；等等。在液体样品已通过膜式过滤器326后，可将膜式过滤器326以任一取向置于多孔载体340上。优选地，以膜式过滤器326的上主表面朝向多孔载体将膜式过滤器326置于多孔载体340上。
样品和目标微生物
本发明方法中所用的样品可以是液体样品或悬浮在液态介质中的固体样品。优选地，可以物理(如匀化)和/或化学(如通过与表面活性剂混合)方法处理固体样品，使目标微生物悬浮在液态介质中。液体样品可包含悬浮的固体，前提条件是悬浮固体的浓度或粒度不会有碍样品滤过表面型膜式过滤器。在过滤前可在合适的溶剂(如无菌水或缓冲溶液)中稀释液态或悬浮固体样品。
含水样品可适用于本发明的方法，前提条件是含水样品不会降解膜式过滤器或不会在过滤器上留下会干扰目标微生物检测(如抑制微生物生长)的残余物。也可使用无水样品，前提条件是无水样品不会防止膜式过滤器在与培养装置接触时变成透明的，不会降解膜式过滤器，或不会在过滤器上留下会干扰目标微生物检测的残余物(如，残余物不会干扰微生物的生长或干扰可用于检测微生物的酶活性)。可适用于本发明方法的液体样品的非限制性例子包括但不限于：地表水、人或动物用水、生物药物制剂用水、悬浮在水性溶剂中的食品或乳品、饮料、果汁、工业用水、冷却水、循环水、锅炉水、锅炉补给水、地下水、娱乐用水、经处理的水和废水。
本发明的方法适用于检测或鉴定多种目标微生物。该方法适用于可在培养装置中生长和/或繁殖的目标微生物。目标微生物可以为细菌、酵母、霉菌或病毒。该方法可用于检测好氧菌或厌氧菌。示例性目标微生物包括来自肠杆菌属(Enterobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、李斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)和硫螺旋菌属(Thiospirillum)的物种；来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的物种；大肠菌类；粪便大肠菌；粪便链球菌属(Streptococcus)物种；大肠杆菌(Escherichia coli)；蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)；河生肠杆菌(Enterobacter amnigenus)；环孢子虫(Cylospora)或隐孢子虫属(Cryptosporidium)物种；轮状病毒；和甲型肝炎病毒。
膜式过滤器和过滤单元
通过将液态或固体样品转到过滤器表面上或让液体样品滤过膜式过滤器，可在膜式过滤器上收集目标微生物。在膜式过滤器上收集样品后，可将过滤器转移至培养装置。膜式过滤器可为不会抑制目标微生物的生长或代谢活性的表面型微孔膜式过滤器。膜式过滤器可由例如陶瓷氧化铝、径迹刻蚀聚碳酸酯或径迹刻蚀聚酯制成。合适的膜式过滤器也包括当与水合培养基(例如培养装置中的水合培养基)接触时基本上透明的过滤器。如本文所用，“基本上透明的”膜式过滤器是指不会使培养装置中的微生物生长标记(如集落、pH指示剂、气泡、酶反应的产物或中间体)明显失真或有碍对其进行观察或成像的膜式过滤器。合适的膜式过滤器的非限制性例子包括：Whatman Inc.(Florham Park，NJ)以商品名ANOPORE销售的陶瓷膜式过滤器，其厚度为约60μm，孔隙度为约25-50％，折射指数为约1.6；以及WhatmanInc.以商品名NUCLEOPORE销售的径迹刻蚀聚碳酸酯过滤器，其厚度为约10-20μm，孔隙度为约15％，折射指数为约1.6。
