MX2011013562A - Deteccion de bacterias que producen acido. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a dispositivos de cultivo y métodos útiles para detectar bacterias que producen ácido en una muestra. El dispositivo incluye un medio nutriente y un indicador de pH para detectar y diferenciar microorganismos que producen ácido, tales como bacterias de ácido láctico. Los métodos de uso incluyen detectar o enumerar microorganismos que producen ácido. Se proporcionan además métodos para la detección de bacterias que producen ácido que produce gas.

Description

DETECCION DE BACTERIAS QUE PRODUCEN ACIDO Antecedentes de la Invención La bacteria que produce ácido comprende un grupo relativamente diverso de microorganismos Gram positivos que portan características metabólicas y fisiológicas comunes. Este grupo de bacteria produce ácido como el principal producto final de la fermentación de carbohidratos. El grupo se divide en dos subgrupos metabólicos -termentadores homolácticos , los cuales convierten carbohidratos esencialmente en ácido; y termentadores heterolácticos , además de producir ácido, también convierten carbohidratos en otros metabolitos que incluyen etanol y di-óxido de carbono, por ejemplo.

Aunque algunas bacterias que producen ácido, tales como bacterias que producen ácido láctico (LAB) tienen un papel benéfico en la producción de productos fermentados, también se conocen como un agente principal del deterioro de alimentos y bebidas, particularmente en carnes envasadas al vacío, productos cárnicos y cervezas. La actividad metabólica de bacterias que producen ácido en ciertos productos alimenticios puede conducir a significante deterior de las propiedades organolépticas (por ejemplo, olor, sabor) del alimento o bebida.

Técnicas microbiológicas tradicionales son REF. :226195 típicamente usadas para identificar y/o enumerar bacterias que producen ácido, tales como LAB. Se usan agar y medio de caldo de cultivo (por ejemplo, medio MRS y APT) , para promover el crecimiento y/o identificar bacterias que producen ácido. Los cultivos se incuban en ambientes microaerofílicos para mejorar el crecimiento de las bacterias que producen ácido, tales como LAB. Métodos típicos incluyen el crecimiento y aislamiento presuntivo de colonias de bacterias que producen ácido en una placa de agar selectivo, seguido por subcultivo en un medio de caldo que contiene un tubo de fermentación para detectar la producción de gas por especies de fermentación heterolácticas . Estos métodos pueden tomar hasta cuatro días para detectar o identificar la bacteria que produce ácido. En algunos casos, los métodos pueden tomar de 7-10 días para identificar la bacteria que produce ácido.

Existe una necesidad de artículos y métodos simples para la detección de bacteria que produce ácido, tal como LAB, en una muestra.

Breve Descripción de la Invención En vista de los métodos generales actuales para detectar y/o identificar bacterias que producen ácido, las cuales típicamente requieren medio de cultivo especializado, largos periodos de incubación, condiciones de incubación especializadas, y/o procedimientos de subcultivo, la presente descripción incluye artículos y métodos simples para detectar y/o identificar bacterias que producen ácido. En algunas modalidades, los métodos inventivos se proporcionan para la diferenciación de bacterias que producen ácido. Adicionalmente , o alternativamente, algunas modalidades se proporcionan para la enumeración de bacterias que producen ácido. En algunas modalidades, los métodos inventivos se proporcionan para la detección automatizada y/o enumeración de bacterias que producen ácido.

De este modo, en un aspecto, la presente descripción proporciona un método para detectar una bacteria ácida. Un método para detectar una bacteria que produce ácido puede comprender proporcionar un dispositivo de cultivo de película delgada, un medio de cultivo para soportar el crecimiento de la bacteria del ácido, un indicador de pH con un intervalo de transición que se extiende por debajo de pH 7.0, un carbohidrato que puede ser fermentado por bacterias que producen ácido, y una muestra. El dispositivo de cultivo de película delgada puede comprender un agente gelificante soluble en agua fría. El método además puede comprender combinar, en el dispositivo de cultivo, un volumen predeterminado de la muestra, el medio de cultivo, el indicador de pH, y el carbohidrato fermentable. El método además puede comprender incubar el dispositivo de cultivo por un periodo de tiempo a un pH por debajo de 7 y detectar la presencia o ausencia de un microorganismo que produce ácido .

En otro aspecto, se proporciona un método para detectar una bacteria que produce ácido, que comprende proporcionar un dispositivo de cultivo de película delgada que comprende un agente gelificante soluble en agua fría, un medio de cultivo para soportar el crecimiento de bacterias que producen ácido, un indicador de pH con un intervalo de transición que se extiende por debajo de pH 7.0, un carbohidrato que puede ser fermentado por bacterias que producen ácido, y una muestra sospechosa de contener bacterias que producen ácido. El método además puede comprender combinar un volumen predeterminado de muestra y el medio de cultivo para formar una primera mezcla; combinar, en el dispositivo de cultivo, la primera mezcla, el indicador de pH, y el carbohidrato fermentable ; incubar el dispositivo de cultivo por un periodo de tiempo; y detectar la presencia o ausencia de un microorganismo.

En cualquiera de las modalidades anteriores, el dispositivo de cultivo puede comprender el medio de cultivo y/o el indicador de pH. En algunas modalidades del método, el dispositivo de cultivo además puede comprender un agente selectivo. En algunas modalidades del método, incubar el dispositivo de cultivo puede comprender incubar el dispositivo aeróbicamente y/o anaeróbicamente .

En cualquiera de las modalidades anteriores, detectar la presencia de un microorganismo puede comprender diferenciar un microorganismo. En algunas modalidades, diferenciar un microorganismo puede comprender detectar una reacción indicadora de pH o detectar una burbuja de gas asociada con el microorganismo. En cualquiera de las modalidades anteriores, el método además puede comprender combinar la muestra con un diluyente capaz de neutralizar un desinfectante químico. En cualquiera de las modalidades anteriores, el pH del medio de cultivo puede ser ajustado a un pH por debajo de 6.5, en donde detectar la presencia o ausencia de un microorganismo comprende detectar la presencia o ausencia de un microorganismo que produce ácido.

En cualquiera de las modalidades anteriores, el método puede además comprender proporcionar un agente antifúngico. En cualquiera de las modalidades anteriores, el indicador de pH puede ser seleccionado del grupo que consiste de, por ejemplo, clorofenol rojo, bromocresol púrpura, bromocresol azul y bromocresol verde. En cualquiera de las modalidades anteriores, el método puede además comprender la etapa de enumerar microorganismos. i En cualquiera de las modalidades anteriores, el método además puede comprender proporcionar un sistema de imagen y obtener una imagen del dispositivo de cultivo, en donde detectar la presencia o ausencia de un microorganismo comprende desplegar, imprimir, o analizar la imagen del dispositivo de cultivo. En algunas modalidades, el método además puede comprender proporcionar un sistema de análisis de imagen, en donde analizar la imagen comprende analizar la imagen con el sistema de análisis de imagen.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un dispositivo de cultivo de película delgada. El dispositivo de cultivo puede comprender un miembro de cuerpo que comprende un sustrato a prueba de agua, de auto-soporte que tiene superficies superior e inferior. El dispositivo de cultivo puede además comprender un recubrimiento seco en la superficie superior del sustrato. El recubrimiento seco puede comprender un medio de cultivo para soportar el crecimiento de bacterias que producen ácido; un agente gelificante soluble en agua fría; un indicador de pH con un intervalo de transición que se extiende por debajo de pH 7.0; y, opcionalmente , un agente antifúngico. En algunas modalidades, el dispositivo de cultivo además puede comprender una lámina de cubierta. En algunas modalidades, la lámina de cubierta además puede comprender un recubrimiento que incluye un agente gelificante soluble en agua fría y/o un indicador. En cualquiera de las modalidades anteriores, el dispositivo puede además comprender un carbohidrato que puede ser fermentado por bacterias que producen ácido. En cualquiera de las modalidades anteriores, el indicador de pH puede ser seleccionado del grupo que consiste de, por ejemplo, clorofenol rojo, bromocresol púrpura, bromocresol azul, y bromocresol verde. En cualquiera de las modalidades anteriores, el medio de cultivo puede comprender monooleato de polioxietilen(20) sorbitán o acetato de sodio. En cualquiera de las modalidades anteriores del dispositivo de cultivo, el pH del medio de cultivo puede ser ajustado a un pH por debajo de 6.5.

En aún otro aspecto, la presente descripción proporciona un kit. El kit puede comprender un dispositivo de cultivo de película delgada que comprende un agente gelificante soluble en agua fría, un medio de cultivo para soportar el crecimiento de bacterias que producen ácido, un carbohidrato que puede ser fermentado por bacterias que producen ácido, y un indicador de pH. En algunas modalidades, el medio de cultivo del kit puede comprender un agente antifúngico. En algunas modalidades, el medio de cultivo del kit puede comprender el indicador de pH o el carbohidrato que puede ser fermentado por bacterias que producen ácido. En algunas modalidades, el dispositivo de cultivo del kit puede comprender el medio de cultivo, el carbohidrato que puede ser fermentado por bacterias que producen ácido, el indicador de pH, o una combinación de cualquiera de los dos o más de los anteriores. En cualquiera de las modalidades anteriores, el kit además puede contener un accesorio de preparación de muestra seleccionado del grupo que consiste de un diluyente de muestra, un amortiguador, un dispositivo de adquisición de muestra, y una pipeta. En cualquiera de las modalidades de kit anteriores, el pH del medio de cultivo puede ser ajustado a un pH por debajo de 6.5.

Las palabras "preferido" y "preferiblemente" se refieren a modalidades de la invención que pueden proporcionar ciertos beneficios, bajo ciertas circunstancias. Sin embargo, otras modalidades también pueden ser preferidas, bajo las mismas u otras circunstancias. Además, la mención de una o más modalidades preferidas no implica que otras modalidades no sean útiles, y no se pretende excluir otras modalidades del alcance de la invención.

