KR20120039629A - 산-생성 박테리아의 검출 - Google Patents

산-생성 박테리아의 검출 Download PDF

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KR20120039629A
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로버트 에프 영
패트릭 에이 마크
마이클 이 휴즈
크리스틴 에이 빈스펠드
제이슨 더블유 비요크
마라 에스 리프-웨너
헨리 제이 루브란트
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쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니
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Abstract

본 발명은 샘플 중 산-생성 박테리아의 검출에 유용한 배양 기구 및 방법을 제공한다. 본 기구는 락트산 박테리아와 같은 산-생성 미생물을 검출 및 감별하기 위한 pH 지시제 및 영양 배지를 포함한다. 사용 방법은 산-생성 미생물의 검출 또는 계수를 포함한다. 본 방법은 가스-생성 산-생성 박테리아의 검출을 추가로 제공한다.

Description

산-생성 박테리아의 검출{DETECTION OF ACID-PRODUCING BACTERIA}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2009년 6월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/187,107호 및 2010년 3월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/314,140호의 이득을 주장하며, 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
산-생성 박테리아는 공통적인 대사적 및 생리학적 특징을 공유하는 그람(Gram) 양성 미생물의 상대적으로 다양한 군을 포함한다. 이 박테리아 군은 탄수화물 발효의 주요 최종 생성물로서 산을 생성한다. 이 군은 2가지 대사적 하위군, 즉 본질적으로 탄수화물을 산으로 전환시키는 호모락틱 발효체, 및 산을 생성하는 것에 더하여 탄수화물을 예를 들어 에탄올 및 이산화탄소를 포함하는 다른 대사산물로도 전환시키는 헤테로락틱 발효체로 나뉜다.
일부 산-생성 박테리아, 예를 들어 락트산-생성 박테리아(lactic acid-producing bacteria, LAB)는 발효 식품의 생성에 있어서 유익한 역할을 하지만, 상기 박테리아는 특히 진공 포장된 육류, 육제품 및 맥주에 있어서 식품 및 음료 부패의 주요 에이전트(agent)로도 공지되어 있다. 소정의 식품 제품에 있어서의 산-생성 박테리아의 대사 활성은 식품 또는 음료의 관능적 특성(예를 들어, 냄새, 맛)을 유의하게 열화시킬 수 있다.
전형적으로 전통적인 미생물학적 기술이 LAB와 같은 산-생성 박테리아의 동정 및/또는 계수에 사용된다. 한천 및 브로쓰(broth) 배양 배지(예를 들어, MRS 및 APT 배지)는 산-생성 박테리아의 성장을 촉진하고/하거나 그를 동정하기 위하여 사용된다. 배양물은 LAB와 같은 산-생성 박테리아의 성장을 개선시키기 위하여 미호기성 환경에서 인큐베이션된다. 전형적인 방법은 선발용 한천 플레이트 상에서의 추정 산-생성 박테리아 콜로니의 성장 및 단리, 이어서 브로쓰 배지 함유 발효 튜브에서 이차배양하여 헤테로락틱 발효 종에 의한 가스 생성을 검출하는 것을 포함한다. 이들 방법은 산-생성 박테리아의 검출 또는 동정에 최대 4일이 걸릴 수 있다. 일부의 경우, 상기 방법은 산-생성 박테리아의 동정에 7-10일이 걸릴 수 있다.
샘플 중 LAB와 같은 산-생성 박테리아의 검출을 위한 간단한 용품 및 방법에 대한 필요성이 존재한다.
전형적으로 특수 배양 배지, 긴 인큐베이션 기간, 특수 인큐베이션 조건 및/또는 이차배양 절차를 필요로 하는, 산-생성 박테리아를 검출 및/또는 동정하는 현재의 일반적인 방법을 고려하여, 본 발명은 산-생성 박테리아를 검출 및/또는 동정하는 간단한 용품 및 방법을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 산-생성 박테리아의 감별을 제공한다. 부가적으로, 또는 대안적으로, 일부 실시 형태는 산-생성 박테리아의 계수를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 산-생성 박테리아의 자동 검출 및/또는 계수를 제공한다.
따라서, 일 태양에서 본 발명은 산 박테리아의 검출 방법을 제공한다. 산-생성 박테리아의 검출 방법은 박막 배양 기구, 산 박테리아의 성장을 지지하는 배양 배지, pH 7.0 미만으로 연장하는 전이 범위를 갖는 pH 지시제, 산-생성 박테리아에 의해 발효될 수 있는 탄수화물 및 샘플을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 박막 배양 기구는 냉수 용해성 겔화제를 포함할 수 있다. 본 방법은 배양 기구에서 소정 부피의 샘플, 배양 배지, pH 지시제 및 발효가능한 탄수화물을 조합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 7 미만의 pH에서 소정 기간 동안 배양 기구를 인큐베이션하는 단계 및 산-생성 미생물의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 태양에서, 냉수 용해성 겔화제, 산-생성 박테리아의 성장을 지지하는 배양 배지, pH 7.0 미만으로 연장하는 전이 범위를 갖는 pH 지시제, 산-생성 박테리아에 의해 발효될 수 있는 탄수화물, 및 산-생성 박테리아를 함유할 것으로 의심되는 샘플을 포함하는 박막 배양 기구를 제공하는 단계를 포함하는, 산-생성 박테리아를 검출하는 방법이 제공된다. 본 방법은 소정 부피의 샘플과 배양 배지를 조합하여 제1 혼합물을 형성하는 단계; 배양 기구에서 제1 혼합물, pH 지시제 및 발효가능한 탄수화물을 조합하는 단계; 배양 기구를 소정 기간 동안 인큐베이션하는 단계; 및 미생물의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 배양 기구는 배양 배지 및/또는 pH 지시제를 포함할 수 있다. 본 방법의 일부 실시 형태에서, 배양 기구는 선발제를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법의 일부 실시 형태에서, 배양 기구의 인큐베이션은 상기 기구를 호기적으로 및/또는 혐기적으로 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다.
상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 미생물의 존재를 탐지하는 단계는 미생물을 감별하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 미생물을 감별하는 것은 pH 지시제 반응을 탐지하거나 미생물과 결부된 가스 버블을 탐지하는 것을 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 본 방법은 샘플을 화학적 살균제를 중화시킬 수 있는 희석제와 조합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서 배양 배지의 pH는 6.5 미만의 pH로 조정될 수 있으며, 여기서 미생물의 존재 또는 부재의 탐지는 산-생성 미생물의 존재 또는 부재의 탐지를 포함한다.
상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 본 방법은 항진균제를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, pH 지시제는 예를 들어 클로로페놀 레드, 브롬크레졸 퍼플, 브롬페놀 블루 및 브롬크레졸 그린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 본 방법은 미생물을 계수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 본 방법은 이미지 형성 시스템을 제공하는 단계 및 배양 기구의 이미지를 획득하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 미생물의 존재 또는 부재의 탐지는 배양 기구의 이미지의 디스플레이, 인쇄 또는 분석을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 이미지 분석 시스템을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 이미지의 분석은 이미지를 이미지 분석 시스템으로 분석하는 것을 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 박막 배양 기구를 제공한다. 배양 기구는 상부 표면 및 하부 표면을 갖는 자기 지지형 방수 기재를 포함하는 몸체 부재를 포함할 수 있다. 배양 기구는 기재의 상부 표면 상에 건조 코팅을 추가로 포함할 수 있다. 건조 코팅은 산-생성 박테리아의 성장을 지지하는 배양 배지; 냉수 용해성 겔화제; pH 7.0 미만으로 연장하는 전이 범위를 갖는 pH 지시제; 및 선택적으로 항진균제를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 배양 기구는 커버 시트를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 커버 시트는 냉수 용해성 겔화제 및/또는 지시제를 포함하는 코팅을 추가로 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 본 기구는 산-생성 박테리아에 의해 발효될 수 있는 탄수화물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, pH 지시제는 예를 들어 클로로페놀 레드, 브롬크레졸 퍼플, 브롬페놀 블루 및 브롬크레졸 그린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 배양 배지는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트 또는 아세트산나트륨을 포함할 수 있다. 배양 기구의 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 배양 배지의 pH는 6.5 미만의 pH로 조정될 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 키트를 제공한다. 본 키트는 냉수 용해성 겔화제, 산-생성 박테리아의 성장을 지지하는 배양 배지, 산-생성 박테리아에 의해 발효될 수 있는 탄수화물 및 pH 지시제를 포함하는 박막 배양 기구를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 키트의 배양 배지는 항진균제를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 키트의 배양 배지는 pH 지시제 또는 산-생성 박테리아에 의해 발효될 수 있는 탄수화물을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 키트의 배양 기구는 배양 배지, 산-생성 박테리아에 의해 발효될 수 있는 탄수화물, pH 지시제 또는 전술한 것 중 임의의 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 하나에서, 키트는 샘플 희석제, 완충제, 샘플 획득 기구 및 피펫으로 이루어진 군으로부터 선택되는 샘플 준비 액세서리(accessory)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트 실시 형태 중 임의의 것에서, 배양 배지의 pH는 6.5 미만의 pH로 조정될 수 있다.
단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 소정의 환경 하에서 소정의 이득을 제공할 수 있는 본 발명의 실시 형태를 말한다. 그러나, 동일한 또는 다른 상황 하에서 다른 실시 형태가 또한 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 실시 형태의 설명은 다른 실시 형태가 유용하지 않다는 것을 의미하지 않으며, 본 발명의 범주로부터 다른 실시 형태를 배제하고자 하는 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형 용어("a," "an," "the"), "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 서로 바꾸어서 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 미생물을 함유할 것으로 의심되는 샘플은 샘플이 "하나 이상의" 미생물을 포함할 수 있음을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
"및/또는"이라는 용어는 열거된 요소 중 하나 또는 전부, 또는 열거된 요소의 임의의 둘 이상의 조합을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 종점(endpoint)에 의한 수치 범위의 설명은 그 범위 이내에 포함된 모든 수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함함).
상기 발명의 내용은 본 발명의 각각의 개시된 실시 형태 또는 모든 구현예를 설명하도록 의도된 것은 아니다. 이하의 기재는 더 구체적으로 예시적인 실시 형태를 예시한다. 본 출원 전체에 걸쳐 여러 곳에서, 예들의 목록을 통하여 지침이 제공되며, 상기 예들은 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 각각의 경우에, 열거된 목록은 단지 대표적인 그룹으로서의 역할을 하며, 배타적인 목록으로 해석되어서는 안 된다.
아래에 열거된 도면을 참조하여 본 발명이 추가로 설명될 것이며, 유사한 구성은 여러 도면에 걸쳐 유사한 도면 부호로 참조된다.
도 1은 박막 배양 기구의 일 실시 형태의, 일 부분이 단면인 상부 사시도.
도 2는 격자 패턴을 포함하는 자기 지지형 기재의 일 실시 형태의 평면도.
도 3은 박막 배양 기구의 일 실시 형태의, 일 부분이 단면인 상부 사시도.
도 4는 스페이서 및 포착 요소(capture element)를 포함하는 박막 배양 기구의 일 실시 형태의, 일 부분이 단면인 상부 사시도.
도 5는 본 발명에 따른 검출 시스템의 일 실시 형태의 블록 다이어그램.
도 6은 녹색광 발광 다이오드로 조명된 페트리필름(PETRIFILM) 플레이트의 성장 영역의 흑백 이미지.
본 발명의 임의의 실시 형태를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 그의 응용에 있어서 하기의 설명에 개시된 또는 첨부된 도면에 예시된 구성요소들의 구성 및 배열의 상세 사항에 한정되지 않음을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시 형태가 가능할 수 있으며, 다양한 방법으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 어법 및 용어법은 설명을 목적으로 하는 것으로서, 제한적인 것으로 간주되어서는 안됨을 이해해야 한다. 본 명세서에서 "포함하는", "함유하는", "함유하고 있는", 또는 "갖는" 및 그 변형의 사용은 이후에 열거된 항목 및 그의 등가물과, 추가의 항목을 포함하고자 한다. 달리 명시되거나 제한되지 않으면, "지지된" 및 "커플링된"이라는 용어 및 그 변형이 널리 사용되며, 직접과 간접 둘 모두의 지지 및 커플링을 포괄한다. 다른 실시 형태가 이용될 수 있으며, 구조적 또는 논리적 변화가 본 발명의 범주로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다. 더욱이, "전방", "후방", "상부", "기저부" 등과 같은 용어는, 단지 요소들이 서로 관련될 때 요소들을 설명하기 위해 사용되지만, 결코 장치의 특정 배향을 말하거나, 필요한 또는 요구되는 장치의 배향을 암시 또는 나타내거나, 본 명세서에 설명된 본 발명이 사용 중에 어떻게 사용, 장착, 디스플레이 또는 배치될 것인지를 명시함을 의미하지 않는다.
일반적으로 본 발명은 샘플 중 산-생성 박테리아의 검출 및 구별을 위한 방법 및 용품에 관한 것이다. 통성 혐기성 생물로 기재된 산-생성 박테리아는 흔히 산소가 제거되는(예를 들어, 촉매에 의해 제거되는) 환경(예를 들어, 챔버)에서 배양된다. 본 발명의 방법은 산소-함유 및/또는 저 pH 환경에서 산-생성 박테리아의 성장, 검출 및 감별을 제공한다. 본 발명에서 개시된 방법은 혐기성 또는 호기성 환경에서 사용되어 특수 인큐베이션 장비에 대한 필요성을 잠재적으로 없앨 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 방법은 개개의 콜로니로부터의 이산화탄소 가스의 생성을 탐지하고, 그에 따라 순수 배양물의 단리에 필요한 추가의 인큐베이션 시간 및 가스 생성을 탐지하기 위한 발효 튜브의 사용을 없앰으로써 산-생성 박테리아의 감별을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 샘플 중 산-생성 박테리아의 계수에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 산-생성 박테리아의 검출은 이미지 형성 시스템을 사용한 자동 검출을 포함한다.
적합한 샘플은 다양한 공급원으로부터 얻어지거나 그로부터 유래될 수 있다. 용어 "공급원"은 일반적으로 미생물에 대하여 검사하기를 원하는 식품 또는 비식품을 말하기 위하여 사용된다. 공급원은 고형물, 액체, 반고형물, 젤라틴성 물질, 가스(예를 들어, 공기) 및 그의 조합일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 공급원은 예를 들어 관심있는 표면으로부터 또는 공기로부터 공급원을 수집하기 위하여 사용된 포착 요소에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 액체 조성물은 포착 요소를 포함할 수 있으며, 상기 포착 요소는 관심있는 임의의 미생물 및 공급원의 회수를 향상시키기 위하여(예를 들어, 교반 또는 용해 과정 동안) 추가로 파쇄될 수 있다. 관심있는 표면은 (문을 포함하는) 벽, 바닥, 천장, 배수구, 냉동 시스템, 덕트(예를 들어, 통풍관), 통기구, 변좌, 핸들, 문 손잡이, 핸드레일(handrail), 조리대, 테이블 표면(tabletop), 식사 표면(eating surface)(예를 들어, 트레이, 접시 등), 작업 표면, 장비 표면, 의류 등, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 표면의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 상기 공급원 전부 또는 일부분이 본 방법에서 사용될 수 있다. 공급원의 일부분이 사용될 때, 때로 이것은 공급원의 "샘플"로 지칭될 수 있다. 그러나, 용어 "샘플"은 일반적으로 본 명세서에서 상기 공급원으로부터 얻어지며 미생물의 검출을 위한 검사 기구 내로 도입되는 부피 또는 질량의 물질의 부분을 말하기 위하여 사용된다.