通常对膜式过滤器的孔径进行选择，使得目标微生物不会通过孔，从而确保样品中基本上所有的目标微生物都被收集到过滤器上。典型的细菌长度为约0.5到5.0μm。某些较小的细菌(例如支原体)直径大约为0.3μm。酵母细胞一般比细菌大。典型的酵母细胞直径为约3-4μm，但某些直径大至约40μm。霉菌可以单个细胞、孢子或菌丝存在。虽然通常比细菌大，但霉菌细胞的平均大小会因物种而变化。病毒通常比细菌小。例如，轮状病毒直径为约0.07μm，甲型肝炎病毒直径为约0.027μm，杯状病毒(如诺如病毒)直径为约0.027-0.040μm，细小核糖核酸病毒(如脊髓灰质炎病毒)直径为约0.03μm，肠腺病毒直径为约0.07μm。因此，可根据目标微生物选择具有合适孔径的膜式过滤器。例如，孔径为1.0μm或更小、0.8μm或更小、0.6μm或更小、0.4μm或更小、0.2μm或更小、0.1μm或更小、0.05μm或更小、0.03μm或更小、0.02μm或更小或0.01μm或更小的膜式过滤器可适用于捕集和检测目标细菌。对于捕集和检测目标酵母或霉菌而言，孔径为12μm或更小、8μm或更小、5μm或更小、3μm或更小、2μm或更小、1μm或更小、0.8μm或更小、0.6μm或更小、0.4μm或更小、0.2μm或更小或0.1μm或更小的膜式过滤器可能是合适的。对于捕集和检测目标病毒而言，孔径为0.05μm或更小、0.03μm或更小、0.02μm或更小或0.01μm或更小的膜式过滤器可能是合适的。
膜式过滤器可由合适的过滤介质手工制备，或可按照预切的尺寸和形状购买。膜式过滤器的尺寸和形状可根据样品体积和样品中颗粒材料的预期负荷进行选择。通常，较大表面积的膜式过滤器比较小表面积的膜式过滤器允许更高的过滤速率。直径为13mm、25mm或47mm的圆形膜式过滤器可从许多商业渠道容易地获得，并尤其适于与相应的过滤装置一起使用。膜式过滤器可与其他过滤介质(如预过滤器，以捕集样品中的较大碎片)或其他膜式过滤器联合使用。例如，可以孔径依次减小的顺序叠放膜式过滤器，以便将较大的微生物(如酵母和霉菌)与较小的微生物(如细菌或病毒)分开，从而使得能单独地分析膜式过滤器以检测不同的微生物。
膜式过滤器可结合过滤单元使用。在液体样品通过膜式过滤器时，过滤单元可用于保持膜式过滤器。液体样品通过膜式过滤器后，可从过滤单元移除膜式过滤器，并转移到培养装置。优选的过滤单元包括被构造为易于移除膜式过滤器并将膜式过滤器布置到培养装置中的那些。
可将过滤装置设计用于连接到注射器上或与注射器一起使用，例如由Millipore Corporation以商品名SWINNEX销售的过滤器固定器。或者，对于较大的体积，可将过滤装置设计用于连接到烧瓶上。优选地，在样品通过过滤器前，可对膜式过滤器和过滤装置进行灭菌。
其中可结合本文所公开的膜式过滤器和方法的示例性系统包括以下专利中所述的那些：提交于2007年5月31日、名称为“Devices andProcesses for Collecting and Concentrating Samples for MicrobiologicalAnalysis”(收集和浓缩用于微生物分析的样品的装置和方法)的美国专利申请No.60/941,145；提交于2007年11月20日、名称为“Systemand Method for Preparing and Analyzing Samples”(制备和分析样品的系统和方法)的美国专利申请No.60/989,180；提交于2007年11月20日、名称为“System and Method for Preparing and Delivering Samples”(制备和输送样品的系统和方法)美国专利申请No.60/989,175；提交于2007年11月20日、名称为“System and Method for Preparing andCollecting Samples”(制备和收集样品的系统和方法)的美国专利申请No.60/989,170；以及提交于2007年11月20日、名称为“System andMethod for Environmental Sampling”(用于环境取样的系统和方法)的美国专利申请No.60/989,180。
培养装置
多种培养装置均可用于本发明的方法。在一些实施例中，培养装置可检测细菌的存在。在可供选择的实施例中，培养装置可检测酵母和/或霉菌的存在。在某些实施例中，培养装置可检测病毒的存在。