Como se usa en la presente, "un", "uno", "el", "al menos uno", y "uno o más", son usados intercambiablemente. De este modo, por ejemplo, una muestra sospechosa de contener "un" microorganismo puede ser interpretado por significar que la muestra puede incluir "uno o más" microorganismos .

El término "y/o" significa uno o todos los elementos listados o una combinación de cualquiera dos o más de los elementos listados.

También en la presente, las menciones de intervalos numéricos por puntos finales incluyen todos los números subsumados dentro de tal intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5, etc.).

El sumario anterior de la presente invención no se pretende para describir cada modalidad descrita o cada implementación de la presente invención. La descripción que sigue ejemplifica más particularmente modalidades ilustrativas. En varias partes a través de la solicitud, se proporciona guía a través de listas de ejemplos, en los cuales los ejemplos pueden ser usados en varias combinaciones. En cada caso, la lista mencionada sirve solamente como un grupo representativo y no debe ser interpretado como una lista exclusiva.

Breve Descripción de las Figuras La invención será además explicada con referencia a las figuras de dibujos listadas abajo, en donde la estructura similar es referenciada por números similares a través de las varias vistas.

La Figura 1 es una vista en perspectiva superior, parcialmente en sección, de una modalidad de un dispositivo de cultivo de película delgada.

La Figura 2 es una vista superior de una modalidad de un sustrato de auto- soporte que comprende un patrón de rej illa .

La Figura 3 es una vista en perspectiva superior, parcialmente en sección, de una modalidad de un dispositivo de cultivo de película delgada.

La Figura 4 es una vista en perspectiva superior, parcialmente en sección, de una modalidad de un dispositivo de cultivo de película delgada que comprende un espaciador y un elemento de captura.

La Figura 5 es un diagrama de bloque de una modalidad de un sistema de detección de conformidad con la presente descripción.

La Figura 6 es una representación de una imagen en blanco y negro del área de crecimiento de una placa PETRIFILM iluminada con diodos que emiten luz verde.

Descripción Detallada de la Invención Antes que algunas modalidades de la invención se expliquen en detalle, se entiende que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles de construcción y al arreglo de componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos acompañantes. La invención es capaz de otras modalidades y de ser practicada o ser llevada a cabo en varias formas. También, se entiende que la fraseología y terminología usada en la presente son para el propósito de descripción y no deben ser consideradas como limitantes. El uso de "incluye", "que comprende," "que contiene," o "que tiene" y variaciones de los mismos significa abarcar los puntos listados posteriormente y equivalentes de los mismos así como también puntos adicionales. A menos que se especifique o limite de otro modo, los términos "soportado", y "acoplado" y variaciones de los mismos son usados ampliamente y abarcan soportes tanto directos como indirectos y acoplamientos. Se entiende que otras modalidades pueden ser utilizadas y se pueden hacer cambios estructurales o lógicos sin apartarse del alcance de la presente descripción. Además, términos tales como "frontal", "posterior", "superior", "inferior", y similares son solamente usados para describir elementos que se relacionan entre sí, pero no están en ninguna forma significando mencionar orientaciones específicas del aparato, para indicar o implicar orientaciones necesarias o requeridas del aparato, o para especificar cómo será usada la invención descrita en la presente, montada, desplegada, o posicionada en uso.

La presente descripción se dirige en general a métodos y artículos para detectar y diferenciar bacterias que producen ácido en una muestra. Descritas como anaeróbicas facultativas, las bacterias que producen ácido son a menudo cultivadas en ambientes (por ejemplo, cámaras) a partir de las cuales se remueve el oxígeno (por ejemplo, catalíticamente removido). Los métodos inventivos proporcionan crecimiento, detección, y diferenciación de bacterias que producen ácido en ambientes que contienen oxígeno y/o bajos en pH. Los métodos descritos en la presente pueden ser usados en ambientes anaeróbicos o aeróbicos, eliminando parcialmente la necesidad de equipo de incubación especializado. Adicionalmente , se proporcionan métodos inventivos para la diferenciación de bacterias que producen ácido detectando la producción de gas de dióxido de carbono a partir de colonias individuales, de este modo eliminando el tiempo de incubación adicional necesario para el aislamiento de cultivos puros y el uso de tubos de fermentación para detectar la producción de gas. Además, la descripción se refiere a la enumeración de bacterias que producen ácido en una muestra. En algunas modalidades, la detección de bacterias que producen ácido comprende detección automatizada usando un sistema de imagen.

Se pueden obtener muestras adecuadas o derivadas de una variedad de fuentes. El término "fuente" es en general usado para referirse al alimento o no alimento deseado para ser probado para determinar microorganismos. La fuente puede ser un sólido, un líquido, un semi-sólido, un material gelatinoso, gas (por ejemplo, aire) , y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la fuente puede ser proporcionada por un elemento de captura que se usa, por ejemplo, para recolectar la fuente de una superficie de interés o del aire. En algunas modalidades, la composición líquida puede incluir el elemento de captura, el cual puede ser roto además aparte (por ejemplo, durante un proceso de agitación o disolución) para mejorar la recuperación de la fuente y cualquier microorganismo de interés. La superficie de interés puede incluir al menos una porción de una variedad de superficies, que incluyen, pero no se limitan a, paredes (que incluyen puertas), pisos, techos, drenajes, sistemas de refrigeración, ductos (por ejemplo, ductos de aire) , ventilaciones, asientos de inodoros, asas, picaportes, pasamanos, mostradores, mesas, superficies para comidas (por ejemplo, charolas, platos, etc.), superficies de trabajo, superficies de equipo, vestimenta, etc., y combinaciones de los mismos. Toda o una porción de la fuente se puede usar en el método. Cuando una porción de la fuente se usa, esto puede algunas veces ser referido como una "muestra" de la fuente. Sin embargo, el término "muestra" es en general usado en la presente para referirse a la porción del volumen o masa del material que se obtiene a partir de la fuente y se introduce en un dispositivo de prueba para la detección de microorganismos .

El término "alimento" se usa en general para referirse a un sólido, líquido (por ejemplo, que incluye, pero no se limita a, soluciones, dispersiones, emulsiones, suspensiones, etc., y combinaciones de los mismos) y/o composición comestible semi-sólida. Ejemplos de alimentos incluyen, pero no se limitan a, carnes, aves, huevos, pescado, mariscos, vegetales, frutas, alimentos preparados (por ejemplo, sopas, salsas, pastas), productos de grano (por ejemplo, harina, cereales, pan) , alimentos enlatados, leche, otros productos lácteos (por ejemplo, queso, yogurt, crema agria), grasas, aceites, postres, condimentos, especies, pastas, bebidas, agua, cerveza, alimento para animales, otros materiales comestibles, y combinaciones de los mismos.

"Dispositivo de adquisición simple", se usa en la presente en el sentido más . amplio y se refiere a un implemento usado para recolectar un material de muestra líquido, semisólido o sólido. Ejemplos no limitantes de dispositivos de adquisición de muestra incluyen hisopos, toallas, esponjas, cucharas, espátulas, depresores de lengua, filtros, pipetas, puntas de pipeta y mangueras de sifón.

El término "fomita" es en general usado para referirse a un objeto inanimado o sustrato capaz portar organismos infecciosos y/o transferirlos. Las fomitas pueden incluir, pero no se limitan a, trapos, trapeadores, toallas, esponjas, toallitas, utensilios de cocina, monedas, billetes, teléfonos celulares, ropa (que incluye zapatos), manijas de puerta, etc., partes de los mismos, y combinaciones de los mismos .

El término "bacterias que producen ácido" es en general usado para referirse a cualesquiera microorganismos procarióticos que son caracterizados por su producción de ácido como un principal producto final metabólico de fermentación de carbohidrato. Ejemplos de bacterias que producen ácido incluyen, pero no se limitan a, Acetobacter y LAB. Las bacterias más comunes que producen ácido incluyen bacterias lácticas que producen ácido.

El término "bacterias lácticas que producen ácido" o "LAB" es en general usado para referirse a cualesquiera microorganismos procarióticos que son caracterizados por su producción de ácido láctico como un principal producto final metabólico de la fermentación de carbohidrato.

Ejemplos de bacterias de ácido láctico incluyen, pero no se limitan a, miembros de los siguientes géneros Streptococcus, Enterococcus, Lactobacíllus, Pediococcus, Lactococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Oenococcus, Sporolactobacillus, Teragenococcus, Vagococcus, y Weisella.

La bacteria de ácido láctico incluye ciertas bacterias patogénicas tales como, por ejemplo, Enterococcus resistente a vancomicina, ciertas especies del género Leuconostoc, y Streptococcus pyogenes.

Factores ambientales que pueden afectar el crecimiento de bacterias que producen ácido pueden incluir la presencia o ausencia de nutrientes, pH, contenido de humedad, potencial de oxidación-reducción, compuestos antimicrobianos, temperatura, composición de gas atmosférico, y estructuras o barreras biológicas.

Dispositivos de Cultivo: La presente descripción en ciertas modalidades incluye dispositivos de cultivo para la detección de bacterias que producen ácido, tales como bacterias lácticas que producen ácido. Dispositivos de cultivo de la presente invención incluyen, por ejemplo, dispositivos de placa de cultivo de película delgada. Dispositivos de placa de cultivo de película delgada son típicamente más compactos que las cajas de petri de agar tradicionales y típicamente contienen medio de cultivo rehidratable , seco, para soportar el crecimiento de ciertos microorganismos. Ejemplos no limitantes de dispositivos de placa de cultivo de película delgada incluyen los dispositivos recubiertos de sustrato descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,565,783; 5,089,413, y 5,681,712; cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. La FIG. 1 ilustra una modalidad de un dispositivo de cultivo de película delgada de conformidad con la presente invención. El dispositivo de cultivo 110 incluye un miembro de cuerpo que comprende un sustrato a prueba de agua de auto-soporte 112 que tiene superficies superior e inferior (112a y 112b, respectivamente) . El sustrato 112 puede ser una película relativamente rígida (por ejemplo, poliéster, polipropileno o poliestireno) , la cual no absorberá o de otro modo será afectada por el agua. El sustrato 112 puede ser ya sea transparente u opaco, dependiendo de si uno desea ver colonias bacterianas a través del sustrato. Para facilitar el conteo de colonias bacterianas, el sustrato 212 puede tener un patrón de rejilla (por ejemplo, cuadrados) impreso en este, como se muestra en la FIG. 2.