일반적으로 용어 "식품"은 고형물, 액체(예를 들어, 용액, 분산물, 유화물, 현탁물 등 및 그의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않음) 및/또는 반고형 식용 조성물을 말하기 위하여 사용된다. 식품의 예에는 육류, 가금류, 난류, 생선, 해산물, 야채류, 과일류, 조리 식품(예를 들어, 수프, 소스, 페이스트), 곡물 제품(예를 들어, 곡분, 시리얼, 빵), 통조림, 밀크, 기타 유제품(예를 들어, 치즈, 요구르트, 사워 크림(sour cream)), 지방, 오일, 디저트, 양념류, 향신료, 파스타, 음료, 물, 맥주, 동물 사료, 기타 적합한 식용 물질 및 그의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
"샘플 획득 기구"는 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 액체, 반고형물, 또는 고형 샘플 물질을 수집하기 위하여 사용되는 도구를 말한다. 샘플 획득 기구의 비제한적인 예에는 면봉(swab), 와이프(wipe), 스펀지, 스쿠프(scoop), 스패튤라, 압설자, 필터, 피펫, 피펫 팁 및 사이펀 호스가 포함된다.
용어 "감염 매개물"은 일반적으로 전염성 유기체를 운반하고/하거나 그를 옮길 수 있는 무생물 물체 또는 기재를 말하기 위하여 사용된다. 감염 매개물은 천, 몹 헤드(mop head), 수건, 스펀지, 와이프 식기, 동전, 지폐, 핸드폰, (신발류를 포함하는) 의류, 문 손잡이 등, 그 일부, 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
일반적으로 용어 "산-생성 박테리아"는 탄수화물 발효의 주요한 대사적 최종 생성물로서 산을 생성하는 것을 특징으로 하는 임의의 원핵 미생물을 말하기 위하여 사용된다. 산-생성 박테리아의 예에는 아세토박터(Acetobacter) 및 LAB가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 가장 일반적인 산-생성 박테리아는 락트산-생성 박테리아를 포함한다.
일반적으로 용어 "락트산-생성 박테리아" 또는 "LAB"는 탄수화물 발효의 주요한 대사적 최종 생성물로서 락트산을 생성하는 것을 특징으로 하는 임의의 원핵 미생물을 말하기 위하여 사용된다. 락트산 박테리아의 예에는 하기 속 - 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 락토코커스(Lactococcus), 에어로코커스(Aerococcus), 카르노박테리움(Carnobacterium), 오에노코커스(Oenococcus), 스포로락토바실러스(Sporolactobacillus), 테라게노코커스(Teragenococcus), 바고코커스(Vagococcus) 및 바이셀라(Weisella)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 락트산 박테리아는 소정의 병원성 박테리아, 예를 들어 반코마이신 내성 엔테로코커스, 레우코노스톡(Leuconostoc) 속의 소정의 종 및 스트렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes)를 포함한다.
산-생성 박테리아의 성장에 영향을 줄 수 있는 환경 인자는 영양소, pH, 수분 함량, 산화-환원 전위, 항미생물 화합물, 온도, 대기중 가스 조성 및 생물학적 구조 또는 장벽의 존재 또는 부재를 포함할 수 있다.
배양 기구:
소정 실시 형태에서 본 발명은 산-생성 박테리아, 예를 들어 락트산-생성 박테리아의 검출을 위한 배양 기구를 포함한다. 본 발명의 배양 기구는 예를 들어 박막 배양 플레이트 기구를 포함한다. 박막 배양 플레이트 기구는 전형적으로 전통적인 한천 페트리 디쉬(petri dish)보다 더 콤팩트하며, 전형적으로 건조, 재수화성 배양 배지를 포함하여 소정의 미생물의 성장을 지지한다. 박막 배양 플레이트 기구의 비제한적 예에는 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제4,565,783호; 미국 특허 제5,089,413호 및 미국 특허 제5,681,712호에 개시된 코팅-기재 기구가 포함된다.
도 1에는 본 발명에 따른 박막 배양 기구의 일 실시 형태가 도시되어 있다. 배양 기구(110)는 상부 표면 및 하부 표면(112a, 112b)을 갖는 자기 지지형 방수 기재(112)를 포함하는 몸체 부재를 포함한다. 기재(112)는 상대적으로 강성인 필름(예를 들어, 폴리에스테르, 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌)일 수 있으며, 상기 필름은 물을 흡수하지 않거나 달리 물에 의해 영향을 받지 않을 것이다. 기재(112)는 박테리아 콜로니를 기재를 통하여 관찰하기를 원하는지에 따라 투명하거나 불투명할 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이 박테리아 콜로니의 카운팅을 용이하게 하기 위하여 기재(212) 위에 격자 패턴(예를 들어, 정사각형)이 인쇄될 수 있다.
도 1을 참조하면, 기재(112)는 접착제(114) 층으로 그의 상부 표면(112a)이 코팅될 수 있으며, 상기 접착제 층은 용이한 수화를 위하여 균일한 단층(116) 내에 건조 겔화제, pH 지시제, 탄수화물, 선택적 항진균제, 기타 지시제, 및/또는 기타 영양소를 고정하는 역할을 한다. 접착제(114)는 바람직하게는 분말형 겔화제 및/또는 영양소의 입자의 직경보다 작은 두께로 기재(112) 상에 코팅되어야 한다. 그 목적은 상기 입자를 기재에 점착시키기에 충분하지만 입자를 접착제 중에 완전히 매립되게 할만큼 많은 것은 아닌 접착제를 도포하는 것이다. 냉수 용해성 분말의 균일한 단층(116)이 수화를 위해 노출되는 충분한 표면 영역에서 요망된다. 커버 시트(122) 상의 선택적 접착제(114') 및 냉수 용해성 분말(116') 층이 도 1에 또한 도시되어 있다. 수성 용액(예를 들어, 샘플 및/또는 수성 현탁 매질, 예컨대 물 또는 완충제)으로 수화될 때, 겔화제는 하이드로겔을 형성한다.
일부 실시 형태에서, 접착제(114, 114')는 수성 접착제 조성물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 수성 접착제(114, 114')의 층은 수성 시험 샘플로 습윤될 때 미생물의 콜로니를 관찰을 가능하게 하기에 충분히 투명하다. 수성 접착제 조성물은 하나 이상의 친수성 제제(hydrophilic agent)를 포함할 수 있으며, 이는 영양제, 선발제, 지시제(예를 들어, pH 지시제) 또는 그 조합을 포함한다.
수성 접착제 조성물에서 사용되는 특정 영양소 및/또는 선발제는 본 발명의 명세서를 고려하면 당업자에게 명백할 것이며, 성장시키고/시키거나 선택적으로 검출하거나 또는 억제할 특정 산-생성 박테리아에 대하여 최적화될 수 있다. 예를 들어, 소정의 선발제(예를 들어, 반코마이신과 같은 항생제)를 조성물에 첨가하여 상응하는 항생제 내성 미생물에 대하여 선발할 수 있다. 부가적으로, 선발제의 농도를 조정하여 소정 내성 수준에 대하여 선발할 수 있으며, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다.
발효 식품 및 음료에 유용한 바람직한 실시 형태에서, 선발제는 항진균제를 포함한다. 유용한 항진균제는 사이클로헥시미드(Cycloheximide), 니스타틴(Nystatin) 및 나타마이신(Natamycin) (피마리신으로도 공지됨)을 포함한다. 다른 유용한 항진균제는 암포테리신(Amphotericin) B 및 필리핀(Filipin)일 수 있다.
산-생성 박테리아 배양용 영양 배지는 당업계에 공지되어 있다. 그러한 배지의 비제한적 예에는 MRS 배지, APT 배지, 트립톤 글루코스, 육즙(beef extract) 배지, 트립톤 글루코스 효모 추출물 배지, 토마토즙 한천 및 캉-풍(Kang-Fung) 배지가 포함된다. 이들 및 기타 영양 배지가 본 발명의 기구 및 방법에서 사용하기에 적합하되, 단, 영양 배지의 성분들은 미생물에 의한 산 생성으로 인한 pH 지시제의 변화의 (시각적 또는 자동) 탐지를 방해하지 않는다. 적합한 영양 배지는 제조 후 그의 각각의 pH에 따라 변하는 배지를 포함한다. 예를 들어, 트립톤 글루코스 육즙 배지의 pH는 약 7.0 ± 0.2일 수 있으며, APT 배지의 pH는 약 6.7 ± 0.2일 수 있고, MRS 배지의 pH는 약 6.5 ± 0.2일 수 있으며, 토마토즙 한천의 pH는 약 6.1 ± 0.2일 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 영양 배지의 pH는 더 낮은 pH로 조정될 수 있다. 예를 들어, 양조 산업에서 pH가 약 6.8 미만, 그리고 약 3.5+/-0.2 초과인 영양 배지를 갖는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 맥주 중 산-생성 박테리아, 특히 LAB의 검출을 위한 MRS 영양 배지의 pH는 5.8+/- 0.2일 수 있다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 영양 배지의 pH는 6.5+/-0.2일 수 있다.
본 발명의 기구 및 방법에서 사용하기에 적합한 지시제는 pH 7.0 미만으로 연장하는 전이 범위를 갖는 pH 지시제를 포함한다. 적합한 pH 지시제의 비제한적 예에는 접종된 배양 배지의 pH 미만으로 연장하는 전이 pH 범위를 갖는 할로크로믹(halochromic) 화합물이 포함된다. 적합한 pH 지시제는 성장 중인 산-생성 박테리아 콜로니 내에서의 또는 그에 인접한 pH 지시제의 변화를 (시각적으로 및/또는 이미지 형성 시스템의 사용에 의해) 탐지하기 위하여 접종 배지의 pH보다 월등하게 충분히 낮게 연장하는 전이 pH 범위를 가질 것이다. 바람직하게는, pH 지시제는 접종된 배양 배지의 pH보다 0.25 pH 단위 이상 더 낮은, 낮은 종점을 갖는 전이 pH 범위를 가질 것이다. 더 바람직하게는, pH 지시제는 접종된 배양 배지의 pH보다 0.5 pH 단위 이상 더 낮은, 낮은 종점을 갖는 전이 pH 범위를 가질 것이다. 더욱 더 바람직하게는, pH 지시제는 접종된 배양 배지의 pH보다 1.0 pH 단위 이상 더 낮게 연장하는 전이 pH 범위를 가질 것이다. 가장 바람직하게는, pH 지시제는 약 3.5인 낮은 종점을 갖는 전이 pH 범위를 가질 것이다. 적합한 pH 지시제의 비제한적 예에는 브롬크레졸 퍼플, 브롬페놀 블루, 클로로페놀 레드 및 브롬크레졸 그린이 포함된다.
지시제의 예시적인 유용한 부류는 성장 중인 미생물에 의해 대사되거나 또는 달리 상기 미생물과 반응하고 그렇게 함에 있어서 기술자에 의한 또는 자동 판독기에 의한 정량화 및/또는 검출의 용이함을 위하여 미생물 콜로니가 착색되게 하거나 또는 형광 발광 되게 하는 염료를 포함한다. 그러한 염료의 비제한적 예에는 트라이페닐테트라졸륨 클로라이드, p-톨릴테트라졸륨 레드, 테트라졸륨 바이올렛, 베라트릴 테트라졸륨 블루, 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 다이소듐 염이 포함된다. 그러나, 다른 적합한 염료가 동정할 특정 유기체(들)에 따라 사용될 수 있음이 인식될 것이다. 당업자라면, 본 발명에 따라 사용되는 임의의 지시제, 염료, 선발제, 효소 기질 또는 영양소는 본 명세서에 기재된 pH 지시제의 관찰 및/또는 이미지 형성을 사실상 방해하지 않아야 함을 인식할 것이다.
일부 실시 형태에서 염산 또는 수산화나트륨과 같은 pH 조정제는 배지 또는 준비된 샘플 중 어느 하나의 pH를 조정하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 완충 시약, 예를 들어 탄산나트륨을 이용하여 중성 pH를 나타내는 매질을 제공할 수 있으며, "캅-오-실(Cab-O-Sil) M-5"를 프로세싱 조제(processing aid)로서 이용할 수 있고, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제4,565,783호에 기재된 바와 같다. 물론, 분말(116)에 사용되는 특정 코팅 혼합물(예를 들어, 영양소, 지시제 및/또는 겔화제)은 성장시킬 미생물의 유형에 따라 조정될 수 있다.
본 발명의 용품은 감별 지시제를 포함할 수 있음이 고려된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "감별 지시제"는 소정 미생물의 존재는 지시하지만 다른 미생물의 존재는 지시하지 않는, 당해 매질에 첨가되는 시약을 말한다. 감별 지시제의 비제한적 예에는 소정 미생물에 의해 대사될 때 탐지가능한 반응(예를 들어, 콜로니 내의 색 또는 그와 인접한 색을 변화시키는 pH 지시제)을 생성하는 염료(예를 들어, 착색제, pH 지시제, 산화환원 지시제), 효소 기질(예를 들어, 포스파타아제, 글리코시다아제, 펩티다아제, 뉴클레아제, 리파아제 등의 발색 또는 형광발생 기질), 및 특정 영양소(예를 들어, 발효가능한 탄수화물, 아미노산)가 포함된다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 감별 지시제는 기재 상에 코팅되는 수-기반의 조성물 형태로 박막 배양 기구에 첨가될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 감별 지시제는 배양 기구에 첨가되는 액체 샘플에 첨가될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 감별 지시제는 배양 기구의 수화 후에 배양 기구에 첨가될 수 있다. 수화 후 배양 기구에 첨가되는 감별 지시제의 사용을 포함하는 방법의 일례로는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,022,682호에 기재된 바와 같이 서모뉴클레아제의 탐지를 위한 용품을 인큐베이션 후에 배양 기구에 첨가하는 방법이 있다.
분말(116)이 미생물 동정을 위한 소정의 생화학적 시험의 수행에 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있음이 본 발명의 범주 내에서 또한 고려된다. 특정한 유형의 미생물의 존재 하에 변색되는 그러한 시약(예를 들어, 효소 기질)이 분말(116) 또는 접착제(114)에 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 분말(116)은 용액 중에 용해 또는 현탁되고, 기재(112) 상에 코팅되어 건조된, 겔화제와 영양소, 선발제 및/또는 지시제(예를 들어, 산화환원 지시제, pH 지시제, 효소 기질)의 혼합물을 포함하는 코팅을 포함할 수 있다. 이 실시 형태에서, 코팅에는 사실상 수분이 없다(즉, 코팅은 일단 이것이 주위 환경과 평형을 이루도록 용인되었으면 탈수된 코팅의 대략적인 수분 함량 이하의 수분 함량을 갖는다).
본 발명의 다른 바람직한 실시 형태에서, 분말(116)은 용액 중에 용해 또는 현탁되고, 기재(112) 상에 코팅되어 건조된, 건조 겔화제, pH 지시제, 탄수화물, 선택적 항진균제, 다른 지시제 및/또는 다른 영양소의 혼합물을 포함하는 코팅을 포함할 수 있다. 이 실시 형태에서, 코팅에는 사실상 수분이 없다.