在一些用于检测细菌、酵母或霉菌的实施例中，培养装置可包括预成形的水凝胶基质(如琼脂、琼脂糖、果胶钙)，水凝胶基质包含营养物质以支持目标微生物的生长以及任选的至少一种指示剂以方便目标微生物的检测。在一些实施例中，水凝胶还包含至少一种选择试剂(例如盐、表面活性剂或抗生素)以提供一种环境，该环境相对于可能存在于样品中的非目标微生物而言更有利于目标微生物的生长或检测。可将预成形的水凝胶基质置于任何合适的容器中，例如培养皿、烧杯或烧瓶。优选地，在膜式过滤器与水凝胶接触前，可对水凝胶和容器灭菌。
在其他实施例中，培养装置可包括包含营养物质以支持目标微生物生长和任选的至少一种指示剂以方便目标微生物检测的干燥、可再水合培养装置。此类装置的非限制性例子在美国专利No.4,476,226、5,089,413、5,232,838、6,331,429和6,638,755中有所描述。干燥的可再水合培养装置可包括胶凝剂。合适的胶凝剂包括可溶于冷水的天然和合成胶凝剂。此类胶凝剂的非限制性例子包括瓜耳胶、黄原胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、刺槐豆胶、褐藻胶以及它们中的两种或更多种的组合。此类装置也包括支持微生物生长或代谢的营养物质。支持多种微生物生长的营养物质的非限制性例子包括蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖等等。培养和/或鉴定某些生物体或生物体群落所需的具体营养物质或营养物质组合在本领域中是已知的。在一些实施例中，干燥的可再水合培养装置还包括至少一种选择试剂(例如盐、表面活性剂或抗生素)以提供一种环境，该环境相对于可能存在于样品中的非目标微生物而言更有利于目标微生物的生长或检测。
在其他实施例中，培养装置可包括多孔载体，多孔载体与包含支持目标微生物生长的营养物质和任选的至少一种方便目标微生物检测的指示剂的水性混合物流体连通。在一些实施例中，水性混合物还包含至少一种选择试剂(例如盐、表面活性剂或抗生素)以提供一种环境，该环境相对于可能存在于样品中的非目标微生物而言更有利于目标微生物的生长或检测。
优选的是，多孔载体不含可通过水性溶剂运输并抑制目标微生物检测的材料。多孔载体可以为多种物理形式之一，例如织物、无纺布、凝胶、泡沫、网片、稀松布、釉料、微复制膜等等。某些多孔载体由亲水材料构造，例如滤纸或玻璃纤维过滤器。作为另外一种选择，载体可由经处理以赋予材料亲水性的疏水材料或能够通过(例如)毛细管作用运输水性溶剂或溶液的疏水材料构造。
可将多孔载体置于任何合适的容器中，例如培养皿、烧杯或烧瓶。优选地，在布置膜式过滤器与多孔载体接触前，对多孔载体和容器进行灭菌。
在某些实施例中，培养装置包括具有容纳在其中的宿主细胞系的壳体。当病毒粒子感染培养的细胞系(组织培养)时，通过观察它们引起的细胞病变效应(CPE)可在培养装置中对某些病毒进行检测。组织培养技术及其相应的培养装置在本领域中是已知的。在这些实施例中，可将液体样品已通过其的膜式过滤器转移到含细胞系的培养装置中。作为另外一种选择，可将病毒从过滤器洗涤到小体积的无菌水、缓冲液或组织培养基中，然后可将所得的悬液加到培养装置中。在温育一段合适的时间后，可观察组织培养物的CPE指示，例如噬菌斑形成。或在视觉上或借助显微镜和/或成像系统观察斑块。使用染料可改善对斑块的视觉检测，例如结晶紫或免疫试剂(如荧光标记抗体)。
样品制备系统
表面过滤器、过滤单元和培养装置可用包装材料组合在一起，并作为样品制备系统(试剂盒)销售，以用于检测样品中的微生物。例如，样品制备系统可具有包装在一起的两个或更多个组件(如表面过滤器和培养装置)或三个或更多个组件(如表面过滤器、过滤单元和培养装置)。在某些实施例中，可构造过滤单元构造以方便移除表面过滤器。
样品制备系统还可以包括取样和检验附件，例如悬浮样品的介质(如水、缓冲液、生长培养基)、试剂(如染料、指示剂、酶、酶底物、裂解剂、方便洗脱的试剂)、移液管、标签、镊子、样品容器和/或手套。在某些实施例中，可对样品制备系统的各个组件灭菌。在某些实施例中，样品制备系统的组件可在单独包裹的原始包装中。
自动检测系统