Con referencia a la FIG. 1, el sustrato 112 puede ser recubierto en su superficie superior 112a con una capa de un adhesivo 114 la cual sirve para retener el agente gelificante, indicador de pH, carbohidrato, agente antifúngico opcional, otros indicadores, y/o nutrientes en una monocapa uniforme 116 para fácil hidratación. El adhesivo 114 debe ser recubierto sobre el sustrato 112 en un espesor el cual es preferiblemente menor que el diámetro de las partículas del agente gelificante en polvo y/o nutrientes. El objeto es aplicar suficiente adhesivo para adherir las partículas al sustrato pero no tanto de manera que las partículas lleguen a ser completamente incrustadas en el adhesivo. Se desea una monocapa uniforme de polvo soluble en agua frío 116 son suficiente área de superficie expuesta para hidratación. También mostrados en la FIG. 1 están el adhesivo opcional 114' y capas de polvo soluble en agua fría 116' sobre la lámina de cubierta 122. Cuando se hidrata con una solución acuosa (por ejemplo, la muestra y/o un medio de suspensión acuosa, tal como agua o un amortiguador) , el agente gelificante forma un hidrogel .

En algunas modalidades, el adhesivo 114, 114' puede comprender una composición adhesiva a base de agua. Preferiblemente, la capa de adhesivo a base de agua 114, 114' es suficientemente transparente cuando se humedece por una muestra de prueba acuosa para permitir la observación de las colonias de microorganismos. La composición adhesiva a base de agua puede incorporar uno o más agentes hidrofílieos , que incluyen nutrientes, agentes selectivos, indicadores (por ejemplo, indicadores de pH) o combinaciones de los mismos .

Los nutrientes específicos y/o agentes selectivos usados en la composición adhesiva a base de agua serán aparentes para aquellos expertos en la técnica en vista de la presente especificación y pueden ser optimizados para las bacterias particulares que producen ácido para hacerlas crecer y/o ser selectivamente detectadas o inhibidas. Por ejemplo, ciertos agentes selectivos (por ejemplo, antibióticos tales como vancomicina) pueden ser agregados a la composición para seleccionar microorganismos resistentes al antibiótico correspondientes. Adicionalmente , la concentración del agente selectivo puede ser ajustada para seleccionar un cierto nivel de resistencia, el cual es bien conocido para una persona de habilidad ordinaria en la técnica .

En una modalidad preferida útil con alimentos y bebidas fermentados. El agente selectivo incluye un agente antifúngico. Los agentes antifúngicos útiles incluyen Cicloheximida, Nistatina, y Natamicina (también conocida como pimaricina) . Otros agentes antifúngicos útiles pueden ser Anfotericina B y Filipina.

Medios nutrientes para cultivar bacterias que producen ácido se conocen en la técnica. Ejemplos no limitantes de tales medios incluyen medio MRS, medio APT, triptona glucosa, medio de extracto de res, medio de extracto de levadura de triptona glucosa, agar de jugo de tomate, y medio Kang-Fung. Estos y otros medios nutrientes son adecuados para uso en dispositivos y métodos de la presente descripción, siempre que los componentes del medio nutriente no interfieran con la detección (ya sea visual o automatizada) de un cambio en el indicador de pH debido a la producción de ácido por los microorganismos. Medios nutrientes adecuados incluyen medios que, después de la preparación, varían de conformidad con su pH respectivo. Por ejemplo, el medio de extracto de carne de res de triptona glucosa puede tener un pH de aproximadamente 7.0 ± 0.2, el medio APT puede tener un pH de aproximadamente 6.7 ± 0.2, el medio MRS puede tener un pH de aproximadamente 6.5 ± 0.2, el agar de jugo de tomate puede tener un pH de aproximadamente 6.1 ± 0.2.

En una modalidad preferida, el pH del medio nutriente puede ser ajustado a un pH inferior. Por ejemplo, en la industria cervecera, es deseable tener un medio nutriente con un pH de menos de aproximadamente 6.8 y mayor de aproximadamente 3.5+/ -0.2. En una modalidad particularmente preferida, un medio nutriente de MRS para la detección de bacterias que producen ácido, particularmente LAB, en cerveza puede tener un pH de 5.8+/- 0.2. En otra modalidad preferida el medio nutriente puede tener un pH de 6.5+/-0.2.

Indicadores adecuados para uso en dispositivos y métodos de la presente descripción incluyen indicadores de pH con un intervalo de transición que se extiende por debajo de pH 7.0. Ejemplos no limitantes de indicadores de pH adecuados incluyen compuestos halocrómicos con un intervalo de pH de transición que se extiende por debajo del pH del medio de cultivo inoculado. Un indicador de pH adecuado tendrá un intervalo de pH de transición que se extiende lo suficiente por debajo del pH del medio inoculado para detectar (visualmente y/o usando un sistema de imagen) un cambio en el indicador de pH en o adyacente a una colonia de crecimiento de bacterias que producen ácido. Preferiblemente, el indicador de pH tendrá un intervalo de pH de transición con un punto final bajo que no es menos de 0.25 pH unidades por debajo del pH del medio de cultivo inoculado. Más preferiblemente, el indicador de pH tendrá un intervalo de pH de transición con un punto final bajo que no es menos de 0.5 pH unidades por debajo del pH del medio de cultivo inoculado. Aún más preferiblemente, el indicador de pH tendrá un intervalo de pH de transición que se extiende no menos de 1.0 pH unidades por debajo del pH del medio de cultivo inoculado. Muy preferiblemente, el indicador de pH tendrá un intervalo de pH de transición con un punto final bajo que es aproximadamente 3.5. Ejemplos no limitantes de indicadores de pH adecuados incluyen bromocresol púrpura, bromocresol azul, clorofenol rojo, y bromocresol verde.

Una clase útil ejemplar de indicadores incluye tintes que son metabolizados por, o de otro modo reaccionan con, el crecimiento de microorganismos, y haciendo esto causan que las colonias microbianas sean coloreadas o fluorescentes para fácil detección y/o cuantificación por un especialista o por un lector automatizado. Ejemplos no limitantes de tales tintes incluyen cloruro de trifeniltetrazolio, p-toliltetrazolio rojo, tetrazolio violeta, veratril tetrazolio azul, y sal de 5 -bromo-4 -cloro-3 - indolilfosfato disódico. Sin embargo, se apreciará que otros tintes adecuados pueden ser usados dependiendo del (los) organismo (s) particulares a ser identificados. Se apreciará por una persona de habilidad ordinaria en la técnica que cualquier indicador, tinte, agente selectivo, sustrato enzimático o nutriente usado de conformidad con la presente invención sustancialmente no debe interferir con la observación y/o formación de imagen del indicador de pH descrito en la presente.

Un agente ajustador de pH tal como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio puede ser usado en algunas modalidades para ajustar el pH de ya sea el medio o la muestra preparada. En una modalidad alternativa, un reactivo amortiguador, tal como carbonato de sodio, puede ser empleado para proporcionar un medio que exhibe un pH neutral y se puede emplear "Cab-O-Sil M-5" como un auxiliar de procesamiento, como se describe en la Patente Estadounidense No. 4,565,783, la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Por supuesto, la mezcla de recubrimiento particular (por ejemplo, nutrientes, indicadores, y/o agentes gelificantes) usados para el polvo 116 puede ser ajustada dependiendo del tipo de microorganismos que se hacen crecer.

Se contempla que artículos de la presente descripción pueden incluir indicadores diferenciales. Como se usa en la presente, "indicador diferencial" se refiere a un reactivo agregado al medio que indicará la presencia de ciertos microorganismos y no de otros microorganismos. Ejemplos no limitantes de indicadores diferenciales incluyen tintes (por ejemplo, manchas, indicadores de pH, indicadores redox) , sustratos enzimáticos (por ejemplo, sustratos cromogénicos o fluorogénicos para fosfatasas, glicosidasas , peptidasas, nucleasas, lipasas, y similares), y nutrientes específicos (por ejemplo, carbohidratos fermentables , aminoácidos), los cuales, cuando se metabolizan por ciertos microorganismos, producen una reacción detectable (por ejemplo un indicador de pH que cambia el color dentro o adyacente a una colonia) .

En algunas modalidades, uno o más indicadores diferenciales pueden ser agregados al dispositivo de cultivo de película delgada en la composición a base de agua que es recubierta sobre el sustrato. En algunas modalidades, uno o más indicadores diferenciales pueden ser agregados a la muestra líquida que se agrega al dispositivo de cultivo. En algunas modalidades, uno o más indicadores diferenciales pueden ser agregados al dispositivo de cultivo, después de la hidratacion del dispositivo de cultivo. Un ejemplo de un método que involucra el uso de un indicador diferencial agregado al dispositivo de cultivo después de la hidratacion es el método en donde se agrega un artículo para la detección de termonucleasa al dispositivo de cultivo después de la incubación tal como se describe en la Patente Estadounidense No. 6,022,682 la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.

También se contempla dentro del alcance de la invención que el polvo 116 puede incluir opcionalmente reactivos necesarios para llevar a cabo ciertas pruebas bioquímicas para identificación de microorganismos. Tales reactivos (por ejemplo, un sustrato enzimático) , los cuales sufren un cambio de color en la presencia de un tipo particular de microorganismo, pueden ser incluidos en el polvo 116 o adhesivo 114.