도 1에 도시된 바와 같이, 몸체 부재는 기재(112)의 상부 표면에 적용되는 스페이서(118)를 포함할 수 있으며, 상기 스페이서(118)는 기재(112) 상에 분말(116)을 노출시키도록 중심부를 관통하여 절단되는 원형 개구(120)를 포함한다. 개구(120)의 벽은 소정의 크기 및 형상의 웰을 제공하여 수화 후 매질을 국한시킨다. 일반적으로 개구(120)는 배양 기구(110)의 성장 영역의 윤곽을 그린다. 스페이서(118)는 원하는 부피, 예를 들어 1, 2 또는 3 밀리리터의 웰을 형성하기에 충분한 두께를 가져야 한다. 폐쇄 셀 폴리에틸렌 폼(foam) 또는 폴리스티렌 폼이 스페이서(118)에 바람직한 재료이지만, 소수성(비-습윤성)이며 미생물에 대하여 불활성이고 살균을 견딜 수 있는 임의의 재료가 사용될 수 있다. 일부 실시 형태(도시되어 있지 않음)에서, 스페이서(118)는 복수의 개구(20)(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 또는 20개의 개구)를 포함할 수 있으며, 이들 각각에는 별개의 액체 샘플이 접종될 수 있다.
스페이서(118)는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,681,712호에 기재된 것과 같은 상대적으로 두꺼운 디자인을 포함할 수 있다. 상기 더 두꺼운, 개구가 있는 스페이서(118)의 한 가지 목적은 스페이서(118)의 개구(120)에 배치되는 막(예를 들어 미공성 필터 멤브레인) (도시되어 있지 않음)을 위치시키고 보호하는 것이다. 상기 더 두꺼운 스페이서(118)의 다른 목적은 커버 시트(122)가 성장 중인 미생물 콜로니와 접촉하는 것을 감소 또는 방지하는 것이다(즉, 성장 표면과 커버 시트(122) 사이에 "상부 공간" - 이는 성장 중인 미생물 콜로니에게 증가된 통기를 또한 제공할 수 있음 - 을 제공하는 것이다).
스페이서(118)의 두께는 배양 기구에 접종할 때 배양 기구에 첨가되는 액체의 부피를 봉입하기에 충분하여야 한다. 사용될 때 당해 막의 두께에 따라 스페이서는 적어도 두께가 약 0.5 ㎜, 두께가 약 1 ㎜, 두께가 약 1.5 ㎜, 그리고 두께가 약 2 ㎜일 수 있다.
도 3에는 박막 배양 기구(310)의 다른 실시 형태가 도시되어 있다. 이 실시 형태는 기재(312), 접착제(314), 냉수 용해성 분말(316), 및 커버 시트(322)를 포함하며, 이는 도 1에 개시된 바와 같다. 일부 실시 형태에서, pH 지시제가 냉수 용해성 분말(316)에 포함될 수 있다.
도 1의 배양 기구(110)와는 대조적으로, 도 3의 기구(310)는 접종 동안 샘플을 국한시키기 위한 스페이서를 포함하지 않는다. 템플릿(template), 예를 들어 (도시되지 않은) 무게가 있는 링(weighted ring)이 커버 시트(322)의 외부에 일시적으로 적용되어, 폐쇄 후 샘플을 특정 영역에 국한시키는 한편 냉수 용해성 분말(316)이 겔을 형성하도록 할 수 있다. 샘플이 접종된 배양 기구(310)의 부분은 일반적으로 기구(310)의 성장 영역의 윤곽을 그린다. 일부 실시 형태에서, 기구(310)에는 별도의 샘플들을 배양 기구(310)의 분말(316)의 별개의 부분들에 국한시키기 위하여 적절한 이격 및 템플릿을 사용하여 복수의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 또는 20가지의) 별개의 액체 샘플을 접종할 수 있다. 수성 용액(예를 들어, 샘플 및/또는 수성 현탁 매질, 예컨대 물 또는 완충제)으로 수화될 때, 겔화제를 포함하는 냉수 용해성 분말은 하이드로겔을 형성한다.
일 실시 형태에서, 박막 배양 플레이트 기구는 예를 들어 미국 특허 제4,565,783호에 기재된 방법에 따라 액체 코팅 혼합물을 생성하고, 액체 코팅 혼합물을 기재 상에 코팅하고, 코팅된 기재를 건조시키고, 선택적으로, 커버 시트를 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 이 실시 형태의 예시적인 기구가 도 4에 도시되어 있다. 박막 배양 기구(410)는 각각 상부 표면 및 하부 표면(412a, 412b)을 갖는 자기 지지형 방수 기재(412)를 갖는 몸체 부재(411)를 포함한다. 기재(412)는 바람직하게는 물을 흡수하지 않는 방수 재료로 만들어진 상대적으로 강성인 재료, 예를 들어 폴리에스테르, 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌이다. 기타 적합한 방수 재료는 방수 폴리에틸렌 코팅을 함유하는 종이와 같은 기재를 포함한다. 상부 표면(412a)은 액체 조성물로 코팅되며, 이어서 이것은 건조되어 기재(412) 상에 건조 코팅(416)을 제공한다. 건조 코팅(416)은 본 명세서에 기재된 바와 같이 냉수 용해성 겔화제를 포함하며, 영양소, 예를 들어 탄수화물, 선발제, 예를 들어 항생제 또는 항곰팡이제, 지시제, pH 지시제 또는 전술한 것 중 임의의 둘 이상의 조합을 또한 포함할 수 있다. 건조 코팅(416)의 생성에 사용되는 액체 조성물은 조성물 중의 본질적으로 모든 수분이 증발될 때까지 오븐에서 약 104℃ (220℉)에서 액체 조성물을 가열함으로써 쉽게 건조시킬 수 있다. 그러나, 물의 증발 후 조성물이 가열될 경우, 조성물의 소정 성분(예를 들어, 영양소, 지시제)이 열화되기 시작할 수 있다. 사용에 있어서, 건조 코팅(416)을 액체(예를 들어, 액체 샘플 및/또는 액체 영양 배지)로 수화시켜 재구성된 액체 조성물을 형성한다. 건조 형태의 영양 배지 또는 배양 배지의 pH를 언급할 때, pH는 탈이온수로 재수화된 후 적용가능한 건조 코팅과 관련하여 측정된다.
접착제(414) 층은 기재(412) 상에 코팅될 수 있다. 접착제는 건조 코팅(416)을 기재(412)에 유지시키는 역할을 할 수 있다. 접착제는 수화될 때 충분히 투명하여서 코팅된 기재(412)의 표면 상에서 성장 중인 박테리아 콜로니의 관찰을 허용하여야 한다. 또한 접착제는 코팅을 접착제 내에 완전히 매립시키지 않고서 기재가 건조 코팅(416)으로 균일하게 코팅되게 하는 두께로 기재(412) 상에 코팅되어야 한다.
일반적으로 원형인 개구(420)를 갖는 스페이서(418)가 건조 코팅(416) 및/또는 기재(412)에 점착된다. 스페이서(418)는 기재(412)의 주변부를 커버하며, 개구(420)는 샘플이 접종될 영역을 규정한다. 스페이서(418)는 기구(410)의 성장 영역을 제한하며, 액체 샘플이 기재(412)로부터 누출되지 않게 하는 역할을 한다. 대안적인 실시 형태에서, 기구(410)는 샘플-함유 스페이서(418)를 포함하지 않을 수도 있다. 이러한 기구 (도시되어 있지 않음)에서, 샘플은 상기에 기재된 무게가 있는 원형 템플릿을 이용하여 접종하는 동안 기재 상에 함유될 수 있으며, 매질 단독의 성분들 (예를 들어, 겔화제)에 의해 접종하는 동안 함유된다.
커버 시트(422)는 폼 스페이서(418)의 상부 표면의 에지에 부착된다. 바람직하게는 커버 시트(422)는 기재 상에 존재하는 박테리아 콜로니의 카운팅을 용이하게 하기 위하여 투명 필름 또는 시트 재료로 만들어진다. 게다가, 바람직하게는 커버 시트(422)는 오염 위험성 및 성분들의 열화를 피하기 위하여 박테리아 및 수증기에 대하여 불투과성이다. 커버 시트(422)로서 사용하기에 바람직한 재료는 이축-배향 폴리프로필렌이다. 선택적으로, 커버 시트(422)는 접착제 층으로 코팅될 수 있으며, 이는 겔화제, 영양소, 선발제, 지시제(예를 들어, pH 지시제) 또는 전술한 것 중 임의의 둘 이상의 조합을 함유하는 건조 조성물(예를 들어, 분말)로 코팅될 수 있다(도시되어 있지 않음).
사용에 있어서, 소정량의 접종물, 전형적으로 약 1 ㎖의 액체 접종물은 커버 시트를 뒤로 잡아당기고 접종물을 건조 코팅(416) 상으로 분배함으로써 도 4에 예시된 기구에 첨가된다. 접종물은 선택적으로 영양소, 선발제, 지시제 또는 전술한 것 중 임의의 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다. 이어서 커버 시트(422)는 코팅(417) 위에 도로 놓여지고, 접종물은 폼 스페이서(418)의 원형 개구 내부에 고르게 산재된다. 이를 행하는 편리한 도구는 무게가 있는 원형 템플릿이다. 접종물이 접촉하여 코팅(417) 상에 산재됨에 따라, 코팅은 수화되어 겔을 형성한다. 겔에 존재하는 영양소는 미생물의 성장을 지지할 수 있다. 이어서 접종된 기구는 소정 시간 동안 인큐베이션되며, 그 후 기재 상에서 성장하는 박테리아 콜로니의 수가 투명 커버 시트(422)를 통하여 관찰 및 카운팅될 수 있다.
포착 요소, 예를 들어 멤브레인 필터가 선택적으로 기구(410)에서 사용될 수 있다. 도 4에는 스페이서(418)의 개구(420) 내에 위치된 멤브레인 필터(426)가 도시되어 있다. 또한, 멤브레인 필터(426) 상에서 성장하는 미생물 콜로니(428)가 도시되어 있다. 적합한 미공성 막은 pH 지시제를 사용한 산의 탐지 또는 산-생성 박테리아에 의한 산의 생성을 사실상 방해하지 않는다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 미공성 막은 재구성된 액체 조성물과 접촉할 때 사실상 투명하다. 멤브레인 필터(426)는 건조 코팅(416)을 재구성하기 위하여 기구(410)에 액체가 첨가되기 전에 기구(410) 내에 위치될 수 있다. 멤브레인 필터(426)는 건조 코팅(416)을 재구성하기 위하여 기구(410)에 액체가 첨가된 후에 기구(410) 내에 위치될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 멤브레인 필터(426)는 필터(426)가 기구(410) 내에 위치될 때 건조 코팅(416)을 재구성하기에 충분한 액체를 포함할 수 있다.
바람직한 코팅 혼합물은, 소정 부피의 샘플로 수화될 때 표 1에 예시된 농도의 배양 배지 성분들을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 배양 기구를 위한 코팅 혼합물은 표 1에 예시된 성분들 중 일부를 포함할 수 있으며, 샘플을 함유하는 액체(예를 들어, 희석제)는 표 1에 예시된 나머지 성분들 중 일부 또는 그 전부를 포함할 수 있다. 따라서, 배양 기구 내의 성분들 및 희석제 내의 성분들의 첨가에 의해 표 1에 예시된 배양 배지를 생성할 수 있다. 일 실시 형태에서, 코팅 혼합물은 상기 성분들 전부를 포함한다.
[표 1]
Figure pct00001
본 발명의 배양 배지는 표적 미생물을 함유할 것으로 의심되는 샘플을 배양 배지에 접종할 때 표적(예를 들어, 락트산-생성) 미생물의 성장을 촉진하기에 일반적으로 적합한 이온, 염 및 영양소를 포함할 수 있다. 배양 배지는 산-생성 박테리아의 배양에 사용된 배지 유래의 성분들을 포함할 수 있다. 예시적인 산-생성 박테리아 성장용 배지에는 MRS 배지, 산성화 MRS 배지, 프룩토스를 포함하는 산성화 MRS 배지, 변형 MRS 배지, HHD 배지, APT 배지, 수크로스를 포함하는 APT 배지, 글루코스를 포함하는 APT 배지, 유니버셜 비어 아가(Universal Beer Agar; UBA), NBB(Nachweis medium fur Bierschadlichen Bakterien), 및 라카-레이(Raka-Ray)가 한정됨이 없이 포함된다.
[표 2]
Figure pct00002
예를 들어 영양소, 염, 이온, 선발제, 지시제 등과 같은 성분들을 함유하는 배양 배지를 공지된 산-생성 박테리아로 검사하여 성분들이 표적 미생물의 성장을 촉진하는 것 및/또는 비-표적 미생물의 성장을 억제하는 것 및/또는 pH 지시제를 이용한 락트산의 검출 또는 산-생성 박테리아에 의한 산의 생성을 방해하지 않는 것을 결정할 수 있다. 또한 배양 배지는 하나 이상의 겔화제를 포함할 수 있다. 본 발명의 배양 배지는 산-생성 박테리아의 성장에 대하여 선발하는 적어도 하나의 선발제를 포함할 수 있다.
선택적으로, 배양 배지는 완충제를 포함할 수 있다. 적합한 완충제는 인산염 완충제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탄산염 완충제는 탄산나트륨 완충제이다. 일부 실시 형태에서, 인산염 완충제는 인산칼륨 완충제이다. 일부 실시 형태에서, 배양 배지는 하나 초과의 완충제(예를 들어, 인산칼륨 및 아세트산나트륨)를 포함할 수 있다. 인산염 완충제는 약 22 mM일 수 있다. 다른 적합한 완충제는 버터필드 완충제(Butterfield's Buffer) 및 펩톤수를 포함한다.
일부 배양에 있어서, 특정 배양 배지에서 사용되는 완충제의 조합이 유리할 수 있다. 예를 들어, 1% 펩톤수 완충액을 포함하는 MRS 배지가 일부 산-생성 박테리아에 유용한 것으로 밝혀졌다.
배양 배지 중 각각의 성분의 농도는 배양 기구에 접종한 후 표적 미생물의 성장 및/또는 검출에 적합한 농도를 제공하도록 선택된다. 배양 배지 중 산-생성 박테리아의 성장에 있어서의 선발제 및 영양소의 적합한 농도는 당업계에 공지되어 있다.
pH 지시제의 적합한 농도는 그의 내인적 특성(예를 들어, 소정 표적 미생물에 대한 그의 잠재적인 억제 특성 및 용해성)에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 클로로페놀 레드는 약 0.25 mM 내지 약 0.75 mM의 농도로 배양 배지에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 클로로페놀 레드는 약 0.5 mM의 농도로 배양 배지에서 사용될 수 있다. 또한 예를 들어 브롬크레졸 퍼플 또는 브롬크레졸 그린은 약 0.5 mM의 농도로 배양 배지에서 사용될 수 있다.
표적 미생물의 선발은 비-표적 미생물의 성장의 억제, 비-표적 미생물의 성장의 촉진, 또는 이들 둘 모두를 포함할 수 있다. 표적 미생물의 성장의 촉진은 적어도 하나의 제1 선발제에 의해 직접적으로(예를 들어, 표적 미생물에 의해서는 사용될 수 있지만 다른 미생물에 의해서는 사용될 수 없는 영양소), 간접적으로(예를 들어, 비-표적 미생물의 억제에 의해 영양소에 대한 경쟁을 감소시킴으로써), 또는 직간접적으로 제공될 수 있다.