用于对培养装置中的微生物集落计数的自动系统在本领域中是已知的。此类自动系统通常包括：成像系统、确定集落计数的图像分析算法以及显示和任选储存和操作集落计数数据和图像的数据管理系统。用于对琼脂平板上的菌落计数的示例性系统由Synbiosis(Cambridge，UK)以商品名PROTOCOL销售并在美国专利No.6,002,789中有所描述。用于对PETRIFILM平板上的菌落计数的系统在美国专利No.5,403,722、7,298,885和7,298,886中有所描述。
通常，用于对微生物集落计数的自动系统通过集落或其产生的代谢物吸收、反射、发射或散射光线的能力来检测目标微生物的存在。因此，可通过例如比色、荧光或发光(如化学发光或生物发光)等方法检测集落。
在某些检测中，例如大肠菌检测，希望确定微生物是否通过乳糖产气(即二氧化碳)。3M PETRIFILM大肠菌计数板和大肠杆菌计数板将乳糖掺入营养物质生长培养基中。在这些检测中，可通过生长培养基中pH指示剂的颜色变化而试验性地鉴定大肠菌菌落。pH值变化表明菌落已通过乳糖产生了酸性终产物，并可推测菌落为大肠菌菌落。通过观察靠近菌落的一个或多个气泡的存在，可确定推测的大肠菌菌落为大肠菌微生物。可通过目测方法或自动系统(如美国专利No.7,298,886中所述的自动集落计数系统)观察气泡。在水合和封闭时包括半固体生长培养基(与生长培养基一侧上的自承基底连续接触)和覆盖片(位于生长培养基的另一侧上)(参见图1和图2)的平膜培养装置(如PETRIFILM大肠杆菌/大肠菌群计数板)特别适合于捕集由乳糖发酵型大肠菌微生物产生的气泡。
验证性鉴定检测
本发明的某些培养装置提供了用于确切鉴定存在于培养装置中的微生物的手段，例如选择试剂和/或差异性试剂。其他培养装置可提供对存在于培养装置中的微生物的临时鉴定。当进行这种临时鉴定时，有时希望通过进行额外的检测以对微生物的种类进行确认。本发明的方法提供了验证性检测。
在已对培养装置进行温育并已观察(经目测方法或通过自动检测系统)了生物体的存在后，可从培养装置上移除目标微生物以用于进一步的分析，或就某些遗传或免疫检测而言，可在培养装置中(即原位)进行该分析。进一步分析可包括化学分析(如色谱法、谱学法、光谱测定法)、遗传分析(如杂交、核酸扩增)和免疫分析(如ELISA、免疫色谱法、凝集反应、放射免疫测定法)。
可通过(例如)从整个膜式过滤器和培养基中移除或提取微生物或其组分利用培养装置中的整个样品进行分析。作为另外一种选择，可分离和/或提取培养装置的较小区域或单独的菌落进行分析。在一些实施例中，硝化纤维或尼龙膜可用于“提起”微生物或其组分，随后进行遗传、生物化学或免疫测试。具体的分析方法可见于“MolecularCloning，A Laboratory Manual”(分子克隆实验指南)第3版(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，将其以引用方式全文并入本文。
实例
实例1
Petrifilm大肠杆菌/大肠菌群计数板中大肠菌的视觉检测。
Petrifilm大肠杆菌/大肠菌群计数板得自3M公司(St.Paul，MN)。混合纤维素酯(MCE)膜式过滤器(47mm的直径，0.45μm的标称孔径)得自Millipore Corporation(Billerica，MA)。氧化铝基质陶瓷膜式过滤器(47mm的直径，0.2μm的标称孔径)得自Whatman(Florham Park，NJ)。河生肠杆菌ATCC 51818得自American Type Culture Collection(Manassas，VA)。
让细菌培养物在35℃下于胰酪胨大豆肉汤中过夜生长。将过夜培养物在1.5升未处理的(如未氯化、氟化或软化的水)井水中稀释，至最终浓度为约0.5至1.0菌落形成单位/毫升(CFU/mL)。将100毫升体积的该稀释培养物滤过无菌过滤设备(Microfil V；Millipore Corporation，Billerica，MA)中的膜式过滤器。在无菌操作下用无菌镊子从过滤设备上移除膜，然后置于Petrifilm EC平板中的干燥圆形培养基上。根据制造商的说明书，将取1毫升无菌Butterfield氏磷酸盐稀释液分散到膜上，封闭Petrifilm平板，稀释剂均匀分布在平板上。小心操作该步骤，以避免接种期间将气泡引入平板中。在35℃下将平板温育24±2小时。根据制造商手动对平板进行计数。结果如表1所示。