En otra modalidad de la invención, el polvo 116 puede comprender un recubrimiento que incluye una mezcla de un agente gelificante y un nutriente, un agente selectivo, y/o un indicador (por ejemplo, un indicador redox, un indicador de pH, un sustrato enzimático) el cual ha sido disuelto o suspendido en una solución, recubierto y secado sobre el sustrato 112. En esta modalidad, el recubrimiento es sustancialmente libre de agua (es decir, el recubrimiento tiene un contenido de agua no mayor de aproximadamente el contenido de agua del recubrimiento deshidratado una vez que se le ha permitido equilibrar con el medio ambiente) .

En otra modalidad preferida de la invención, el polvo 116 puede comprender un recubrimiento que incluye una mezcla de un agente gelificante seco, indicador de pH, carbohidrato, agente antifúngico opcional, otros indicadores, y/o otros nutrientes los cuales han sido disueltos o suspendidos en una solución, recubiertos y secados sobre el sustrato 112. En esta modalidad, el recubrimiento es sustancialmente libre de agua.

Como se representa en la FIG.l, el miembro de cuerpo puede incluir un espaciador 118 aplicado a la superficie superior del sustrato 112, el espaciador 118 comprende un corte de apertura circular 120 a través del centro para exponer el polvo 116 en el sustrato 112. Las paredes de la apertura 120 proporcionan una cavidad de un tamaño y forma predeterminado para confinar el medio después de la hidratación. La apertura 120 en general delinea el área de crecimiento del dispositivo de cultivo 110. El espaciador 118 debe ser bastante grueso para formar una cavidad del volumen deseado, por ejemplo, 1, 2 o 3 mililitros. La espuma de polietileno de celda cerrada o espuma de poliestireno son materiales preferidos para el espaciador 118, pero cualquier material el cual es hidrofóbico (no humectante) , inerte a microorganismos, y capaz de soportar esterilización, puede ser usado. En algunas modalidades (no mostradas), el espaciador 118 puede comprender una pluralidad de aperturas 20 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, o 20 aperturas) , cada una de las cuales puede ser inoculada con una muestra líquida distinta.

El espaciador 118 puede incluir diseños relativamente gruesos, tales como aquellos descritos en la Patente Estadounidense No. 5,681,712, la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Un propósito del espaciador de apertura más gruesa 118 es para localizar y proteger membranas (por ejemplo, membranas de filtro microporoso) colocadas en la apertura 120 del espaciador 118 (no mostrado) . Otro propósito del espaciador más grueso 118 es reducir o prevenir el contacto por la lámina de cubierta 122 con las colonias de crecimiento de microorganismos (es decir, proporcionan un "espacio de cabeza" entre la superficie de crecimiento y la lámina de cubierta 122, el cual también puede proporcionar aireación incrementada para el crecimiento de colonias de microorganismos) .

El espesor del espaciador 118 debe ser suficiente para encerrar el volumen de líquido agregado al dispositivo de cultivo cuando el dispositivo es inoculado. Dependiendo del espesor de la membrana, cuando se usa, el espaciador puede ser al menos de aproximadamente 0.5 mm de espesor, aproximadamente 1 mm de espesor, aproximadamente 1.5 mm .de espesor y aproximadamente 2 mm de espesor.

La FIG. 3 muestra otra modalidad de un dispositivo de cultivo de película delgada 310. Esta modalidad incluye el sustrato 312, adhesivo 314, polvo soluble en agua fría 316, y lámina de cubierta 322, como se describe en la FIG. 1. En algunas modalidades, el indicador de pH puede ser incluido en el polvo soluble en agua fría 316. Contrario al dispositivo de cultivo 110 de la FIG. 1, el dispositivo 310 de la FIG. 3 no incluye un espaciador para confinar la muestra durante la inoculación. Una plantilla, por ejemplo, un anillo de peso (no mostrado) puede ser aplicado temporalmente al exterior de la lámina de cubierta 322, después de cerrarla, para confinar la muestra a una región específica mientras el polvo soluble en agua fría 316 forma un gel . La porción del dispositivo de cultivo 310 inoculada en una muestra en general delinea un área de crecimiento del dispositivo 310. En algunas modalidades, el dispositivo 310 puede ser inoculado con una pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, o 20) de distintas muestras líquidas, usando espaciamiento y plantillas apropiadas para confinar las muestras separadas a distintas porciones del polvo 316 del dispositivo de cultivo 310. Cuando se hidrata con una solución acuosa (por ejemplo, la muestra y/o un medio de suspensión acuoso, tal como agua o un amortiguador) , el polvo soluble en agua fría que comprende un agente gelificante forma un hidrogel .

En una modalidad, un dispositivo de placa de cultivo de película delgada se puede elaborar produciendo una mezcla de recubrimiento líquido, recubrir la mezcla de recubrimiento líquido sobre un sustrato, secar el sustrato recubierto y, opcionalmente , unir una lámina de cubierta de conformidad con los procesos descritos en la Patente Estadounidense No. 4,565,783, por ejemplo. Un dispositivo ejemplar de esta modalidad se muestra en la FIG. 4. El dispositivo de cultivo de película delgada 410 incluye un miembro de cuerpo 411 que tiene un sustrato resistente al agua, de auto-soporte 412 que tiene superficies superior e inferior 412a y 412b, respectivamente. El sustrato 412 es preferiblemente un material relativamente rígido elaborado de un material resistente al agua que no absorbe agua tal como poliéster, polipropileno o poliestireno . Otros materiales resistentes al agua adecuados incluyen sustratos tales como papel que contiene un recubrimiento de polietileno resistente al agua. La superficie superior 412a es recubierta con una composición líquida, la cual es entonces secada para proporcionar un recubrimiento seco 416 en el substrato 412. El recubrimiento seco 416 comprende un agente gelificante soluble en agua fría como se describe en la presente y también puede incluir un nutriente tal como carbohidrato, un agente selectivo tal como un antibiótico o antimicótico, un indicador, un indicador de pH, o una combinación de cualquiera de los dos o más de los anteriores. La composición líquida usada para producir el recubrimiento seco 416 puede ser fácilmente seca calentando la composición líquida en un horno a aproximadamente 220°F (104.44°C) hasta que esencialmente toda el agua en la composición se ha evaporado. Si la composición se calienta después de que el agua se ha evaporado, sin embargo, ciertos componentes de la composición (por ejemplo, nutrientes, indicadores) pueden comenzar a degradarse. En uso, el recubrimiento seco 416 se hidrata con un líquido (por ejemplo, una muestra líquida y/o un medio nutriente líquido) para formar una composición líquida reconstituida. Cuando se refiere al pH de un medio de cultivo o medio nutriente en forma seca, el pH se mide con referencia al recubrimiento seco aplicable después de ser rehidratado con agua desionizada.

Una capa de adhesivo 414 puede ser recubierta sobre el sustrato 412. El adhesivo puede servir para retener el recubrimiento seco 416 al sustrato 412. El adhesivo debe ser suficientemente transparente cuando se hidrata para permitir la observación de colonias bacterianas que crecen sobre la superficie del sustrato recubierto 412. El adhesivo debe también ser recubierto sobre el sustrato 412 en un espesor el cual permite al sustrato ser uniformemente recubierto con recubrimiento seco 416 sin incrustar completamente el recubrimiento en el adhesivo.

Un espaciador 418 que tiene una apertura en general circular 420 se adhiere al recubrimiento seco 416 y/o al sustrato 412. El espaciador 418 convierte la periferia del sustrato 412 y la apertura 420 define el área que está siendo inoculada con una muestra. El espaciador 418 circunscribe el área de crecimiento del dispositivo 410 y sirve para prevenir a una muestra líquida de derramarse del sustrato 412. En una modalidad alternativa, el dispositivo 410 puede no incluir un espaciador que contiene la muestra 418. En este dispositivo (no mostrado) , la muestra puede estar contenida en el sustrato durante la inoculación usando la plantilla circular de peso descrita anteriormente y es contenida durante la incubación por los componentes (por ejemplo, el agente gelificante) del medio solo.

Una lámina de cubierta 422 se une a un borde de una superficie superior del espaciador de espuma 418. La lámina de cubierta 422 es preferiblemente elaborada de una película transparente o material de lámina para facilitar el conteo de colonias bacterianas presentes en el sustrato. Además, la lámina de cubierta 422 es preferiblemente impermeable a bacterias y vapor de agua para evitar los riesgos de contaminación y deterioro de los componentes. Un material referido para uso como una lámina de cubierta 422 es polipropileno biaxialmente orientado. Opcionalmente , la lámina de cubierta 422 puede ser recubierta con una capa de adhesivo, la cual puede ser recubierta con una composición seca (por ejemplo, polvos) que comprende un agente gelificante, nutrientes, agentes selectivos, un indicador (por ejemplo, un indicador de H) , o una combinación de cualquiera de los dos o más de los anteriores (no mostrada) .

En uso, una cantidad predeterminada de inoculo, típicamente aproximadamente un mililitro de un inoculo líquido se agrega al dispositivo ilustrado en la FIG. 4 tirando hacia atrás la lámina de cubierta y distribuyendo el inoculo sobre el recubrimiento seco 416. El inoculo puede comprender opcionalmente un nutriente, un agente selectivo, un indicador o una combinación de cualquiera de los dos o más de los anteriores. La lámina de cubierta 422 es entonces recolocada sobre el recubrimiento 417 y el inoculo es uniformemente distribuido dentro de la apertura circular del espaciador de espuma 418. Una herramienta conveniente para hacer esto es una plantilla circular de peso. Como el inoculo contacta y se distribuye en el recubrimiento 417, el recubrimiento se hidrata para formar un gel . Nutrientes presentes en el gel pueden soportar el crecimiento de microorganismos. El dispositivo inoculado es entonces incubado por un tiempo predeterminado después de lo cual el número de colonias bacterianas que crecen en el sustrato puede ser observado a través de la lámina de cubierta transparente 422 y contado.