표적 미생물의 성장에 대하여 선발하는 임의의 원소, 라디칼, 이온 또는 화합물이 선발제로 사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 산-생성 박테리아에 적합한 선발제는 트윈(Tween) 80, 아질산나트륨, 폴리믹신 B, 및 전술한 것의 둘 이상의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 건조 배양 배지는 하기 방식으로 박막 배양 기구의 하나 이상의 표면에 적용될 수 있다. 배양 배지의 성분들은 용매(예를 들어 물)에 용해될 수 있다. 이어서 생성된 용액은 기구의 하나 이상의 표면 상에 코팅될 수 있다. 이어서 코팅을 건조시켜, 배양 배지 용액으로 코팅된 기구의 표면 상에 건조 배양 배지를 남긴다. 코팅은 공기 건조 및 가열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 방식으로 건조될 수 있다.
건조 배양 배지의 각각의 성분의 양은 적어도 부분적으로 하기 적어도 2가지의 요인에 의해 결정된다: (1) 배양 배지 용액 중 그 성분의 농도, 및 (2) 배양 기구의 주어진 표면 영역 상에 코팅되는 용액의 양(코팅 중량). 적합한 코팅 중량은 약 0.45 mg/㎠ 내지 약 2.5 mg/㎠의 범위일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 배양 배지 영양소는 지시제와는 별도로 코팅될 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 배양 배지 영양소에 있어서의 코팅 중량은 약 1.6 mg/㎠ 내지 약 2.5 mg/㎠의 범위일 수 있다. 일 실시 형태에서, 영양소 코팅의 코팅 중량은 약 2.1 mg/㎠이다. 지시제 코팅의 코팅 중량은 약 0.45 mg/㎠ 내지 약 0.84 mg/㎠의 범위일 수 있다. 일 실시 형태에서, 지시제 코팅의 코팅 중량은 약 0.62 mg/㎠이다.
도 1 내지 도 4에 도시된 실시 형태가 기구에 부착된 커버 시트를 갖지만, 분말 함유 실시 형태는 덮여져 있지 않고 단순히 보관 및 인큐베이션 동안 살균 환경 내에 배치될 수 있음이 본 발명의 범주 내에서 또한 고려된다.
샘플
적합한 시험 샘플은 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 관심있는 샘플은 액체(예를 들어, 음료, 공정 스트림, 물, 맥주), 고형물(예를 들어, 식품 성분, 식물, 육류, 공기, 표면(예를 들어, 바닥, 벽, 기기, 식품 가공 설비) 등을 포함할 수 있다. 또한 샘플은 배양된 세포(예를 들어, 박테리아 배양물, 농축 브로쓰)를 포함할 수 있다.
표면 상의 미생물의 검출을 위한 다양한 샘플링 기술이 공지되어 있다. 그러한 샘플링 기술은 본 발명의 방법에 또한 적합하다. 예를 들어, 식품 가공 설비의 표면을 닦음에 의해 또는 환자의 비공을 닦음에 의해 샘플을 얻는 것이 일반적이다. 특히 바람직한 샘플링 기술은 표면을 살균 면봉, 스펀지 또는 샘플링 기구와 접촉시키는 것(예를 들어, 표면을 살균 면봉, 스펀지 또는 샘플링 기구를 이용하여 스와빙(swabbing), 닦음)을 포함한다.
매우 다양한 면봉 또는 기타 샘플 수집 기구는 예를 들어 미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 쓰리엠 컴퍼니(3M Company)로부터 상표명 쓰리엠™ 퀵 스왑(Quick Swab)으로, 미국 메인주 길포드 소재의 퓨리탄 메디칼 프로덕츠 컴퍼니 엘엘씨(Puritan Medical Products Co. LLC)로부터 상표명 퓨어-랩스(PURE-WRAPS)로 또는 미국 캘리포니아주 코로나 소재의 코판 다이아그노스틱스, 인크.(Copan Diagnostics, Inc.)로부터 상표명 에스왑( ESWAB)으로 또는 이탈리아 브레시아 소재의 마이크로레올로직스, 에스.알.엘(microRheologics, S.r.l.)로부터 상표명 플록트스왑(FLOCKEDSWAB)으로 구매가능하다. 원할 경우 예를 들어 미국 특허 제5,879,635호(네이슨(Nason))에 개시된 것과 같은 샘플 수집 수단이 또한 사용될 수 있다. 면봉은 면, 레이온, 알긴산칼슘, 데이크론(Dacron), 폴리에스테르, 나일론, 폴리우레탄 등을 비롯한 다양한 재료의 것일 수 있다.
이어서 샘플 수집 기구(예를 들어, 면봉)는 적절한 용액을 이용하여(예를 들어 세척에 의해, 와동에 의한 용출에 의해) 직접적으로 배양되거나, 직접적으로 분석되거나 직접적으로 추출될 수 있다. 그러한 추출(즉, 용출) 용액은 전형적으로 물을 포함하며, 완충제 및 적어도 하나의 계면활성제를 선택적으로 포함할 수 있다. 용출 완충제의 예에는 예를 들어 인산염 완충 염수(phosphate buffered saline; PBS)가 포함되며, PBS는 예를 들어 트윈 20 또는 플루로닉(PLURONIC) L64와 조합되어 사용될 수 있다. 시험 샘플(예를 들어, 액체)을 추가 분석 이전에 처리할 수 있다. 이는 농축, 침전, 여과, 원심분리, 투석, 희석, 천연 성분들의 불활성화, 시약의 첨가, 화학적 처리 등을 포함한다.
포착 요소
본 발명의 배양 플레이트 기구는 샘플에 존재하는 산-생성 미생물을 검출하기 위하여 포착 요소와 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "포착 요소"는 샘플에 존재하는 미생물을 포착 및 보유하기 위하여 사용되는 용품을 말한다. 일부 실시 형태에서, 포착 요소는 본 명세서에 개시된 박막 배양 플레이트 기구와 일시적으로 접촉될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 표면 필터의 한 면 상에 포착될 수 있으며, 필터의 상기 면은 박막 배양 플레이트 기구의 성장 영역과 접촉할 수 있고, 그에 의해 배양 플레이트 기구의 수화 후 샘플 물질이 성장 영역에 전달될 수 있다. 이어서 표면 필터는 기구의 인큐베이션 이전에 기구로부터 제거될 수 있다. 포착 요소(예를 들어, 멤브레인 필터)는 이것이 본 발명의 박막 배양 플레이트 기구 내에 배치되도록 크기가 정해질 수 있으며, 소정의 바람직한 실시 형태에서 포착 요소는 표적 미생물의 적어도 하나의 세포의 분열을 허용하기에 충분한 기간 동안 인큐베이션 기간 중에 박막 배양 플레이트 기구 내에 남아 있다. 본 배양 플레이트 기구 내로의 포착 요소의 배치는 포착 요소가 배양 플레이트 기구 내의 겔화제 및/또는 영양 배지 - 존재할 경우 - 와 접촉되게 하여 미생물이 성장 및/또는 증식할 수 있게 한다. 일부 실시 형태에서, 배양 플레이트 기구는 포착 요소가 배양 플레이트 기구 내에 배치되기 전에 수화된다 (예를 들어, 살균 액체 또는 미지의 액체 샘플이 접종된다). 일부 실시 형태에서, 배양 플레이트 기구는 포착 요소가 배양 플레이트 기구 내에 배치된 후 수화된다.
포착 요소는 소정 유형의 샘플에서의 그의 적합성에 대하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 액체 샘플에 존재하는 미생물의 보유를 위하여 미공성 멤브레인 필터가 포착 요소로서 사용될 수 있다. 액체 샘플이 필터에 통과될 수 있고 미생물이 그 위에 보유될 수 있다. 미생물은 예를 들어 물리적 포획 또는 특이적(예를 들어 항원-항체 또는 수용체-리간드 상호작용) 또는 비특이적 (소수성 흡착) 화학적 상호작용에 의해 보유될 수 있다. 본 발명의 미공성 막은 박막 배양 플레이트 기구에 존재할 때 용혈 반응의 관찰을 가능케 해야 한다. 바람직한 미공성 멤브레인 필터는 습윤될 때 사실상 투명해진다.
도 4에 도시된 실시 형태를 참조하면, 시험 샘플은 액체 접종물 및/또는 포착 요소(426), 예를 들어 미공성 필터(예를 들어 필터 멤브레인) 또는 와이프(wipe) 기구를 포함할 수 있다. 포착 요소(426)는 다양한 막 및/또는 필름으로부터 제작될 수 있으며, 이를 이용하여 미생물을 포착할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 포착 요소(426)는 본 발명의 방법 및 기구에 의해 미생물의 콜로니를 성장시키고/시키거나, 검출하고/하거나 계수할 수 있는 표면을 제공할 수 있다. 작은 미생물 집단, 예를 들어 박테리아를 큰 유체 샘플로부터 분리하기 위하여 일반적으로 사용되었던 공지된 미공성 필터가 특히 적합하다. 그러한 필터는 한천 배지의 표면 상에 배치되며 여과된 미생물의 카운팅 및 평가를 허용하도록 인큐베이션되는 것으로 공지되어 있다. 적합한 필터는 밀리포어 코포레이션(Millipore Corp; 미국 매사추세츠주 말보로 소재)으로부터 입수가능한 HAWG 시리즈, 예를 들어 HAWG 047S6 타입 HA 필터를 포함한다. 본 명세서에 기재된 미생물 필터는 일반적으로 상대적으로 얇으며, 임의의 원하는 2차원 형상으로, 예를 들어 직사각형, 디스크 (부분 디스크를 포함함) 등으로 제공될 수 있다.
미생물은 막 내의 기공의 크기에 따라 다양한 효율로 그러한 필터에 의해 분리된다. 전형적으로 박테리아는 평균 기공 직경이 약 1㎛ 미만, 약 0.8 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 0.45 ㎛ 미만, 더 바람직하게는 약 0.2㎛ 이하인 필터에 의해 포착된다. 여과는 적합한 크기의 깔때기 및 디스크를 사용하여 중력 또는 진공-보조된 방법을 이용하여 통상적인 방법에 의해 수행한다. 멤브레인 필터는 바람직하게는 핀셋으로 무균적으로 취급된다. 멤브레인 필터는 구매가능한 재료로부터 사용자가 제조할 수 있거나, 본 발명의 키트의 일부로서 또는 별도의 실체(entitysterile)로서 살균 패키지 내에 제공된다.
와이프 기구는 본 발명의 배양 플레이트 기구에서 포착 요소로서 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "와이프 기구"는 표면과 접촉하여 그 위에 배치된 미생물의 샘플을 얻도록 구성되는 용품이다. 와이프 기구는 다공성 부직 재료를 포함할 수 있다. 와이프 재료의 비제한적인 예에는 종이(예를 들어, 여과지, 셀룰로오스 멤브레인 필터), 합성 부직물(예를 들어, 나일론 또는 폴리에스테르 부직물), 중합체 또는 세라믹 막(예를 들어, 폴리카르보네이트 막, 지르코니아 막), 및 미세구조화 막(예를 들어, 미세채널 함유 필름, 예를 들어 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,223,364호에 기재된 것)이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 미세채널 함유 필름은 필름의 하나의 주 표면으로부터 다른 하나의 주 표면으로 액체 (및 용질 또는 작은 입자)가 통과하는 것을 허용하는 관통구를 포함한다. 와이프 기구는 습윤성을 향상시키는 화학물질(예를 들어, 계면활성제), 또는 시약(예를 들어, 감별 착색제)을 포함할 수 있되, 단, 상기 화학물질 또는 시약은 락트산-생성 박테리아 콜로니에 인접한 산 구역의 탐지에 악영향을 주지 않는다. 일반적으로 와이프 기구는 본 명세서에 기재된 접종 조건 및 인큐베이션 조건 하에서 미생물의 성장을 사실상 억제하지 않는 양으로 화학물질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 포착 요소는 습윤될 때 사실상 투명하게 되거나 사실상 투명하여, 분차 반응(differential reaction), 예를 들어 용혈을 포착 요소를 통하여 투시하는 것을 허용한다.
적합한 포착 요소는 입자, 또는 복수의 입자를 포함한다. 포착 요소는 포착 요소를 미생물과 커플링시키는 수단을 포함할 수 있다. 입자의 비제한적인 예에는 미소구체, 미세비드 등이 포함된다. 그러한 입자는 수지 입자, 예를 들어 아가로스, 라텍스, 폴리스티렌, 나일론, 폴리아크릴아미드, 셀룰로오스, 다당류, 또는 그 조합, 또는 무기 입자, 예를 들어 실리카, 산화알루미늄 또는 그 조합일 수 있다. 그러한 입자는 자성, 상자성, 초상자성, 또는 비자성일 수 있다. 그러한 입자는 크기 면에서 콜로이드성일 수 있으며, 예를 들어 약 100 ㎚ 내지 약 10 마이크로미터(㎛)일 수 있다. 그러한 입자의 비제한적인 예에는 초상자성 중합체 입자가 포함되며, 이는 상표명 다이나비즈(DYNABEADS)(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠, 인크.(Invitrogen, Inc.)) 및 바이오-아뎀비즈(BIO-ADEMBEADS)(프랑스 페삭 소재의 아뎀테크(Ademtech))로 판매된다. 입자 포착 요소는 다른 구조체, 예를 들어 미공성 막 내로 혼입될 수 있다.
포착 요소(예를 들어 입자)를 미생물에 커플링시키는 다양한 수단이 있다. 일부 실시 형태에서, 포착 요소를 미생물에 커플링시키는 수단은 비특이적 흡착을 촉진하는 표면 분자 또는 특성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 포착 요소의 적어도 일부분은 적당한 조건(예를 들어 높은 pH 또는 낮은 pH) 하에서 양으로 또는 음으로 하전되게 되고 미생물의 표면과 관련된 상보적으로 하전된 분자에 비특이적으로 흡착하는 분자를 그의 표면 상에 가질 수 있다.
부가적으로, 또는 대안적으로, 포착 요소(예를 들어, 폴리스티렌 입자)의 적어도 일부분은 미생물의 표면과 관련된 소수성 분자에 비특이적으로 흡착하는 소수성 표면을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 포착 요소를 미생물에 커플링시키는 수단은 수용체-리간드 상호작용을 통하여 미생물에 특이적으로 결합하는 분자를 포함할 수 있다. 그러한 특이적 수용체-리간드 상호작용은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체와 그의 상응하는 항원, 렉틴과 그의 상응하는 탄수화물 결합 파트너, 박테리오파지 단백질과 그의 상응하는 파지 수용체 사이의 상호작용 등을 포함한다. 입자를 미생물에 커플링시키는 수단은 또한 미립자형 포착 요소 외에도 필름 또는 부직(예를 들어, 필터) 포착 요소와 함께 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명의 얇은 플레이트는 전형적으로 사용 전에 소독되거나 살균된다.
샘플 중 산-생성 박테리아의 검출 방법
본 발명은 샘플 중 산-생성 박테리아의 검출 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 냉수 용해성 겔화제, 커버 시트, 산-생성 박테리아의 성장 및 동정을 지지하는 배양 배지, pH 지시제, 및 산-생성 박테리아를 함유할 것으로 의심되는 액체 샘플을 포함하는 박막 배양 기구를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 배양 기구는 배양 배지를 포함할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 배양 기구는 pH 지시제를 포함할 수 있다.