表1.视觉检测Petrifilm平板中膜式过滤器上的河生肠杆菌。
Figure BPA00001197136600161
实例2
Petrifilm大肠杆菌/大肠菌群计数板中大肠菌的自动检测。
如实例1中所述，培养河生肠杆菌的过夜培养物、稀释并过滤。如实例1中所述，将过滤器置于Petrifilm EC平板中并进行温育。将温育过的平板放入Petrifilm酶标仪(3M公司，St.Paul，MN)中，根据制造商说明书由酶标仪测定大肠菌菌落的数目。结果如表2所示。
表2.自动检测检测Petrifilm平板中膜式过滤器上的河生肠杆菌。
Figure BPA00001197136600162
酶标仪在MCE滤膜上仅检测到一个菌落。该菌落伴随有气泡，因此被计为大肠菌。该平板的视觉检测表明至少有数十个小的、扩散的、红色菌落未被酶标仪检测到。相比之下，酶标仪在陶瓷滤膜上检测到51个菌落。在那些菌落中，酶标仪检测到四个伴随有气泡。
本发明现已结合本发明人可预见的可给出实施性描述的几个具体实施例，对本发明进行了描述。但本发明的非实质性的修改形式(包括目前没有预见的修改形式)可构成本发明的等价形式。因而，本发明的范围不应受限于本文所述的细节和结构，而是仅受下面的权利要求书以及其等价形式限制。
实例3
使用Petrifilm大肠杆菌/大肠菌群计数板自动检测和鉴定混合的细 菌悬液。
如实例1所述制备细菌培养物。在该实例中所用的细菌为蜂房哈夫尼菌ATCC 51815(大肠菌的一种菌种)和大肠杆菌ATCC 11229，二者均得自美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)。如实例1所述稀释培养物，并混合以得到每100毫升水每种生物体大约50-100CFU的悬液。如实例1所述，过滤100mL该悬液，然后放入Petrifilm大肠杆菌/大肠菌群计数板。在35℃下将平板温育24小时。让温育后的平板通过Petrifilm酶标仪，针对各板中菌落的存在及类型对图像进行分析。数据在表3中示出。在实验中使用陶瓷膜式过滤器通过未改进的扫描酶标仪和软件系统检测大肠菌和大肠杆菌菌落。在MCE膜式过滤器上生长的某些蓝色菌落未被自动酶标仪识别和计数。
表3.生长在Petrifilm大肠杆菌/大肠菌群计数板中的混合培养物 的酶标仪菌落计数.在该测试中，典型的蜂房哈夫尼菌菌落应表现为带 气泡的红色菌落，典型的大肠杆菌菌落应表现为带气泡的蓝色菌落。 最后一列示出了在平板和平板图像上清晰可见但未被自动酶标仪的图 像分析软件识别和计数的菌落数目。
Figure BPA00001197136600171
本发明现已结合本发明人可预见的可给出实施性描述的几个具体实施例，对本发明进行了描述。但本发明的非实质性的修改形式(包括目前没有预见的修改形式)可构成本发明的等价形式。因而，本发明的范围不应受限于本文所述的细节和结构，而是仅受下面的权利要求书以及其等价形式限制。

Claims (3)

1.一种用于检测产气微生物的非疾病诊断方法，包括以下步骤：
提供疑似含有产气微生物的样品、表面过滤器和包括含有能发酵营养物质的培养基的平膜培养装置；其中所述平膜培养装置在水合和封闭时包括：半固体生长培养基，其与所述生长培养基一侧上的自承基底连续接触，以及位于所述生长培养基另一侧上的覆盖片；
在所述表面过滤器上从所述样品收集产气微生物；
使所述表面过滤器与所述培养基接触；
将与所述培养基接触的所述表面过滤器温育一段时间；以及
检测产气微生物的存在；
其中检测所述产气微生物的存在包括目测检测菌落以及检测靠近所述菌落的一个或多个气泡的存在。
2.权利要求1的方法，还包括提供自动检测系统的步骤，其中检测所述产气微生物的存在包括用所述自动检测系统检测所述产气微生物。
3.权利要求1或2的方法，其中经目测检测所述气泡。
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