Un elemento de captura, tal como un filtro de membrana, puede opcionalmente ser usado con el dispositivo 410. La FIG. 4 muestra un filtro de membrana 426 posicionado en la apertura 420 del espaciador 418. También se muestran colonias de microorganismos 428 que crecen sobre el filtro de membrana 426. Membranas microporosas adecuadas no interfieren sustancialmente con la producción de ácido por las bacterias que producen ácido o con la detección de ácido usando el indicador de pH . En ciertas modalidades preferidas, las membranas porosas son sustancialmente t ansparentes cuando se ponen en contacto con la composición líquida reconstituida. El filtro de membrana 426 puede ser posicionado en el dispositivo 410 antes de que el líquido se agregue al dispositivo 410 para reconstituir el recubrimiento seco 416. El filtro de membrana 426 puede ser posicionado en el dispositivo 410 después de que el líquido se agrega al dispositivo 410 para reconstituir el recubrimiento seco 416. En algunas modalidades, el filtro de membrana 426 puede comprender suficiente líquido para reconstituir el recubrimiento seco 416 cuando el filtro 426 es posicionado en el dispositivo 410.

Una mezcla de recubrimiento preferida, cuando se hidrata con un volumen predeterminado de muestra, puede comprender los ingredientes del medio de cultivo a las concentraciones mostradas en la Tabla 1. En algunas modalidades, la mezcla de recub imiento para el dispositivo de cultivo puede comprender algunos de los ingredientes mostrados en la Tabla 1 y un líquido (por ejemplo, un diluyente) que contiene la muestra, puede comprender algunos o todos los ingredientes restantes mostrados en la Tabla 1. De este modo, la adición de los ingredientes en el dispositivo de cultivo y los ingredientes en el diluyente pueden resultar en el medio de cultivo mostrado en la Tabla 1. En una modalidad, la mezcla de recubrimiento comprende todos los ingredientes .

Tabla 1. Composición de un medio de cultivo ej emplar .

Ingrediente Cantidad (miligramos/mL) Triptona 3.3 Proteosa peptona No. 3 10 Bacto Peptamina 10 Extracto de Levadura 7.3 Dextrosa 20.6 Piruvato de Sodio 6.6 Extracto de Carne de Res 15 K2HP0„ 3.3 KH2P04 0.4 Clorofenol rojo 0.21 Polisorbato 80 6.0 Citrato de amonio 2.0 Acetato de sodio 5.0 Sulfato de magnesio 0.1 Sulfato de manganeso 0.05 Lecitina 0.7 Cloruro de sodio 5 Goma guar 25-50 El medio de cultivo de la presente invención puede incluir nutrientes, sales e iones en general adecuados para promover el crecimiento del microorganismo objetivo (por ejemplo, que produce ácido láctico) cuando el medio de cultivo es inoculado con una muestra sospechosa de contener los microorganismos objetivo. El medio de cultivo puede incluir componentes del medio que se usan para cultivar las bacterias que producen ácido. Medio ejemplar para el crecimiento de bacterias que producen ácido incluye, sin limitación, medio MRS, medio MRS acidificado, medio MRS acidificado con fructuosa, medio MRS modificado, medio HHD, medio APT, medio APT con sacarosa, medio APT con glucosa, Agar de Cerveza Universal (UBA) , medio Nachweis fur Bierschadlichen Bakterien (NBB) , y Raka-Ray.

Tabla 2 - Composición de un medio de cultivo de MRS ej emplar Ingrediente Gramos por litro Digestión pancreática de Gelatina 10 mg Extracto de Cerveza 8 mg Extracto de Levadura 4 mg Dextrosa 20 mg Fosfato dipotásico 2 mg Polisorbato 80 1 mg Acetato de sodio 5 mg Citrato de amonio 2 mg Citrato de magnesio 0.2 mg Citrato de manganeso 0.05 mg El medio de cultivo que contiene componentes tales como, por ejemplo, nutrientes, sales, iones, agentes selectivos, indicadores, y similares, puede ser probado con bacterias conocidas que producen ácido para determinar que componentes promueven el crecimiento del microorganismo objetivo, inhiben el crecimiento de microorganismos no objetivo, y/o no interfieren con la producción de ácido por las bacterias que producen ácido o con la detección de ácido láctico usando el indicador de pH. El medio de cultivo también puede incluir uno o más agentes gelificantes . El medio de cultivo de la presente descripción puede incluir al menos un agente selectivo que se selecciona para el crecimiento de bacterias que producen ácido.

Opcionalmente, el medio de cultivo puede comprender un amortiguador. Amortiguadores adecuados incluyen amortiguadores de fosfato. En algunas modalidades, el amortiguador de carbonato es un amortiguador de carbonato de sodio. En algunas modalidades, el amortiguador de fosfato es un amortiguador de fosfato de potasio. En algunas modalidades, el medio de cultivo puede comprender más de un agente amortiguador (por ejemplo, fosfato de potasio y acetato de sodio) . El amortiguador de fosfato puede ser aproximadamente 22 mM. Otros amortiguadores adecuados incluyen Amortiguador Butterfields , y agua de peptona .

Para algunos cultivos, la combinación de un amortiguador usado con un medio de cultivo particular puede ser ventajosa. Por ejemplo, el medio de MRS con una solución amortiguadora de agua de peptona al 1% se ha encontrado útil para algunas -bacterias que producen ácido.

La concentración de cada componente en el medio de cultivo se selecciona para proporcionar una concentración adecuada para crecimiento y/o detección de los microorganismos objetivo después de que el dispositivo de cultivo se ha inoculado. Concentraciones adecuadas de nutrientes y agentes selectivos para el crecimiento de bacterias que producen ácido en el medio de cultivo se conocen en la técnica.

Concentraciones adecuadas de indicadores de pHs pueden ser influenciadas por sus propiedades intrínsecas (por ejemplo, solubilidad y sus propiedades inhibidoras potenciales hacia ciertos microorganismos objetivos) . Por ejemplo, clorofenol rojo puede ser usado en el medio de cultivo a una concentración de aproximadamente 0.25 mM hasta aproximadamente 0.75 mM. Preferiblemente, clorofenol rojo puede ser usado en el medio de cultivo a una concentración de aproximadamente 0.5 mM. También por ejemplo, bromocresol púrpura o bromocresol verde pueden ser usados en el medio de cultivo a una concentración de aproximadamente 0.5 mM.

La selección de microorganismos objetivos puede incluir inhibir el crecimiento de microorganismos no objetivo, promoviendo el crecimiento de microorganismos no objetivo o ambos. Se puede proporcionar promoción del crecimiento de microorganismos objetivo por al menos un primer agente selectivo ya sea directamente (por ejemplo, un nutriente que puede ser usado por microorganismos objetivo y no por otros microorganismos) , indirectamente (por ejemplo, reduciendo la competición de nutrientes inhibiendo los microorganismos no objetivo) , o ambos directamente e indirectamente. Cualquier elemento, radical, ión, o compuesto que se selecciona para el crecimiento de microorganismos objetivo puede ser adecuado para uso como un agente selectivo. Por ejemplo, agentes selectivos adecuados para bacterias que producen ácido incluyen pero no se limitan a Tween 80, nitrito de sodio, polimixina B, y cualquier combinación de dos o más de los mencionados anteriormente.

Un medio de cultivo seco de conformidad con la presente invención puede ser aplicado a una o más superficies de un dispositivo de cultivo de película delgada en la siguiente manera. Los componentes del medio de cultivo pueden ser disueltos en un solvente (por ejemplo, agua) . La solución resultante puede entonces ser recubierta sobre una o más superficies del dispositivo. El recubrimiento se deja entonces secar, dejando el medio de cultivo seco sobre las superficies del dispositivo que han sido recubiertas con la solución del medio de cultivo. El recubrimiento se puede secar en cualquier manera que incluye, pero no se limita a, secado en aire y calentamiento.

La cantidad de cada componente del medio de cultivo seco es al menos parcialmente determinada por al menos dos factores: (1) la concentración de tal componente en la solución del medio de - cultivo, y (2) la cantidad de la solución recubierta sobre un área de superficie dada del dispositivo de cultivo (el peso del recubrimiento) . Los pesos de recubrimiento adecuados pueden variar desde aproximadamente 0.45 mg/cm2 hasta aproximadamente 2.5 mg/cm2. En algunas modalidades, los nutrientes del medio de cultivo pueden ser recubiertos separadamente de los indicadores . En tales modalidades, el peso del recubrimiento para los nutrientes del medio de cultivo puede variar desde aproximadamente 1.6 mg/cm2 hasta aproximadamente 2.5 mg/cm2. En una modalidad, el peso del recubrimiento del recubrimiento de nutriente es aproximadamente 2.1 mg/cm2. El peso del recubrimiento para el recubrimiento indicador puede variar desde aproximadamente 0.45 mglcm2 hasta aproximadamente 0.84 mg/cm2. En una modalidad, el peso del recubrimiento del recubrimiento indicador es aproximadamente 0.62 mg/cm2.

Aunque las modalidades ilustradas en las FIGS . 1-4 tienen una lámina de cubierta unida al dispositivo, también se contempla dentro del alcance de la invención que las modalidades que contienen polvo pueden ser no cubiertas y simplemente colocadas en un ambiente estéril durante el almacenaje e incubación.

Muestras Muestras de prueba adecuadas se pueden derivar de cualquier fuente. Las muestras de interés pueden incluir líquidos (por ejemplo, bebidas, corrientes de proceso, agua, cerveza), sólidos (por ejemplo, ingredientes alimenticios, plantas, carne, aire, superficies (por ejemplo, pisos, paredes, instrumentos, equipo de procesamiento de alimentos) y similares. Las muestras también pueden incluir células cultivadas (por ejemplo, cultivos bacterianos, caldos enriquecidos) . Se conocen varias técnicas de muestreo para la detección de microbios sobre las superficies. Tales técnicas de muestreo son adecuadas para los métodos de la presente invención también. Por ejemplo, es común obtener una muestra del limpiar la superficie de equipo de procesamiento de alimentos o de limpiar las fosas nasales de un paciente. Una técnica de muestreo particularmente preferida incluye poner en contacto (por ejemplo, tallando, limpiando) la superficie con un hisopo estéril, esponja, o dispositivo de muestreo.