본 방법은 소정 부피의 액체를 배양 기구에 접종하고 그에 의해 배양 배지, pH 지시제, 선택적 항진균제 및 액체 샘플을 포함하는 하이드로겔을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 커버 시트는 박막 배양 기구 상에 존재할 경우 기구에 소정 부피의 액체를 접종할 때 기재로부터 분리된다(예를 들어, 들어 올려진다). 소정 액체 부피는 예를 들어 약 1 ㎖, 약 2 ㎖, 약 3 ㎖, 또는 약 5 ㎖일 수 있다. 소정 부피의 액체는 샘플, 배양 배지, pH 지시제, 및 선택적으로 수성 희석제, 예를 들어 물, 식염액 또는 완충제를 포함한다. 소정 부피의 액체의 성분들(즉, 샘플, 배양 배지, pH 지시제 및 선택적 수성 희석제)은 배양 기구에 개별적으로 첨가될 수 있거나 또는 이들은 둘 이상의 성분들의 혼합물로 배양 기구에 첨가될 수 있다(예를 들어, 샘플은 예를 들어 MRS 브로쓰 또는 레틴(letheen) 브로쓰와 같은 배양 배지와 혼합될 수 있고/있거나 샘플은 pH 지시제 및/또는 희석제와 혼합될 수 있다). 성분들이 개별적으로 첨가될 경우, 이들은 커버 시트가 배양 기구의 접종된 영역 위에 배치되기 전에 간단히 혼합될 수 있다 (예를 들어 피펫 팁으로 교반될 수 있다).
일부 실시 형태에서, 본 방법은 샘플을 화학적 살균제를 중화시킬 수 있는 희석제와 조합하는 단계를 포함한다. 예를 들어 레틴 브로쓰가 본 발명에 따른 방법에서 희석제로 사용될 수 있다. 레틴 브로쓰는 레시틴 및 폴리소르베이트(POLYSORBATE) 80을 포함하며, 이들은 예를 들어 4차 아민 화합물과 같은 일반적으로 사용되는 소독제를 중화시킬 수 있다.
본 방법은 소정 시간 동안 배양 기구를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 인큐베이션 조건(예를 들어, 인큐베이션 온도)은 산-생성 박테리아의 성장 속도에 영향을 줄 수 있으며, 검출되는 박테리아의 유형에 영향을 줄 수도 있다. 예를 들어, 더욱 낮은 온도(예를 들어, 약 25℃)에서의 인큐베이션은 저온성 박테리아(psychrotrophic bacteria)의 검출을 허용할 수 있다. 더욱 높은 온도(예를 들어, 약 30℃, 약 32℃, 약 35℃)에서의 인큐베이션은 소정의 산-생성 박테리아의 더욱 빠른 성장을 용이하게 할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 배양 기구는 100% 이산화탄소 가스에서 또는 인큐베이션에 있어서 혐기성 조건을 생성하는 다른 공지된 방법으로 혐기적으로 인큐베이션된다. 또한 배양 기구는 호기성 조건 하에 인큐베이션될 수 있다.
배양 기구는 산-생성 박테리아 콜로니의 증거가 관찰될 때까지 인큐베이션될 수 있다. 산-생성 박테리아 콜로니의 증거는 콜로니 내의 및/또는 콜로니에 인접한 탐지가능한(즉, pH 지시제의 검출가능한 변화의 관찰에 의한 것임) 산 구역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 산-생성 박테리아는 또한 콜로니에 인접한 가스 버블의 존재에 의해 검출 및 감별될 수 있다. 산 구역은 가시적인 박테리아 콜로니의 부재 하에서 관찰가능할 수도 있다. 일반적으로, 산 구역은 산-생성 박테리아 콜로니와 결부된 가스 버블이 관찰가능해지기 전에 상기 콜로니 내에서 또는 그와 인접하여 나타난다.
일부 실시 형태에서, 배양 기구는 약 16시간 이상, 약 18시간 이상, 약 24시간 이상 또는 약 48시간 이상 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 배양 기구는 약 24시간 이하, 약 48시간 이하, 또는 약 72시간 이하 동안 인큐베이션될 수 있다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 배양 기구는 약 24시간 내지 약 48시간 인큐베이션된다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 배양 기구는 약 5일간, 그리고 7 내지 10일만큼 길게 인큐베이션된다.
본 방법은 미생물의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 추가로 포함한다. 산-생성 박테리아는 본 명세서에 기재된 바와 같이 검출될 수 있다. 적합한 인큐베이션 기간 후, 미생물의 부재는 관찰가능한 콜로니의 부재, 성장 지시제(예를 들어, pH 지시제, 발색성 효소 기질, 산화환원 지시제, 예를 들어 TTC)의 무변화 및 성장 배지 중 발효가능한 탄수화물의 대사와 결부된 가스 버블의 부재에 의해 배양 기구에서 탐지될 수 있다.
미생물 콜로니와 결부된 산 구역은 시각적으로 및/또는 이미지 형성 시스템의 사용에 의해 탐지될 수 있다. 예를 들어, 배양 배지가 pH 지시제로서 브롬크레졸 퍼플을 포함하는 방법에서, 배양 배지는 대략 중성인 pH에서 자주색 또는 회색 외관을 가질 것이다. 산-생성 박테리아가 성장하여 배양 배지 중 글루코스를 발효시킬 때, 브롬크레졸 퍼플 지시제는 성장 중인 박테리아 콜로니에 인접하여 황색으로 나타날 것이다. 예를 들어, 배양 배지가 pH 지시제로서 클로로페놀 레드를 포함하는 방법에서, 배양 배지는 대략 중성인 pH에서 적색 또는 보라색 외관을 가질 것이다. 산-생성 박테리아가 성장하여 배양 배지 중 글루코스를 발효시킬 때, 클로로페놀 레드 지시제는 성장 중인 박테리아 콜로니에 인접하여 황색으로 나타날 것이다.
미생물 콜로니와 결부된 가스 버블은 시각적으로 및/또는 이미지 형성 시스템의 사용에 의해 탐지될 수 있다. 가스 버블은 미생물 콜로니에 인접한 영역에서의 pH 지시제의 변색에 의해 탐지가능한 가시적 콜로니 및/또는 산 구역과 결부될 수 있다.
상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 본 방법은 이미지 형성 시스템을 제공하는 단계 및 배양 기구의 이미지를 획득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이들 실시 형태에서, 미생물의 존재 또는 부재의 탐지는 배양 기구의 이미지의 디스플레이, 인쇄 또는 분석을 포함한다. 이미지 형성 시스템은 이미지 형성 기구를 포함하며, 프로세서를 포함할 수도 있다. 일부 실시 형태에서, 이미지 형성 기구는 라인-스캐너 또는 영역 스캐너 (예를 들어, 카메라)를 포함할 수 있다. 이미지 형성 기구는 단색(예를 들어, 흑백) 또는 다색(예를 들어, 컬러) 스캐너를 포함할 수 있다. 유리하게는, 단색 이미지 형성 시스템은 더욱 높은 해상도의 이미지를 제공할 수 있으며, 이 이미지는 결과의 정확도를 향상시키고/시키거나 배양 기구 중 미생물의 존재를 탐지하는 데 필요한 시간을 감소시킬 수 있다.
일부 실시 형태에서, 이미지 형성 시스템은 조명 시스템을 추가로 포함한다. 조명 시스템은 넓은 스펙트럼의 가시광(예를 들어, "백색" 광)의 적어도 하나의 공급원을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조명 시스템은 좁은 스펙트럼의 가시광의 적어도 하나의 공급원(예를 들어, 상대적으로 좁은 대역폭의 가시광, 예컨대 적색광, 녹색광 또는 청색광을 방출하는 발광 다이오드)을 포함할 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 조명 시스템은 약 525 ㎚의 발광 피크를 갖는 좁은 스펙트럼의 가시광의 공급원(예를 들어, 발광 다이오드)을 포함할 수 있다.
이미지는 배양 기구 내의 하이드로겔에 의해 반사되는 광으로부터 획득될 수 있거나, 이미지는 배양 기구 내의 하이드로겔을 관통하는 광으로부터 획득될 수 있다. 적합한 이미지 형성 시스템 및 상응하는 조명 시스템은 예를 들어 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 국제특허 공개 WO 2005/024047호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0101954호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0102903호에 개시되어 있다. 적합한 이미지 형성 시스템의 비제한적 예에는 쓰리엠 컴퍼니(3M Company; 미국 미네소타주 세인트폴 소재)로부터 입수가능한 페트리필름 플레이트 판독기(PETRIFILM Plate Reader; PPR), 스파이럴 바이오테크(Spiral Biotech; 미국 매사추세츠주 노르우드 소재)로부터 입수가능한 페트리스캔 콜로니 계수기(PETRISCAN Colony Counter), 및 신바이오시스(Synbiosis; 영국 캠브리지 소재)로부터 입수가능한 프로토콜(PROTOCOL) 및 아콜라이트(ACOLYTE) 플레이트 스캐너가 포함된다.
일부 실시 형태에서, 이미지 획득은 파장-바이어스된 이미지를 획득하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이미지 형성 시스템은 이미지 형성 기구에 의해 수집되는 광을 바이어스시키는 바이어스 필터를 포함할 수 있다. 필터 요소는 당업계에 공지되어 있으며, "컷오프(cut-off)" 필터(즉, 소정의 특정한 파장보다 큰 또는 그보다 작은 광 파장의 통과를 허용하는 필터) 및 "밴드패스(band-pass)" 필터(즉, 소정의 특정한 상한치와 하한치 사이의 광 파장의 통과를 허용하는 필터) 둘 모두를 포함한다. 바이어스 필터는 조명원과 배양 기구 사이에 위치될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 바이어스 필터는 배양 기구와 이미지 형성 기구 사이에 위치될 수 있다.
소정의 바람직한 실시 형태에서, 이미지 획득은 적색 파장의 통과를 선택적으로 허용하는 바이어스 필터를 사용하여 이미지를 획득하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이미지 획득은 약 500 ㎚ 내지 약 550 ㎚의 파장의 통과를 선택적으로 허용하는 바이어스 필터를 사용하는 것을 포함한다.
도 5는 이미지 형성 시스템(570)의 내부 작동법을 예시하는 블록 다이어그램이다. 도 5에 예시된 바와 같이, 배양 기구(582)는 이미지 형성 시스템 내에서 (예를 들어, 플랫폼 상의) 촛점면 (도시되어 있지 않음) 내에 위치된다. 본 발명에 따르면, 이미지 형성 기구(592)는 배양 기구(582)의 전면 및/또는 후면 조명을 위한 다색 조명 시스템 (도시되어 있지 않음)과, 배양 기구(582)의 이미지를 포착하는 단색 라인 또는 영역 스캐너를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 예를 들어 이미지 형성 기구(592)는 2차원 단색 카메라의 형태를 취할 수 있다.
일반적으로, 이미지 형성 기구(592)는 하나 이상의 상이한 조명 색으로 배양 기구를 조명하는 동안 배양 기구(582) 또는 그의 적어도 일부분의 이미지를 포착한다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기구(582)의 다수의 이미지가 다양한 조명 지속 기간 또는 강도에 의해 생성될 수 있으며, 다수의 이미지 중 하나 이상이 분석용으로 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 배양 기구(582)의 제1 면 및 제2 면의 선택적 조명을 이용하여 배양 기구의 다수의 이미지를 생성할 수 있으며, 이미지들 중 하나 이상이 분석용으로 선택될 수 있다. 분석용 이미지의 선택은 예를 들어 개별 이미지의 사물 해상 특성 및/또는 색대비를 기반으로 할 수 있다. 이미지의 색대비 및 사물 해상 특성의 결정 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제6,243,286호에 개시되어 있다.
프로세서(594)는 이미지 형성 기구(592)의 작동을 제어한다. 조작자에 의한 시각적 개관을 위하여 프로세서(594)로부터 이미지를 받을 수 있는 선택적 디스플레이(576)가 도 5에 또한 도시되어 있다. 작동에 있어서, 프로세서(594)는 이미지 형성 기구(592)가 배양 기구(582)를 조명하여 이미지를 획득하는 것을 제어한다. 프로세서(594)는 이미지 형성 기구(592)로부터의 스캐닝된 이미지를 나타내는 이미지 데이터를 받는다. 일부 실시 형태에서, 프로세서(594)는 분석 및/또는 디스플레이용으로 다수의 이미지로부터의 하나의 이미지를 선택할 수 있다. 프로세서(594)는 배양 기구(582)의 적어도 하나의 이미지를 분석하며, 분석 결과, 예를 들어 산-생성 박테리아의 콜로니의 카운트 또는 샘플 중 산-생성 박테리아의 존재 또는 부재의 결정을 생성할 수 있다. 분석 결과(예를 들어, 정량적 또는 정성적 결과)는 디스플레이(576) 상에 디스플레이되거나, 선택적 데이터 저장 메모리(598)에 저장되거나, 선택적 통신 포트(595)를 통하여 호스트 컴퓨터(도시되어 있지 않음)에 의해 검색될 수 있다.
본 방법은 배양 기구에서 산-생성 박테리아를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 배양 기구에서 산-생성 박테리아를 검출하는 것은 배양 기구의 이미지를 분석하는 것을 포함한다. 배양 배지 중 글루코스는 산-생성 박테리아에 의해 산을 포함하는 부산물로 발효된다. 미생물로부터 멀리 산이 확산되는 것은 하이드로겔에 의해 제한되기 때문에, 산-생성 박테리아 콜로니에 의한 산 생성은 산이 콜로니에 인접하여 축적되게 한다. 이러한 산 축적은 콜로니에 인접한 배양 배지 중 pH 지시제의 탐지가능한 변화(예를 들어, 변색)를 야기할 수 있다. 따라서, 배양 기구의 이미지 분석은 하이드로겔의 적어도 하나의 다른 부분과 상이한 색 조성을 갖는 배양 배지 내의 구역의 이미지를 분석하는 것을 포함할 수 있다. 변색은 배양 배지 중 pH 지시제에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 브롬크레졸 퍼플은 배양 배지에서 자주색으로 나타날 것이며, 이때 황색 구역은 락트산을 생성하는 콜로니에 인접한다. 클로로페놀 레드는 배양 배지에서 적색 내지 보라색으로 보일 것이며, 이때 황색 구역은 락트산을 생성하는 콜로니에 인접한다. 일부 실시 형태에서, 배양 기구의 이미지 분석은 접종된 배양 기구의 하나 이상의 영역 (또는 전체 영역)에서의 배양 배지의 색을 예를 들어 살균수(즉, 음성 대조군)를 접종한 상응하는 배양 기구의 다른 이미지와 비교하는 것을 포함할 수 있다.
배양 기구의 이미지의 분석은 이미지에서 색 및/또는 다양한 색조의 색(예를 들어, 적색, 녹색, 청색, 회색)을 탐지하는 시스템을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 이미지 분석 시스템은 예를 들어 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,448,652호; 미국 특허 제6,243,486호; 및 미국 특허 제6,153,400호에 개시된 이미지 분석 시스템을 포함한다.