Una amplia variedad de hisopos u otros dispositivos de recolección de muestra son comercialmente disponibles, por ejemplo, de 3M Company, St . Paul MN, bajo la designación comercial 3M™ Quick Swab, de Puritan Medical Products Co . LLC, Guilford, ME, bajo la designación comercial PURE-WRAPS o de Copan Diagnostics, Inc. Corona, CA, bajo la designación comercial ESWAB, o de microRheologics , S.r.L, Brescia, IT, bajo la designación comercial FLOCKEDS WAB . Un medio de recolección de muestra tal como aquel descrito, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5,879,635 (Nason) también puede ser usado si se desea. Los hisopos pueden ser de una variedad de materiales que incluyen algodón, rayón, alginato de calcio, Dacrón, poliéster, nylon, poliuretano, y similares .

El dispositivo de recolección de muestra (por ejemplo, hisopo) puede ser cultivado directamente, analizado directamente, o extraído (por ejemplo, por lavado, elución por vórtices) con una solución apropiada. Tales solución de extracción (es decir, elución) , típicamente incluyen agua y opcionalmente pueden incluir un amortiguador y al menos un tensoactivo. Un ejemplo de un amortiguador de elución incluye, por ejemplo, salina amortiguada de fosfato (PBS) , la cual puede ser usada en combinación, por ejemplo, con T EEN 20 o PLURONIC L6 . La muestra de prueba (por ejemplo, líquida) puede ser sometida a tratamiento previo al análisis adicional. Este incluye concentración, precipitación, filtración, centrifugación, diálisis, dilución, inactivación de componentes naturales, adición de reactivos, tratamiento químico, etc. £1emen o de Captura Dispositivos de placa de cultivo de la presente descripción pueden ser usados con un elemento de captura para detectar microorganismos que producen ácido presentes en una muestra. Como se usa en la presente, "elemento de captura" se refiere a un artículo que se usa para capturar y retener microorganismos que están presentes en una muestra. En algunas modalidades, los elementos de captura pueden ser puestos en contacto temporalmente con los dispositivos de placa de cultivo de película delgada descritos en la presente. Por ejemplo, la muestra puede ser capturada en un lado del filtro de la superficie y tal lado del filtro puede ser puesto en contacto con el área de crecimiento del dispositivo de placa de cultivo de película delgada, y con ello transferir el material de muestra al área de crecimiento, después que el dispositivo de la placa de cultivo se ha hidratado. El filtro de superficie puede entonces ser removido del dispositivo previo a incubar el dispositivo. El elemento de captura (por ejemplo, un filtro de membrana) puede ser dimensionado para permitirle ser colocado en un dispositivo de placa de cultivo de película delgada de la presente invención y, en ciertas modalidades preferidas, el elemento de captura permanece en el dispositivo de placa de cultivo de película delgada durante el periodo de incubación por un periodo suficiente para permitir al menos una división celular del microorganismo objetivo. La colocación del elemento de captura en el dispositivo de placa de cultivo puede llevar al elemento de captura en contacto con un agente gelificante y/o un medio de cultivo, si está presente, en el dispositivo de placa de cultivo, permitiendo crecer y/o proliferar los microorganismos. En algunas modalidades, el dispositivo de la placa de cultivo se hidrata (por ejemplo, inocula con un líquido estéril o una muestra de líquido desconocido) antes de que el elemento de captura se coloque en el dispositivo de la placa de cultivo. En algunas modalidades, el dispositivo de la placa de cultivo se hidrata después de que el elemento de captura se coloca en el dispositivo de la placa de cultivo .

Los elementos de captura pueden ser seleccionados por su adecuabilidad con ciertos tipos de muestras. Por ejemplo, se pueden usar filtros de membrana microporosa como elementos de captura para retener microorganismos presentes en una muestra líquida. La muestra líquida se puede pasar a través del filtro y los microorganismos pueden ser retenidos en esta. Los microorganismos pueden ser retenidos mediante, por ejemplo, atrapamiento físico o interacción química específica (por ejemplo, interacción antígeno-anticuerpo o ligando-receptor) o no específica (adsorción hidrofóbica) . Las membranas microporosas de la presente descripción, cuando están presentes en el dispositivo de placa de cultivo de película delgada, deben permitir la observación de una reacción hemolítica. Los filtros de membrana microporosa preferidos llegan a ser sustancialmente transparentes cuando se humedecen. Con referencia a la modalidad mostrada en la FIG. 4, la muestra de prueba puede comprender un inoculo líquido y/o un elemento de captura 426 tal como un filtro microporoso (por ejemplo, una membrana de filtro) o un dispositivo limpiador. El elemento de captura 426 puede ser construido de varas membranas y/o películas y se puede usar para capturar microorganismos. En algunas modalidades, el elemento de captura 426 puede proporcionar una superficie en la cual las colonias de microorganismos se pueden hacer crecer, detectar y/o enumerar por el método y dispositivos de la invención. Particularmente adecuados son filtros microporosos conocidos los cuales han sido comúnmente usados para separar poblaciones pequeñas de microorganismos, tales como bacterias de grandes muestras de fluido. Tales filtros se conocen por ser colocados en la superficie de medio agar e incuban para permitir la continuación y evaluación de los microbios filtrados. Los filtros adecuados incluyen la serie HAWG, por ejemplo, filtro tipo HA HAWG 047S6, disponible de Millipore Corp (Marlborough, MA) . Los filtros de microorganismos descritos en la presente son en general relativamente delgados y pueden ser proporcionados en cualquier forma 2 -dimensional deseada, por ejemplo, como rectángulos, como discos (que incluyen discos parciales) y similares .

Los microorganismos 'son separados por tales filtros con eficacia variante dependiendo de los tamaños de los poros en las membranas. Las bacterias son típicamente capturadas por filtros que tienen un diámetro de poro mediano de menos de aproximadamente ?µp?, menos de aproximadamente 0.8 µp?, preferiblemente, menos de aproximadamente 0.45 µ?t?, más preferiblemente, igual a o menor de aproximadamente 0.2µp\. La filtración se lleva a cabo por métodos convencionales usando métodos asistidos por vacío o gravedad con embudos y discos de tamaño adecuado. Los filtros de membrana son preferiblemente manipulados asépticamente con pinzas. Los filtros de membrana pueden ser elaborados por el usuario a partir de materiales comercialmente disponibles o son proporcionados en paquetes estériles como entidades separadas o como partes de kits de la invención.

Se pueden usar dispositivos limpiadores como elementos de captura con los dispositivos de la placa de cultivo de la presente descripción. Como se usa en la presente, un "dispositivo limpiador" es un artículo que está configurado para poner en contacto una superficie para obtener una muestra de microorganismos dispuestos en esta. Los dispositivos limpiadores pueden incluir materiales porosos, no tejidos. Ejemplos no limitantes de materiales limpiadores incluyen papel (por ejemplo, papel filtro, filtros de membrana celulósica) , membranas sintéticas no tejidas (por ejemplo, no tejidas de nylon o poliéster) , poliméricas o cerámicas (por ejemplo, membranas de policarbonato, membranas de zirconia) , y películas microestructuradas (por ejemplo, películas que contienen microcanales tales como aquellas descritas en la Patente Estadounidense No. 7,223,364, la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) . En algunas modalidades, las películas que contienen microcanales comprenden agujeros que permiten el pasaje de líquido (y solutos o partículas pequeñas) de una superficie mayor de la película a la otra superficie mayor. Dispositivos limpiadores pueden incluir químicos (por ejemplo, tensoactivos) , para mejorar la humectabilidad, o reactivos (por ejemplo, manchas diferenciales) , siempre que el químico o reactivos no afecten adversamente la detección de zonas ácidas adyacentes a las colonias de bacterias lácticas que producen ácido. Los dispositivos limpiadores en general comprenden químicos en una cantidad que no inhibirá sustancialmente el crecimiento de microorganismos bajo las condiciones de inoculación e incubación descritas en la presente. En algunas modalidades, los elementos de captura son sustancialmente transparentes o llegan a ser sustancialmente transparentes cuando se humedecen, permitiendo la visualización de una reacción diferencial, tal como hemolisis, a través del elemento de captura .

Los elementos de captura adecuados incluyen una partícula, o una pluralidad de partículas. Los elementos de captura pueden incluir un medio para el acoplamiento del elemento de captura a los microorganismos. Ejemplos no limitantes de partículas incluyen microesferas , microperlillas , y similares. Tales partículas pueden ser partículas de resina, por ejemplo, agarosa, látex, poliestireno , nylon, poliacrilamida, celulosa, polisacárido, o una combinación de los mismos, o partículas inorgánicas, por ejemplo, sílice, óxido de aluminio, o una combinación de los mismos. Tales partículas pueden ser magnéticas, paramagnéticas , superparamagnéticas o no magnéticas. Tales partículas pueden ser coloidales en tamaño, por ejemplo aproximadamente 100 nm hasta aproximadamente 10 mieras (pm) . Ejemplos no limitantes de tales partículas incluyen partículas poliméricas superparamagnéticas vendidas bajo los nombres comerciales DYNABEADS (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y BIO-ADEMBEADS (Ademtech, Pessac, France) . Los elementos de captura de partícula pueden ser incorporados en otras estructuras, tales como una membrana microporosa.

Existe una variedad de medios para acoplar el elemento de captura (por ejemplo, una partícula) a un microorganismo. En algunas modalidades, los medios para el acoplamiento del elemento de captura al microorganismo pueden incluir moléculas de la superficie o propiedades que promueven la absorción no específica. Por ejemplo, al menos una porción del elemento de captura puede tener moléculas en su superficie que, bajo las condiciones apropiadas (por ejemplo, pH alto o pH bajo) , llegan a ser positivamente o negativamente cargadas y no específicamente se adsorben a moléculas complementarias cargadas asociadas con la superficie de un microorganismo.

Adicionalmente , o alternativamente, al menos una porción del elemento de captura (por ejemplo, una partícula de poliestireno) , puede tener una superficie hidrofóbica la cual no se adsorbe específicamente a moléculas hidrofóbicas asociadas con la superficie de un microorganismo. En algunas modalidades, los medios para el acoplamiento de un elemento de captura a un microorganismo pueden comprender una molécula que se enlaza específicamente a un microorganismo a través de una interacción ligando-receptor. Tales interacciones específicas de ligando-receptor son bien conocidas en la técnica e incluyen interacciones entre, por ejemplo, anticuerpos y sus antígenos correspondientes, lectinas y su patrón de enlace a carbohidrato correspondiente, proteínas del bacteriófago y sus receptores fago correspondientes, y similares. Se debe entender que los medios para el acoplamiento de una partícula a un microorganismo también pueden ser usados en conjunto con película o elementos de captura no tejidos (por ejemplo, filtro), así como también los elementos de captura de partícula.

Las placas delgadas de la invención son típicamente desinfectadas o esterilizadas antes del uso.

Métodos para Detectar Bacterias que producen Ácido en una Muestra La presente descripción proporciona métodos para detectar bacterias que producen ácido en una muestra. En algunas modalidades, el método comprende proporcionar un dispositivo de cultivo de película delgada que incluye un agente gelificante soluble en agua fría, una lámina de cubierta, un medio de cultivo para soportar el crecimiento e identificación de bacterias que producen ácido, un indicador de pH, y una muestra líquida sospechosa de contener bacterias que producen ácido. En algunas modalidades, el dispositivo de cultivo puede comprender el medio de cultivo. Adicionalmente , o alternativamente, el dispositivo de cultivo puede comprender el indicador de pH.

El método además comprende inocular el dispositivo de cultivo con un volumen de líquido predeterminado y de este modo formar un hidrogel que comprende el medio de cultivo, el indicador de pH, el agente antifúngico opcional, y la muestra líquida. La lámina de cubierta, si está presente en el dispositivo de cultivo de película delgada, se separa (por ejemplo, inclina) del sustrato cuando el dispositivo es inoculado con el volumen de líquido pre-determinado . El volumen de líquido pre-determinado puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1 mililitro, aproximadamente 2 mililitros, aproximadamente 3 mililitros, o aproximadamente 5 mililitros.

El volumen de líquido pre-determinado comprende la muestra, el medio de cultivo, el indicador de pH y, opcionalmente , un diluyente acuoso tal como agua, una solución salina, o un amortiguador. Los componentes del volumen líquido predeterminado (es decir, la muestra, el medio de cultivo, el indicador de pH, y el diluyente acuoso opcional) pueden ser agregados al dispositivo de cultivo separadamente o pueden ser agregados al dispositivo de cultivo en mezclas de dos o más componentes (por ejemplo, la muestra puede ser mezclada con un medio de cultivo tal como, por ejemplo, caldo MRS o caldo Letheen y/o la muestra puede ser mezclada con un indicador de pH y/o un diluyente) . Si los componentes son agregados separadamente, pueden ser mezclados brevemente (por ejemplo, agitados con una punta de pipeta) antes de que la lámina de cubierta se coloque sobre el área inoculada del dispositivo de cultivo. En algunas modalidades, el método comprende combinar la muestra con un diluyente capaz de neutralizar un desinfectante químico. El caldo Letheen, por ejemplo, puede ser usado como un diluyente en métodos de conformidad con la presente descripción. El caldo Letheen comprende lecitina y POLISORBATO 80, los cuales son capaces de neutralizar desinfectantes comúnmente usados tales como compuestos de amina cuaternaria, por ejemplo.

El método además comprende incubar el dispositivo de cultivo por un periodo de tiempo. Las condiciones de incubación (por ejemplo, la temperatura de incubación) pueden afectar la tasa de crecimiento de las bacterias que producen ácido y puede afectar los tipos de bacterias que son detectadas. Por ejemplo, la incubación a temperaturas inferiores (por ejemplo, aproximadamente 25°C) puede permitir la detección de bacterias psicotrópicas) . La incubación a temperaturas superiores (por ejemplo, aproximadamente 30° C, aproximadamente 32° C, aproximadamente 35° C) puede facilitar el rápido crecimiento de ciertas bacterias que producen ácido.

En algunas modalidades, el dispositivo de cultivo es incubado anaeróbicamente , ya sea en 100% de gas de dióxido de carbono u otros medios conocidos para crear condiciones anaeróbicas para incubación. El dispositivo de cultivo también puede ser incubado bajo condiciones aeróbicas.

El dispositivo de cultivo puede ser incubado hasta que se observa la evidencia de colonias bacterianas que producen ácido. La evidencia de colonias bacterianas que producen ácido incluye una zona de ácido detectable (es decir, observando un cambio detectable en un indicador de pH) y/o dentro y/o adyacente a una colonia. En algunas modalidades, bacterias que producen ácido pueden ser además detectadas y diferenciadas por la presencia de una burbuja de gas adyacente a la colonia. La zona ácida puede ser observable en la ausencia de una colonia bacteriana visible.

En general, una zona ácida aparece en o adyacente a una colonia bacteriana que produce ácido antes de que una burbuja de gas asociada con la colonia sea observable.

En algunas modalidades, el dispositivo de cultivo puede ser incubado por al menos aproximadamente 16 horas, al menos aproximadamente 18 horas, al menos aproximadamente 24 horas, o al menos aproximadamente 48 horas. En algunas modalidades, el dispositivo de cultivo puede ser incubado no más de aproximadamente 24 horas, no más de aproximadamente 48 horas, o no más de aproximadamente 72 horas. En ciertas modalidades preferidas, el dispositivo de cultivo es incubado aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 48 horas. En otras modalidades preferidas, el dispositivo de cultivo es incubado aproximadamente 5 días, y tan largo como 7 a 10 días.

El método además comprende detectar la presencia o ausencia de un microorganismo. Bacterias que producen ácido se pueden detectar como se describe en la presente. Después de un periodo de incubación adecuado, la ausencia de un microorganismo se puede detectar en un dispositivo de cultivo por la ausencia de colonias observables, sin cambio en un indicador de crecimiento (por ejemplo, el indicador de pH, un sustrato de enzima cromogénica, un indicador redox tal como TTC) y la ausencia de burbujas de gas asociadas con el metabolismo de carbohidratos fermentables en el medio de crecimiento .

Una zona ácida asociada con una colonia de microorganismo puede ser detectada visualmente y/o por el uso de un sistema de imagen. Por ejemplo, en un método en donde el medio de cultivo comprende bromocresol púrpura como el indicador de pH, el medio de cultivo tendrá una apariencia púrpura o gris a aproximadamente un pH neutral. Como las bacterias que producen ácido crecen y fermentan la glucosa en el medio de cultivo, el indicador bromocresol púrpura aparecerá amarillo adyacente a las colonias de crecimiento bacteriano. Por ejemplo, en un método en donde el medio de cultivo comprende clorofenol rojo como el indicador de pH, el medio de cultivo tendrá una apariencia roja o violeta a aproximadamente un pH neutral . Como las bacterias que producen ácido crecen y fermentan la glucosa en el medio de cultivo, el indicador clorofenol rojo aparecerá amarillo adyacente al crecimiento de colonias bacterianas.

Las burbujas de gas asociadas con una colonia de microorganismos pueden ser detectadas visualmente y/o por el uso de un sistema de imagen. Las burbujas de gas pueden ser asociadas con una colonia visible y/o una zona ácida detectable por un cambio en el color del indicador de pH en una región adyacente a la colonia de microorganismos.

En cualquiera de las modalidades anteriores, el método además puede comprender proporcionar un sistema de imagen y obtener una imagen del dispositivo de cultivo. En estas modalidades, detectar la presencia o ausencia de un microorganismo comprende desplegar, imprimir, o analizar la imagen del dispositivo de cultivo. El sistema de imagen comprende un dispositivo de imagen y puede comprender un procesador. En algunas modalidades, el dispositivo de imagen puede comprender un barridor de línea o un barridor de área (por ejemplo, una cámara) . El dispositivo de imagen puede incluir un barridor monocromático (por ejemplo, negro y blanco) o uno policromático (por ejemplo, color) . Ventajosamente, los sistemas de imagen monocromáticas pueden proporcionar imágenes de resolución superior, las cuales pueden mejorar la exactitud del resultado y/o reducir el tiempo necesario para detectar la presencia de microorganismos en el dispositivo de cultivo.

En algunas modalidades, el sistema de imagen además comprende un sistema de iluminación. El sistema de iluminación puede incluir al menos una fuente de luz visible de amplio espectro (por ejemplo, una luz "blanca) . En algunas modalidades, el sistema de iluminación puede incluir al menos una fuente de luz visible de espectro estrecho (por ejemplo, un diodo que emite luz que emite una anchura de banda relativamente estrecha de luz visible tal como, por ejemplo, luz roja, verde o azul) . En ciertas modalidades, el sistema de iluminación puede incluir una fuente de luz visible de espectro estrecho (por ejemplo, un diodo que emite luz) con un pico de emisión de luz a aproximadamente 525 nm.