소정의 실시 형태에서, 배양 기구의 이미지 분석은 이미지의 선택된 파장의 분석을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이미지는 광범위한 스펙트럼의 가시광(예를 들어, "백색" 광)의 공급원을 이용하여 배양 기구를 조명함으로써 수집된 컬러 이미지일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이미지는 상대적으로 좁은 스펙트럼의 가시광의 복수의 공급원(예를 들어, 각각이 상대적으로 좁은 대역폭의 가시광, 예컨대 적색광, 녹색광 또는 청색광을 방출하는 발광 다이오드들의 조합)을 이용하여 배양 기구를 조명함으로써 수집된 컬러 이미지일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이미지는 상대적으로 좁은 스펙트럼의 가시광(예를 들어, 적색광, 녹색광 또는 청색광)의 2가지 이상의 상이한 공급원을 이용하여 배양 기구를 조명하면서 수집한 2가지 이상의 이미지를 조합함으로써 만들어진 복합 이미지일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이미지는 상대적으로 좁은 스펙트럼의 가시광(예를 들어, 녹색광)의 공급원을 이용하여 배양 기구를 조명하면서 수집한 이미지일 수 있다. 이들 실시 형태에서, 이미지의 소정의 파장이 이미지의 디스플레이 또는 인쇄 및/또는 이미지 분석용으로 선택될 수 있다.
일부 실시 형태에서(예를 들어, pH 지시제의 색이 적색 내지 황색의 범위임), 이미지 분석용으로 선택된 파장은 녹색 범위의 파장(예를 들어, 약 500 ㎚ 내지 약 550 ㎚의 파장)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 분석용으로 선택된 파장은 약 520 ㎚ 내지 약 530 ㎚의 파장이다. 일부 실시 형태에서, 분석용으로 선택된 파장은 약 525 ㎚이다.
상기 파장은 예를 들어 디스플레이, 인쇄 및/또는 분석용 이미지에서 소정의 범위의 파장을 전자적으로 선택하는 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 선택될 수 있다. 예를 들어, 소정의 녹색 파장 또는 일련의 녹색 파장들은 적색 배양 배지(예를 들어, 클로로페놀 레드를 포함하는 배양 배지)에서 성장하는 락트산 박테리아의 콜로니에 인접한 황색 구역의 이미지의 디스플레이, 인쇄 또는 분석에 특히 적합할 수 있다. 이미지에서 소정의 범위의 파장을 선택하기 위하여 임의의 적합한 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다. 적합한 컴퓨터 프로그램의 비제한적인 예에는 어도비 시스템즈, 인크.(Adobe Systems, Inc.; 미국 캘리포니아주 산호세 소재)로부터 입수가능한 포토샵(PHOTOSHOP) CS4 소프트웨어 및 메디아 사이버네틱스(Media Cybernetics; 미국 매릴랜드주 실버 스프링즈 소재)로부터 입수가능한 이미지-프로 플러스(IMAGE-PRO Plus) 소프트웨어가 포함된다.
배양 기구에서 하이드로겔에 의해 투과되고/되거나 반사되는 녹색 파장의 이미지의 수집에 편향되는 방식으로 배양 기구의 이미지가 획득되고/되거나 분석된 소정 실시 형태에서, 박테리아 콜로니에 인접한 산 구역(예를 들어, 황색 클로로페놀 레드)과 배양 배지 중 pH 지시제(예를 들어, 적색 클로로페놀 레드) 사이의 대비가 유의하게 향상된다. 따라서, 이들 실시 형태에서 산-생성 박테리아는 수집되는 이미지의 파장들을 편향시키지 않는 비견되는 방법에서보다 더욱 초기에 검출가능해진다.
본 발명의 키트
본 발명에 의해 제공되는 키트는 냉수 용해성 겔화제, 산-생성 박테리아의 성장 및 동정을 지지하는 배양 배지 및 pH 지시제를 포함하는 배양 기구를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 배양 기구는 산-생성 박테리아의 성장 및 동정을 지지하는 배양 배지 및/또는 pH 지시제를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 키트는 산-생성 박테리아의 성장 및 동정을 지지하는 탈수된 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탈수된 배양 배지는 pH 지시제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 키트는 산-생성 박테리아의 성장 및 동정을 지지하는 액체 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 액체 배양 배지는 pH 지시제를 포함한다.
본 발명의 키트는 샘플의 제조 및/또는 접종을 보조하기 위하여 샘플 제조 액세서리를 추가로 포함할 수 있다. 샘플 제조 액세서리의 비제한적 예에는 희석제, 완충제, 샘플 획득 기구(예를 들어, 면봉, 스펀지, 스패튤라) 및 피펫이 포함된다.
본 발명을 하기 비제한적인 실시예를 참고로 하여 추가로 예시할 것이다. 모든 부 및 백분율은 달리 표시되지 않으면 중량부로 표현된다.
실시예
실시예 1.
브롬크레졸 퍼플 pH 지시제를 이용한, 가공육 샘플로부터 단리한 락트산 박테리아의 검출
쓰리엠 페트리필름 에어로빅 카운트 플레이트(PETRIFILM Aerobic Count Plate)를 쓰리엠 컴퍼니 (미국 미네소타주 세인트 폴 소재)로부터 획득하였다. 디프코(DIFCO) MRS 브로쓰를 비디-다이아그노스틱 시스템즈(BD-Diagnostic Systems) (미국 메릴랜드주 스팍스 소재)로부터 획득하였다.
락트산-생성 박테리아의 4가지 주를 가공육으로부터 단리하였다. 배양물들 중 2가지를 레우코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 바이셀라 비리데센스(Weisella viridescens), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 아종 락티스 및 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis)로서 동정하였다.
브롬크레졸 퍼플(BCP) pH 지시제를 이스트맨 코닥(Eastman Kodak; 미국 뉴욕주 로체스터 소재)으로부터 획득하였다. 클로로페놀 레드(CPR) (CAS 번호: 4430-20-0)를 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 획득하였다. 상기 pH 지시제들을 MRS 브로쓰에 개별적으로 첨가하여 0.5 mM의 BCP 또는 CPR의 최종 농도를 얻었다. pH 지시제를 용해시킨 후, 용액을 필터로 살균하였다.
박테리아 배양물은 순수 배양물을 트립신 처리 대두 브로쓰 또는 MRS 브로쓰 내에 접종함으로써 제조하였다. 접종한 브로쓰를 25℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 하룻밤 배양물을 MRS 브로쓰 (브롬크레졸 퍼플을 함유함)에서 희석시켜 1 ㎖ 당 대략 10-100 콜로니 형성 단위(colony-forming unit; CFU)의 현탁물을 얻었다. 각각의 희석한 박테리아 현탁물 1 ㎖을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 페트리필름 에어로빅 카운트 플레이트에 접종하였다. 접종한 플레이트를 각각 25°, 30° 및 32℃의 온도에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 박테리아 성장 징후에 대하여 시각적으로 점검하였다. 그 결과가 표 3에 나타나 있다.
실시예 2.
클로로페놀 레드 pH 지시제를 이용한, 가공육 샘플로부터 단리한 락트산 박테리아의 검출
살균 클로로페놀 레드의 진한 용액을 최종 농도가 0.21 g/L(0.5 mM)로 되도록 MRS 희석물에 첨가하였다. 에스. 오랄리스를 이 실험에서 검사하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1에 설명한 바와 같이 락트산 박테리아 배양물을 준비하여 MRS/클로로페놀 레드 용액 내로 희석시켰다. 희석시킨 박테리아 현탁물을 이용하여 페트리필름 에어로빅 카운트 플레이트에 접종하였으며, 이는 실시예 1에 설명한 바와 같았다. 플레이트를 30℃에서 인큐베이션하고, 플레이트를 박테리아 성장 징후에 대하여 시각적으로 점검하였다. 그 결과가 표 3에 나타나 있다.
실시예 3.
클로로페놀 레드 pH 지시제를 이용한, 가공육 샘플로부터 단리한 락트산 박테리아의 검출
살균 클로로페놀 레드의 진한 용액을 실시예 2에 설명한 바와 같이 MRS 희석물에 첨가하였다. 살균 인산2칼륨 (pH 7.0 +/- 0.2)의 진한 용액을 MRS 희석물에 첨가하여 상기 희석물 중 추가의 28 mM 인산염 완충제를 제공하였다. 에스. 오랄리스를 이 실험에서 검사하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1에 설명한 바와 같이 락트산 박테리아 배양물을 준비하여 MRS/클로로페놀 레드 용액 내로 희석시켰다. 희석시킨 박테리아 현탁물을 이용하여 페트리필름 에어로빅 카운트 플레이트에 접종하였으며, 이는 실시예 1에 설명한 바와 같았다. 플레이트를 30℃에서 인큐베이션하고, 플레이트를 박테리아 성장 징후에 대하여 시각적으로 점검하였다. 그 결과가 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
Figure pct00003
실시예 4.
페트리필름 플레이트 이미지의 이미지 분석
바이셀라 비리데센스의 하룻밤 배양물을 준비하고, 브롬크레졸 퍼플 또는 클로로페놀 레드를 함유하는 개개의 MRS 브로쓰 내로 희석시켰으며, 이는 실시예 2에 설명한 바와 같았다. 희석시킨 현탁물을 사용하여 쓰리엠 페트리필름 에어로빅 카운트 플레이트에 접종하였다. 접종 후, 플레이트를 30 C에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 표준 페트리필름 에어로빅 카운트 플레이트를 스캐닝하도록 설정된 페트리필름 플레이트 판독기(PPR)를 사용하여 플레이트의 이미지를 형성하였다. PPR에 의해 생성된 비트맵 이미지를 어도비 포토샵(등록상표) 소프트웨어(미국 캘리포니아주 산호세 소재의 어도비 시스템즈)로 불러오기(import)를 하였다. 상기 소프트웨어를 사용하여 이미지의 녹색 채널을 관찰하여 콜로니와 결부된 락트산으로 인한 콜로니에 인접한 황색 구역을 가시화하였다.
적색, 녹색 및 청색 이미지를 이미지-프로 플러스(IMAGE-PRO Plus) 버전 6.3.0.512 소프트웨어로 보내고, 각각의 컬러 이미지를 그레이스케일 비트맵 이미지로 변환하였다. 상기 소프트웨어를 이용하여 적색 이미지 상의 연한색 구역을 통과하는 대각선 상의 화소를 선택하였다. 각각의 개개의 이미지 아래의 선의 프로파일은 이미지에 나타낸 대각선 상의 각각의 화소에 대한 화소 강도를 보여준다.
브롬크레졸 퍼플을 함유하는 플레이트로부터의 비트맵 이미지가 도 6에 예시되어 있다. 적색 채널 이미지에서의 첨예한 피크는 산 구역 중심의 적색 콜로니에 상응한다. 녹색 채널 이미지에서의 넓은 피크는 박테리아 콜로니에 인접한 황색 pH 지시제 (산) 구역에 상응한다. 청색 채널 이미지에서의 첨예한 트로프(trough)는 박막 배양 기구에서의 황색 격자선에 상응한다.
클로로페놀 레드를 함유하는 플레이트로부터의 비트맵 이미지가 도 7에 예시되어 있다. 적색 채널 이미지에서 검출가능한 피크가 없다. 녹색 채널에서의 넓은 피크는 박테리아 콜로니에 인접한 황색 pH 지시제 (산) 구역에 상응한다. 청색 채널에서의 첨예한 트로프는 박막 배양 기구에서의 황색 격자선에 상응한다.
실시예 5.
클로로페놀 레드, 브롬크레졸 그린 및 브롬페놀 블루 지시 염료를 사용한 박막 배양 기구 중 락트산 박테리아의 검출.
브로모크레졸 그린 나트륨염 (CAS 번호: 62625-32-5), 브롬페놀 블루 나트륨염 (CAS 번호: 34725-61-6) 및 클로로페놀 레드 (CAS 번호: 4430-20-0)를 시그마-알드리치로부터 획득하였다.
MRS 브로쓰 및 레틴 브로쓰의 성분들을 함유하는 희석제 원액을 표 4의 제형에 따라 제조하였다. 원액을 4개의 분취물로 분할하였다. 클로로페놀 레드, 브롬크레졸 그린 및 브롬페놀 블루 지시 염료를 4개의 분취물 중 하나에 0.5 mM의 농도로 첨가하였다. 네 번째 분취물은 어떠한 pH 지시 염료도 받지 않았다. 분취물을 개별적으로 필터로 여과하였다.
[표 4]
Figure pct00004
락토코커스 락티스 아종 락티스 및 레우코노스톡 메센테로이데스의 하룻밤 배양물을 실시예 1에 설명한 바와 같이 준비하였다. 상기 하룻밤 배양물들을 버터필드 희석제에서 1:10,000으로 희석시켰다. 희석한 배양물을 후속적으로 약 10-100 CFU/㎖의 농도로 희석제 원액 (표 4) 중에 연속적으로 희석시켰다. 제조업자의 지시에 따라 최종 현탁물을 사용하여 이중 페트리필름 에어로빅 플레이트 카운트 플레이트에 접종하였다. 한 세트의 플레이트를 25℃에서 인큐베이션하고, 한 세트를 32℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 페트리필름 플레이트 판독기로 이미지 형성하고, 이미지를 인큐베이션한지 24시간 후, 48시간 후 및 72시간 후에 관찰하였다. 그 결과를 표 5에 요약한다. 콜로니는 가시적일 때 플레이트 내의 TTC 지시제로 인하여 적색으로 나타났다. 전형적으로 황색 구역은 콜로니 주변에 할로(halo)로 나타났으며, 인큐베이션한지 24시간 후 직경이 2-3 ㎜ 이상이었다. 상기 구역은 추가의 인큐베이션 후 더욱 크게 나타났다(예를 들어, 48시간 후 직경은 대략 5-10 ㎜, 그리고 72시간 후 직경은 >10 ㎜). 가스 버블은, 존재할 때, 가시적인 콜로니에 인접하였고/하였거나 황색 구역 내에 위치하였다. 전형적으로 가스 버블의 수는 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 더욱 커졌다.
[표 5]
Figure pct00005
실시예 6.
박막 배양 기구 (플레이트 I - VI, IX)를 위한 MRS 배지의 제조
표 6에 예시한 배지 조성물을 하기 절차에 따라 제조하고, 이어서 이를 사용하여 박막 플레이트를 제조하였다. 브로쓰 배지는 피루브산나트륨 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치로부터 획득함)을 역삼투 처리수(reverse osmosis treated water; RO water)를 이용하여 용해시키고 이어서 분산될 때까지 MRS 브로쓰 영양제 (서모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific; 미국 캔자스주 레넥사 소재)으로부터 획득한 레멜(Remel) R454064)를 첨가함으로써 제조하였다. 제조한 배지의 pH는 약 6.6이었으며, 2.5 N 또는 1.0 N의 농도의 염산(HCl)을 사용하여 조정하였다. 교반하면서 구아 검 (M150 구아 메이프로갓(MEYPROGAT) 검, 메이홀 케미칼 아게(Meyhall Chemical AG))을 상기 혼합물에 서서히 첨가하고, 이어서 80℃의 온도로 가열하고, 이어서 가열 없이 추가로 대략 15분 동안 혼합하였다. 혼합물을 냉각시키고, 냉장 보관하였다.
클로로페놀 레드의 첨가
사용할 때, 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 획득한 클로로페놀 레드 (CAS 번호: 4430-20-0)를 RO수에 용해시킨 후 나머지 성분들을 첨가하였다.
사이클로헥시미드의 첨가
사이클로헥시미드 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치로부터 획득함)를 살균 RO수에 용해시킴으로써 사이클로헥시미드 용액을 제조하였다. 상기 용액을 냉각 브로쓰 배지에 첨가하고, 약 15분간 혼합하였다.
니스타틴의 첨가
니스타틴을 메탄올에 용해시킴으로써 니스타틴 용액을 제조하고, 살균수를 냉각 브로쓰 배지에 첨가하고, 약 15분 동안 혼합하였다.
[표 6]
Figure pct00006
박막 배양 기구 어셈블리 (플레이트 I - IX)
박막 배양 플레이트 (도 1)는 플레이트들 각각에 대하여 상기에 설명한 배지 조성물을 이용하여 준비하였다. 격자가 인쇄된 방수 접착제 코팅지 기재는 격자선의 면 상에 약 0.46 g/155㎠의 표적 코팅 중량이 되도록 나이프 코팅기를 이용하여 배지를 약 19.1 ㎝(7.5 in)의 폭으로 코팅하였다. 코팅된 기재를 98.9℃(210℉ )로 설정한 오븐에서 약 4분 동안 건조시켰다.
코팅된 기재를 길이가 대략 10.6 ㎝(16 in)인 시트로 절단하였다. 폐쇄 셀형 폴리스티렌 폼의 0.46 ㎜ 두께 시트를 라이너 상의 접착제 전사 테이프에 라미네이션시켰다. 접착제 코팅된 폼 시트를 다이 커팅(die-cutting)하여 이것이 시트 상에 7.6 ㎝(3 in) × 7.6 ㎝ (3 in)의 직사각형 영역 내에 중심을 둔 10개의 5.1 ㎝(2 in) 직경 원형 절결부(cut-out)를 갖도록 하였다. 이형 라이너를 제거하고, 폼을 기재의 브로쓰 코팅면에 라미네이션시켰다. 에틸렌 옥사이드 처리된 구아를 이용하여, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제4,565,783호의 실시예 12에 설명한 바와 같이 준비한 상부 필름을 커버 필름으로 사용하고, 힌지 테이프(hinge tape)에 의해 기재 시트에 부착시켰다. 이어서 상기 복합재를 7.6 ㎝(3 in) × 10.2 ㎝(4 in)의 직사각형 플레이트로 절단하였으며, 이때 절결부는 플레이트의 한 에지로부터의 7.6 ㎝ 정사각형 내에 중심을 두었다.
폼 다이 커팅된 시트가 방수지에 직접적으로 라미네이션되도록 배지의 코팅 없이 방수지를 사용한 것을 제외하고는 유사한 방식으로 플레이트 VII을 준비하였다.
플레이트 VIII은 쓰리엠™ 페트리필름 ™ 에어로빅 카운트 플레이트를 상기에 설명한 상부 필름에 라미네이션시킴으로써 준비하였다.
범용 비어 아가 배지의 제조
표 7에 열거한 양의 성분들을 분산될 때까지 탈이온수 375 ㎖와 혼합함으로써 배지 조성물을 제조하고, 이어서 이를 80℃의 온도로 가열하였다. 맥주를 첨가하고, 약 15분 동안 혼합하고, 배지를 하룻밤 냉장 보관하였다.
[표 7]
Figure pct00007
실시예 7.
클로로페놀 레드의 존재 하에서의 맥주 샘플로부터의 락트산 박테리아의 검출
락트산-생성 박테리아(LAB)의 11가지의 주를 상업적 양조장으로부터 획득하고, 바이텍(VITEK) 생화학적 프로세서 바이오메리에욱스(Biomerieux)를 사용하여 분류하였다. 11가지의 주를 표준 동정 절차에 따라 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) (2가지의 주), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 페디오코커스 담노수스(Pediococcus damnosus) (3가지의 주), 페디오코커스 아시디락티시(Pediococcus acidilactici) (2가지의 주), 페디오코커스 덱스트리니쿠스(Pediococcus dextrinicus), 락토바실러스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii) 및 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei)로 분류하였다.
pH 지시제 용액은 0.0798 g의 클로로페놀 레드 나트륨염((CPR) CAS 번호: 123333-64-2, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치로부터 획득함)을 198.0 ㎖의 살균 버터필드 완충제 (미국 테네시주 멤피스 소재의 에지바이올로지칼스(EdgeBiologicals)에 용해시킴으로써 제조하였다. CPR 완충제에서 2배 연속 희석을 실시하여 0 ㎍/㎖ (CPR을 첨가하지 않음), 50 ㎍/㎖ (0.1 mM), 100 ㎍/㎖ (0.2 mM), 200 ㎍/㎖ (0.4 mM) 및 400 ㎍/㎖ (0.8 mM)의 최종 농도를 얻었다.
LAB의 각각의 주의 박테리아 배양물은 순수 배양물을 살균 드맨(deMan), 로고사(Rogosa) 및 샤피(Sharpe) 브로쓰 ((MRS, 제품 번호: R454064, 미국 캔자스주 레넥사 소재의 레멜로부터 획득함) 내에 접종함으로써 제조하였다. MRS 브로쓰를 제조업자의 지침에 따라 제조하였다. 접종된 브로쓰를 99.9% 이산화탄소 인큐베이터에서 28℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 배양물을 CPR 완충제에서 희석시켜 대략 10-500 콜로니 형성단위(CFU)를 포함하는 현탁물을 얻었다. 각각의 희석한 배양물 1 ㎖를 사용하여 박막 플레이트에 접종하였다 (플레이트 I). 부가적으로, 100-5000 CFU를 포함하는 박테리아 희석물 1/10 ㎖을 사용하여 한천 플레이트 (범용 비어 아가 플레이트, 미국 메릴랜드주 볼티모어 소재의 알파바이오사이언시즈(AlphaBioSciences)로부터 획득함)에 접종하였다. 박막 플레이트 및 한천 플레이트를 99.9% 이산화탄소 인큐베이터에서 28℃에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 2일 및 5일 후 박테리아 성장 징후에 대하여 시각적으로 점검하였다.
2일 및 5일에 회수한 단리체가 표 8에 나타나 있다.
[표 8]
Figure pct00008
실시예 8.
MRS 배지 중 맥주 샘플에서의 락트산 박테리아의 검출
MRS 브로쓰 (레멜 (미국 캔자스주 레넥사 소재))를 52 g/l, 70 g/l, 105 g/l 및 140 g/l의 농도로 제조하였다. 브로쓰를 제조업자의 지침에 따라 스팀 살균하였다.
락토바실러스 브레비스 (3가지의 주) 및 페디오코커스 담노수스의 배양물을 실시예 7에 설명한 바와 같이 제조하였다. 배양물을 준비한 MRS 브로쓰에 연속적으로 희석시켜 1 ㎖ 당 대략 10-200 콜로니 형성 단위(CFU)를 포함하는 현탁물을 얻었다. 각각의 박테리아 희석물 1 ㎖을 플레이트 VII 상에 접종하였다. 플레이트를 99.9% 이산화탄소 인큐베이터에서 28℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3일 및 4일 후 성장에 대하여 체크하였다. 3일에, 3가지의 락토바실러스 브레비스 박테리아 주 중 2가지가 둘 모두의 유형의 플레이트 상에서 성장하고 있었다. 다른 락토바실러스 브레비스 및 페디오코커스 담노수스는 4일까지는 회수하지 않았다.
실시예 9.
인공적으로 스파이크한(Spiked) 맥주 샘플로부터 여과한 락트산 박테리아의 검출
락토바실러스 브레비스의 배양물을 실시예 1에 설명한 바와 같이 제조하였다. 배양물을 맥주에서 희석시켜 1 ㎖ 당 대략 1 - 10 CFU를 포함하는 현탁물을 얻었다. 이는 0.01 ㎖의 배양물을 99 ㎖의 살균 버터필드 완충제와 조합함으로써 성취하였다 (희석물 A). 이어서 0.0355 ㎖의 희석물 A를 355 ㎖의 맥주와 조합하였다 (희석물 B). 희석물 B의 분취물 35 ㎖을 0.45 ㎛ 혼합 셀룰로오스 에스테르 막 (제품 번호: MSP000814, 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재의 밀리포어로부터 입수가능함)을 통하여 여과하였다. 희석물 B의 두 번째 35 ㎖ 샘플을 폴 코포레이션(PALL Corporation, 미국 뉴욕주 포트 워싱턴 소재)으로부터 입수가능한 0.45 ㎛ 백색 필터 폴 60043 PES를 통하여 여과하였다. 희석물 B의 세 번째 35 ㎖ 샘플을 0.45 ㎛ PES 필터 (미국 뉴욕주 포트 워싱턴 소재의 폴 코포레이션으로부터 입수가능한 폴 66585)를 통하여 여과하였다.
4개의 플레이트를 하기와 같이 각각의 필터 유형에 대하여 준비하였다:
? UBA - 제조업자의 지침 (미국 메릴랜드주 볼티모어 소재의 알파 바이오사이언시즈)에 따라 준비한 범용 비어 아가 플레이트
? 플레이트 VIII을 제조업자의 지침에 따라 준비한 1.0 ㎖ 살균 MRS 브로쓰 (레멜)로 수화시켰다.
? 플레이트 I을 1.0 ㎖ 살균 버터필드 완충제 (미국 테네시주 멤피스 소재의 에지바이올로지칼스)로 수화시켰다.
? 플레이트 I을 0.2 mg/㎖의 CPR을 포함하는 ㎖ 버터필드 완충제로 수화시켰다.
플레이트를 수화 후 주위 온도에 30-60분 동안 두어 겔을 고화시켰다. 상부 필름을 하부 필름으로부터 말리게 하여 겔이 상부 필름에 점착되게 하였다. 필터를 폼 댐 영역 내에 또는 폼 댐을 사용하지 않을 경우 플레이트의 중심부 내에 올바른 배향으로 두었다. 상부 필름을 플레이트 상으로 아래로 말리게 하고, 가벼운 손가락 압력을 사용하여 평평하게 하였다. 한천 플레이트에 있어서, 필터를 한천 표면 상에 올바른 배향으로 두었다. 플레이트를 99.9% CO2 인큐베이터에서 28℃에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3일 및 5일에 성장에 대하여 체크하였다. 3일에, 엘. 브레비스 박테리아를 페트리필름 플레이트 및 범용 비어 아가 플레이트 둘 모두에서 성장시켰다. 그 결과는 표 9에 요약되어 있다.
[표 9]
Figure pct00009
필터를 플레이트 I 및 UBA에서 거꾸로 그리고 올바른 배향으로 둔 것을 제외하고는 UBA 플레이트 및 플레이트 I에서 혼합 셀룰로오스 에스테르 멤브레인 필터를 이용하여 상기에 설명한 바와 같이 플레이트를 준비하였다. 동일 필터의 두 번째 세트를 플레이트 상에 거꾸로 두었다. 결과가 표 10에 나타나 있다.
[표 10]
Figure pct00010
실시예 10.
pH 범위에 걸친 MRS 배지에서의 박테리아의 성장.
MRS 배지 (미국 캔자스주 레넥사 소재의 레멜로부터 입수가능한 R454064)의 4가지 제제를 준비하였다. 하기를 제외하고 제조업자의 지침에 따라 배지를 제조하였다. MRS 영양 배지에 더하여 피루브산나트륨을 영양소 혼합물에 첨가하였다. 부가적으로, 배지의 오토클레이브 이전에 pH 미터를 이용하여 pH를 취하였다. 배지의 pH를 1 N HCl 또는 1 N NaOH를 이용하여 3.5, 4.5, 5.5 또는 6.5로 조정하였다. 배지를 제조업자의 지침에 따라 오토클레이브하였다. 배지를 주위 온도로 냉각시킨 후, 배지의 분취물을 샘플로부터 무균적으로 꺼내고, pH 미터를 이용하여 다시 pH를 취하였다. pH는 오토클레이브 과정 동안 유의하게 변화하지 않았다 (+/- 0.1 pH 단위).
엘. 브레비스 및 피. 담노수스 (2가지의 주)의 박테리아의 하룻밤 배양물을 실시예 7에 설명한 바와 같이 준비하였다. 배양물을 4가지의 pH 조정된 MRS 브로쓰에 연속적으로 희석시켜 25-250 cfu/㎖을 얻었다. 각각의 희석시킨 배양물 1 ㎖를 플레이트 VII 상에 접종하였다. 시험 결과가 표 11에 나타나 있다.
[표 11]
Figure pct00011
실시예 11.
효모 및 사이클로헥시미드를 이용한 락트산 박테리아의 검출
MRS 브로쓰에서의 락토바실러스 브레비스의 하룻밤 배양물 및 효모 펩톤 덱스트로스(yeast peptone dextrose; YPD) 브로쓰에서의 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 하룻밤 배양물을 실시예 7에 설명한 바와 같이 준비하였다. 배양물들을 연속적으로 희석시켜 현탁물을 얻었으며, 각각은 대략 100 cfu/㎖의 개개의 종 (엘. 브레비스 또는 에스. 세레비지애)을 함유하였다. 세 번째 현탁물을 제조하였으며, 이는 총 100 cfu/㎖의 둘 모두의 종을 함유하였다. 각각의 최종 용액이 상표명 악티다이온(Actidione)으로 판매되고 시그마 (플루카(Fluka))로부터 획득된 100 ppm (10 mg/㎖)의 사이클로헥시미드 (CAS 번호: 66-81-9)를 또한 함유한다는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 3가지 현탁물의 두 번째 세트를 제조하였다 (단지 엘. 브레비스, 단지 에스. 세레비지애 및 둘 모두의 유기체). 100 ppm의 사이클로헥시미드를 버터필드 완충제에 용해시키고 이 용액을 0.2 ㎛ 필터를 통하여 살균 여과함으로써 제조한 사이클로헥시미드의 원액을 사용하여 사이클로헥시미드를 첨가하였다. 상기 원액을 희석 완충제에 첨가하였다.
각각의 박테리아 현탁물 1 ㎖를 사용하여 플레이트 I에 접종하였다. 플레이트를 99.9% 이산화탄소의 환경을 갖는 인큐베이터에서 28℃에서 48 hr 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 콜로니 성장에 대하여 점검하였으며, 결과는 표 12에 나타나 있다. 성장은 콜로니의 존재를 나타낸다. 상기에 설명한 것과 동일한 방식으로 제조한 0, 5, 10, 40 및 100 ppm의 사이클로헥시미드 농도를 검사하였으며, 모든 것은 유사한 결과를 생성하였고, 이때 2개의 특유한 콜로니 형태가 사이클로헥시미드를 포함하지 않는 플레이트 상에서 나타났으며, 하나의 특유한 콜로니 형태가 사이클로헥시미드를 포함하는 플레이트 상에서 나타났고, 단지 에스. 세레비지애를 포함하는 플레이트에서는 성장이 없었다.
[표 12]
Figure pct00012
실시예 12.
사이클로헥시미드를 함유하는 배지를 이용한 맥주 샘플로부터의 락트산 박테리아의 검출
LAB의 8가지의 주를 상업적 양조장으로부터 획득하고, 바이텍 생화학적 프로세서를 이용하여 분류하였다. 8가지의 주를 락토바실러스 부크네리스(Lactobacillus buchneris), 락토바실러스 브레비스 (2가지의 주), 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 플란타룸, 페디오코커스 아시디락티 및 페디오코커스 담노수스 (2가지의 주)로 분류하였다. 부가적으로 효모의 5가지 주를 단리하고, 사카로마이세스 세레비지애 (4가지의 주) 및 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus)로 분류하였다.
LAB의 각각의 주의 박테리아 배양물을 실시예 7에 설명한 바와 같이 준비하였다. 효모 배양물은 제조업자의 지침에 따라 준비한 효모 펩톤 덱스트로스(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 비디(BD)) 내에 순수 배양물을 접종함으로써 준비하였다. 접종한 효모 배양물을 주위 온도 (약 24℃)에서 호기적으로 18-24시간 인큐베이션하였다.
박막 배양 플레이트 (플레이트 IX)를 1.0 ㎖ 버터필드 완충제로 60분 동안 수화시킨 후 사용하였다.
박테리아 및 효모 배양물을 희석시켜 도말 배지 당 10-250 cfu를 생성하였다. 하기와 같이 5가지의 상이한 희석제를 사용하였다:
? 희석제 A - 버터필드 완충제 (미국 테네시주 멤피스 소재의 에지바이올로지칼스)
? 희석제 B - 효모를 포함하지 않는 맥주 샘플
? 희석제 C - 효모를 포함하지 않는 맥주 샘플
? 희석제 D - 양조 효모를 포함하는 맥주 샘플
? 희석제 E - 양조 효모를 포함하는 맥주 샘플
하기와 같이 희석제 D 및 E에 있어서 박테리아 배양물 (엘. 부크네리, 엘 브레비스 (2가지의 주), 엘. 플란타룸, 피. 아시디락티시 및 엘. 파라카세이)을 희석시켜 배지 당 10-250 CFU를 얻었다:
1. 0.01 ㎖의 배양물을 99.0 ㎖의 희석제 A와 조합
2. 0.02 ㎖의 희석물 1을 2.0 ㎖의 희석제 D (또는 E)와 조합
3. 0.2 ㎖의 희석물 2를 2.0 ㎖의 희석제 D (또는 E)와 조합
4. 0.1485 ㎖의 희석물 1을 99.0 ㎖의 희석제 B (또는 C)와 조합.
0.1 ㎖의 배양물을 99.0 ㎖의 희석제 A로 희석시킨 것을 제외하고는 동일한 방식으로 피. 담노수스 (2가지의 주) 및 5가지의 효모 주의 희석물을 준비하였다.
희석제 A2, D 또는 E 중에 희석시킨 샘플에 있어서, 1.0 ㎖의 희석물 3을 플레이트 IX 상에 직접적으로 접종하였다.
희석제 A1, B 또는 C 중에 희석시킨 샘플에 있어서, 30 ㎖의 희석물 4를 0.45 ㎛ 혼합 셀룰로오스 에스테르 막 (미국 매사추세츠주 빌레리카 소재의 밀리포어로부터 입수가능한 HAWG047S6)을 통하여 각각 여과시켰다. 실시예 9에 설명한 바와 같이 필터를 플레이트 IX 상에 두었다.
플레이트를 99.9% 이산화탄소 인큐베이터에서 28℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 플레이트는 콜로니 형성 단위의 수에 대하여 그리고 플레이트가 산 생성을 나타내는 적색 또는 황색인지를 조사하였다. 결과가 표 13에 나타나 있다.
[표 13]
Figure pct00013
실시예 13.
니스타틴을 함유하는 배지를 이용한 락트산 박테리아의 검출
락토바실러스 브레비스, 페디오코커스 담노수스, 및 5가지의 사카로마이세스 세레비지애 주의 하룻밤 배양물을 MRS 브로쓰 (박테리아 배양물) 또는 효모 펩톤 덱스트로스(YPD) 브로쓰 (효모 배양물)에서 성장시켰다. 이들 배양물을 연속적으로 희석시켜 대략 100 cfu/㎖의 유기체를 함유하는 현탁물을 생성하였다. 두 번째 시리즈의 현탁물을 제조하고, 500 U/㎖의 니스타틴 (CAS 번호: 1400-61-9, 시그마)을 현탁물에 첨가하였다. 니스타틴 고형물을 100% 에탄올에 첨가하여 25,000 U/㎖의 용액을 제조함으로써 원액을 제조하고, 이어서 이것을 박테리아/효모 현탁물에 첨가하여 원하는 니스타틴 농도를 얻었다. 이어서 1 ㎖의 각각의 상이한 용액을 플레이트 I 상에 접종하였다. 접종한 플레이트를 99.9% CO2 인큐베이터에서 28℃에서 48-144 hr 동안 인큐베이션하였다. 락토바실러스 브레비스 또는 페디오코커스 담노수스 콜로니를 포함하는 플레이트는 니스타틴이 존재하든지 존재하지 않든지 간에 성장하였다. 사카로마이세스 세레비지애를 포함하는 플레이트는 니스타틴을 포함하지 않는 플레이트 상에서만 성장하였다.
실시예 14.
박막 배양 플레이트 상에서의 식품류에 일반적인 LAB
5가지의 박테리아 주의 박테리아 하룻밤 배양물을 실시예 7에 설명한 바와 같이 준비하였다. 주를 상업적 식품 프로세서로부터 얻고, 바이텍 바이오프로세서를 사용하여 분류하였으며, 이를 락토바실러스 페르멘툼, 락토코커스 락티스, 레우코노스톡 메센테로이데스, 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis) 및 바이셀라 비리데센스로 동정하였다. 배양물을 버터필드 완충제에서 약 10 cfu (E1) 또는 100 cfu (E2)로 희석시키고, 플레이트 V 및 플레이트 VI 상에 접종하였다.
배양물 각각을, 배양물의 E1 및 E2 희석물을 400 mg/L의 클로로페놀 레드를 함유하는 2배 강도 MRS 브로쓰와 1:1로 혼합한 것을 제외하고는, 동일한 방식으로 또한 희석하였다. 이어서 이들 혼합물을 쓰리엠 페트리필름 에어로빅 카운트 플레이트 상에 접종하였다.
접종한 플레이트를 25℃, 30℃ 또는 35℃의 온도에서 인큐베이션하고, 24, 48 및 72 hr에서 산의 존재 및 성장에 대하여 체크하였다. 박테리아에 의해 생성된 산을 나타내는 황색 구역은 황색인 플레이트의 % 또는 플레이트 상의 구별가능한 구역의 수로 주어져 있다. 콜로니는 플레이트 상의 cfu의 수이다. 결과가 표 14 내지 표 18에 나타나 있다. 별표로 표시한(*) 플레이트는 쓰리엠™ 페트리필름™ 에어로빅 카운트 플레이트이다.
[표 14]
Figure pct00014
[표 15]
Figure pct00015
[표 16]
Figure pct00016
[표 17]
Figure pct00017
[표 18]
Figure pct00018
실시예 15.
식품에서의 LAB의 검출
희석을 0.1% 펩톤수로 행한 것을 제외하고는 실시예 14에 설명한 바와 같이 박테리아 배양물을 준비 및 희석하였다. 모든 5가지의 유기체를 포함하는 혼합물 (전체 1000 - 10,000 cfu를 가짐)을 pH가 약 4인 구매가능한 프렌치 드레싱(French dressing) 내에 접종하였다.
접종한 샐러드 드레싱 대략 11 g을 230 RPM에서 1분 동안 스토마커(stomacher)에서 0.1% 펩톤수 99 ㎖와 혼합하였다. 1:10 희석물을 이 백으로부터 취하였다. 0.1% 펩톤수를 이용하여 추가의 희석을 실시하여 1:100 및 1:1000 희석물을 얻었다. 각각의 샘플의 pH를 1 M HCl을 이용하여 6.5+/- 0.2로 조정하고, 이어서 플레이트 V 상에 접종하였다 (표 19에서 플레이트 V로 나타냄).
200 mg/L의 클로로페놀 레드를 함유하는 MRS 브로쓰와 희석 배양물의 50-50 혼합물에서 마지막 희석을 행한 것을 제외하고는 유사한 방식으로 배양물 각각을 또한 희석시켰다. 희석시킨 배양물을 실시예 1에 설명한 바와 같이 쓰리엠 페트리필름 에어로빅 카운트 플레이트 상에 접종하였다 (AC). 이들 플레이트를 표 19에서 AC로 나타낸다.
플레이트의 두 번째 시리즈는 약 4인 샘플의 pH를 조정하지 않고서 검사하였다. 접종한 플레이트 전부를 30℃에서 24시간, 48시간 및 72시간 동안 인큐베이션하였다. 산 구역에 의해 둘러싸인 플레이트 내의 적색 도트로서 콜로니를 검출하였다. 플레이트를 각각의 플레이트에 있어서의 콜로니 카운트에 대하여 점검하였으며, 결과는 표 19에 나타나 있다.
[표 19]
Figure pct00019
권한이 부여된 설명을 할 수 있는 발명자가 예견한 몇몇 특정 실시 형태들을 참고로 하여 본 발명이 이제까지 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 현재 예견되지 않은 변경을 비롯한 본 발명의 가상의 변경이 본 발명에 대한 등가물을 구성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범주는 본 명세서에 기재된 상세 내용 및 구조에 의해 한정되어서는 안 되며, 오히려 하기 특허청구범위 및 그 등가물에 의해서만 한정되어야 한다.

Claims (43)

  1. 냉수 용해성 겔화제, 산-생성 박테리아의 성장을 지지하는 배양 배지, pH 7.0 미만으로 연장하는 전이 범위를 갖는 pH 지시제, 산-생성 박테리아에 의해 발효될 수 있는 탄수화물, 및 샘플을 포함하는 박막 배양 기구를 제공하는 단계;
    배양 기구에서 소정 부피의 샘플, 배양 배지, pH 지시제, 및 발효가능한 탄수화물을 조합하는 단계;
    배양 기구를 소정 기간 동안 인큐베이션하는 단계; 및
    미생물의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함하는, 산-생성 박테리아를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 배양 기구는 배양 배지를 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배양 기구는 pH 지시제를 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지의 pH는 6.5 미만의 pH로 조정되고, 미생물의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계는 산-생성 미생물의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 배양 기구는 선발제를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 선발제는 항진균제인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 항진균제는 사이클로헥시미드(Cycloheximide), 니스타틴(Nystatin), 나타마이신(Natamycin), 암포테리신(Amphotericin) B, 필리핀(Filipin), 및 전술한 것의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 냉수 용해성 겔화제, 락트산 박테리아의 성장을 지지하는 배양 배지, pH 7.0 미만으로 연장하는 전이 범위를 갖는 pH 지시제, 산-생성 박테리아에 의해 발효될 수 있는 탄수화물, 및 산-생성 박테리아를 함유할 것으로 의심되는 샘플을 포함하는 박막 배양 기구를 제공하는 단계;
    소정 부피의 샘플과 배양 배지를 조합하여 제1 혼합물을 형성하는 단계;
    배양 기구에서 제1 혼합물, pH 지시제 및 발효가능한 탄수화물을 조합하는 단계;
    배양 기구를 소정 기간 동안 인큐베이션하는 단계; 및
    미생물의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함하는, 산-생성 박테리아를 검출하는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 기구를 인큐베이션하는 단계는 상기 기구를 호기적으로 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 미생물의 존재를 탐지하는 단계는 미생물을 감별하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 미생물을 감별하는 단계는 pH 지시제 반응을 탐지하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 미생물을 감별하는 단계는 미생물과 결부된 가스 버블을 탐지하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, pH 지시제는 브롬크레졸 퍼플, 클로로페놀 레드, 브롬크레졸 그린, 및 브롬페놀 블루로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 화학적 살균제를 중화시킬 수 있는 희석제와 조합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제8항 및 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지의 pH는 6.5 미만의 pH로 조정되고, 미생물의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계는 산-생성 미생물의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제4항 내지 제8항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 기구를 인큐베이션하는 단계는 상기 기구를 혐기적으로 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    이미지 형성 시스템을 제공하는 단계; 및
    배양 기구의 성장 영역의 이미지를 획득하는 단계를 추가로 포함하고,
    미생물의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계는 성장 영역의 이미지를 디스플레이, 인쇄 또는 분석하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 이미지 형성 시스템은 조명원을 포함하며, 성장 영역의 이미지를 획득하는 단계는 성장 영역을 조명하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물을 계수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 미생물을 계수하는 단계는 2가지 이상의 유형의 미생물을 계수하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 이미지 형성 시스템은 조명원을 포함하며, 성장 영역의 이미지를 획득하는 단계는 성장 영역을 조명하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 성장 영역을 조명하는 단계는 제한된 밴드의 가시 파장으로 성장 영역을 조명하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 제한된 밴드의 가시 파장은 약 500 ㎚ 내지 약 550 ㎚의 범위의 파장으로부터 선택되는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 제한된 밴드의 가시 파장은 약 520 ㎚ 내지 약 530 ㎚의 범위의 파장으로부터 선택되는 방법.
  25. 제18항에 있어서, 성장 영역을 조명하는 단계는 바이어스 필터를 이용하여 성장 영역을 조명하거나 성장 영역의 이미지를 수집하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 이미지 분석 시스템을 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 이미지를 분석하는 단계는 이미지 분석 시스템을 이용하여 이미지를 분석하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 이미지를 분석하는 단계는 이미지의 선택된 파장을 분석하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 선택 파장은 약 500 ㎚ 내지 약 550 ㎚의 범위에서 선택되는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 선택 파장은 약 520 ㎚ 내지 약 530 ㎚의 범위에서 선택되는 방법.
  30. 상부 표면 및 하부 표면을 갖는 자기 지지형 방수 기재를 포함하는 몸체 부재; 및
    기재의 상부 표면 상의 건조 코팅을 포함하며, 코팅은 산-생성 박테리아의 성장을 지지하는 배양 배지, 냉수 용해성 겔화제, 및 pH 7.0 미만으로 연장하는 전이 범위를 갖는 pH 지시제를 포함하는 박막 배양 기구.
  31. 제30항에 있어서, 산-생성 박테리아에 의해 발효될 수 있는 탄수화물을 추가로 포함하는 기구.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 커버 시트를 추가로 포함하는 기구.
  33. 제32항에 있어서, 커버 시트는 냉수 용해성 겔화제를 포함하는 코팅을 추가로 포함하는 기구.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 커버 시트는 지시제를 포함하는 코팅을 추가로 포함하는 기구.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, pH 지시제는 브롬크레졸 퍼플, 클로로페놀 레드, 브롬크레졸 그린, 및 브롬페놀 블루로 이루어진 군으로부터 선택되는 기구.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 냉수 용해성 겔화제는 구아 검, 잔탄 검, 로커스트 빈(locust bean) 검, 하이드록시에틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 알긴 및 전술한 것들 중 임의의 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기구.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트 또는 아세트산나트륨을 포함하는 기구.
  38. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지의 pH는 6.5 미만의 pH로 조정된 용품.
  39. 냉수 용해성 겔화제를 포함하는 박막 배양 기구;
    산-생성 박테리아의 성장을 지지하는 배양 배지;
    산-생성 박테리아에 의해 발효될 수 있는 탄수화물; 및
    pH 지시제를 포함하는 키트.
  40. 제39항에 있어서, 배양 배지는 pH 지시제 또는 산-생성 박테리아에 의해 발효될 수 있는 탄수화물을 포함하는 키트.
  41. 제39항에 있어서, 배양 기구는 배양 배지, pH 지시제, 산-생성 박테리아에 의해 발효될 수 있는 탄수화물 또는 전술한 것들 중 임의의 둘의 조합을 포함하는 키트.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 희석제, 완충제, 샘플 획득 기구, 및 피펫으로 이루어진 군으로부터 선택되는 샘플 준비 액세서리(accessory)를 추가로 포함하는 키트.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지는 6.5 미만의 pH로 조정된 키트.
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