La imagen se puede obtener de luz reflejada por el hidrogel en el dispositivo de cultivo o la imagen se puede obtener de luz transmitida a través del hidrogel en el dispositivo de cultivo. Sistemas de imagen adecuados y sistemas de iluminación correspondientes se describen, por ejemplo, en la Solicitud Internacional de Patente No. WO 2005/024047 y Publicaciones de Solicitudes de Patente Estadounidenses Nos. US 2004/0101954 y US 2004/0102903, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Ejemplos no limitantes de sistemas de imagen adecuados incluyen lector de Placa PETRIFILM (PPR) , disponible de 3M Company (St. Paul, MN) , el Contador de Colonias PETRISCAN disponible de Spiral Biotech (Norwood, MA) , y barridores de placa PROTOCOL y ACOLYTE disponibles de Synbiosis (Cambridge, U.K.) En algunas modalidades, obtener una imagen comprende obtener una imagen desviada de longitud de onda. Por ejemplo, el sistema de imagen puede incluir un filtro desviador que desvía la luz recolectada por el dispositivo de imagen. Los elementos de filtro se conocen en la técnica e incluyen tanto "filtros de corte (es decir, filtros que permiten el pasaje de longitudes de onda de luz ya sea arriba o por debajo de una cierta longitud de onda especificada) como filtros de "paso de banda" (es decir, filtros que permiten el pasaje de las longitudes de onda de luz entre ciertos límites superior e inferior especificados) . Un filtro de desvío puede ser posicionado entre la fuente de iluminación y el dispositivo de cultivo. Alternativamente o adicionalmente , un filtro de desvío puede ser posicionado entre el dispositivo de cultivo y el dispositivo de imagen. En ciertas modalidades preferidas, obtener una imagen comprende obtener una imagen usando un filtro de desvío que selectivamente permite el pasaje de longitudes de onda rojas. En algunas modalidades, obtener una imagen comprende usar un filtro de desvío que selectivamente permite el pasaje de longitudes de onda desde aproximadamente 500 nm hasta aproximadamente 550 nm .

La FIG. 5 es un diagrama de bloque que ilustra la operación interna de un sistema de imagen 570. Como se ilustra en la FIG. 5, un dispositivo de cultivo 582 se posiciona en un plano focal (por ejemplo, en una plataforma, no mostrada), dentro del sistema de imagen. De conformidad con la invención, el dispositivo de imagen 592 puede incluir sistemas de iluminación multicolores (no mostrados) para iluminación frontal y/o posterior del dispositivo de cultivo 582, así como también un barridor de línea o área monocromático que captura una imagen del dispositivo de cultivo 582. En algunas modalidades, por ejemplo, el dispositivo de imagen 592 puede tomar la forma de una cámara monocromática, de dos dimensiones.

En general, el dispositivo de imagen 592 captura imágenes del dispositivo de cultivo 582, o al menos una porción del mismo, durante la iluminación del dispositivo de cultivo con uno o más diferentes colores de iluminación. En algunas modalidades, imágenes múltiples del mismo dispositivo de cultivo 582 pueden ser generadas con varias duraciones de iluminación o intensidades y una o más de las múltiples imágenes pueden ser seleccionadas para análisis. En algunas modalidades, la iluminación selectiva de un primer lado y un segundo lado del dispositivo de cultivo 582 se puede usar para generar imágenes múltiples del dispositivo de cultivo y una o más de las imágenes se pueden seleccionar para análisis. La selección de una imagen para análisis se puede basar en, por ejemplo, el contraste de color y/o propiedades de resolución del objeto de las imágenes individuales. Los procesos para determinar el contraste de color y propiedades de resolución del objeto de una imagen se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6,243,286, la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.

Un procesador 594 controla la operación del dispositivo imagen 592. También mostrada en la FIG. 5 está en la pantalla opcional 576, la cual puede recibir una imagen del procesador 594 para revisión visual por un operador. En operación, el procesador 594 controla el dispositivo de imagen 592 para iluminar el dispositivo de cultivo 582 y obtener una imagen. El procesador 594 recibe datos de imagen que representan la imagen explorada del dispositivo de imagen 592. En algunas modalidades, el procesador 594 puede seleccionar una imagen, de imágenes múltiples, para análisis y/o despliegue. El procesador 594 analiza al menos una imagen del dispositivo de cultivo 582 y puede producir un resultado analítico, tal como un conteo de colonias de bacterias que producen ácido o una determinación de la presencia o ausencia de bacterias que producen ácido en una muestra. El resultado analítico (por ejemplo, un resultado cualitativo o cuantitativo) se puede desplegar en la pantalla 576, almacenada en una memoria de almacenaje de datos opcional 598, o recuperada por un ordenador hospedero (no mostrado) vía puerto de comunicación opcional 595.

El método además comprende detectar bacterias que producen ácido en el dispositivo de cultivo. Detectar bacterias que producen ácido en el dispositivo de cultivo comprende analizar la imagen del dispositivo de cultivo.

La glucosa en el medio de cultivo se fermenta por bacterias que producen ácido en derivados que incluyen ácido. Debido a que la difusión del ácido lejos de los microorganismos está limitada por el hidrogel, la producción de ácido por una colonia de bacterias que producen ácido resulta en la acumulación de ácido adyacente a la colonia. Esta acumulación de ácido puede causar un cambio detectable (por ejemplo, un cambio de color) del indicador de pH en el medio de cultivo adyacente a la colonia. De este modo, analizar la imagen del dispositivo de cultivo puede comprender analizar la imagen por zonas en el medio de cultivo que tienen una composición de color diferente que al menos otra porción del hidrogel. El cambio de color será dependiente del indicador de pH en el medio de cultivo. Por ejemplo, bromocresol púrpura aparecerá púrpura en el medio de cultivo con zonas amarillas adyacentes a las colonias que están produciendo ácido láctico. El clorofenol rojo aparecerá rojo a violeta en el medio de cultivo con zonas amarillas adyacentes a las colonias que están produciendo ácido láctico. En algunas modalidades, analizar la imagen del dispositivo de cultivo puede comprender comparar el color del medio de cultivo en una o más áreas (o el área completa) del dispositivo de cultivo inoculado a otra imagen de un dispositivo de cultivo correspondiente inoculado con, por ejemplo, agua estéril (es decir, un control negativo) .

Analizar la imagen del dispositivo de cultivo puede comprender usando un sistema para detectar color y/o matices variantes de un color (por ejemplo, rojo, verde, azul, gris) en una imagen. Los sistemas de análisis de imagen adecuados incluyen el sistema de análisis de imágenes descrito en por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,448,652; 6,243,486; y 6,153,400; cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.

En ciertas modalidades, analizar la imagen del dispositivo de cultivo comprende analizar longitudes de onda seleccionadas de la imagen. En algunas modalidades, la imagen puede ser una imagen de color recolectada iluminando el dispositivo de cultivo con una fuente de luz visible de amplio espectro (por ejemplo, una luz "blanca") . En algunas modalidades, la imagen puede ser una imagen de color recolectada iluminando el dispositivo de cultivo con una pluralidad de fuentes de luz visible de espectro relativamente estrecho (por ejemplo, una combinación de diodos que emiten luz que cada uno emite una anchura de banda relativamente estrecha de luz visible tal como, por ejemplo, luz roja, verde o azul) . En algunas modalidades, la imagen puede ser una imagen compuesta hecha combinando dos o más imágenes recolectadas mientras se ilumina el dispositivo de cultivo con una fuente de luz visible de espectro relativamente estrecho (por ejemplo, luz verde) . En estas modalidades, ciertas longitudes de onda de la imagen pueden ser seleccionadas para exhibir o imprimir una imagen y/o análisis de imagen.

En algunas modalidades (por ejemplo, en donde el color del indicador de pH varía de rojo a amarillo) , las longitudes de onda seleccionadas para analizar la imagen pueden ser longitudes de onda en el intervalo de color verde (por ejemplo, longitudes de onda de aproximadamente 500 nm hasta aproximadamente 550 nm) . En algunas modalidades, las longitudes de onda seleccionadas para análisis son longitudes de onda de aproximadamente 520 nm hasta aproximadamente 530 nm . En algunas modalidades, la longitud de onda seleccionada para análisis es aproximadamente 525 nm .

Las longitudes de onda pueden ser seleccionadas, por ejemplo, usando un programa de ordenador que electrónicamente selecciona un intervalo predeterminado de longitudes de onda en la imagen para despliegue, impresión y/o análisis. Por ejemplo, una longitud de onda verde predeterminada o intervalo de longitudes de onda verde puede ser particularmente adecuada para desplegar, imprimir, o analizar una imagen de una zona coloreada de amarillo adyacente a una colonia de bacterias de ácido láctico que crecen en un medio de cultivo coloreado de rojo (por ejemplo, un medio de cultivo que comprende clorofenol rojo) . Cualquier programa de ordenador adecuado puede ser usado para seleccionar un intervalo predeterminado de longitudes de onda en una imagen. Ejemplos no limitantes de programas de ordenador adecuados incluyen el software PHOTOSHOP CS4 , disponible de Adobe Systems, Inc. (San José, CA) y software IMAGE-PRO Plus, disponible de Media Cybernetics (Silver Springs, MD) .

En ciertas modalidades, en donde la imagen del dispositivo de cultivo se ha obtenido y/o analizado en una manera que desvía la recolección en la imagen de longitudes de onda verde ya sea transmitidas a través de y/o reflejadas por el hidrogel en el dispositivo de cultivo, el contraste entre el indicador de pH (por ejemplo, el clorofenol rojo coloreado de rojo) en el medio de cultivo y la zona ácida (por ejemplo, el clorofenol rojo coloreado de amarillo) adyacente a las colonias bacterianas es significantemente mejorado. De este modo, en estas modalidades, bacterias que producen ácido son detectables a un más pronto que en métodos comparables que no desvían las longitudes de onda de la imagen que es recolectada.

Kits de la invención Kits proporcionados por la presente invención incluyen un dispositivo de cultivo que comprende un agente gelificante soluble en agua fría, un medio de cultivo para soportar el crecimiento e identificación de bacterias que producen ácido, y un indicador de pH . En algunas modalidades, el dispositivo de cultivo puede comprender el medio de cultivo para soportar el crecimiento e identificación de bacterias que producen ácido y/o el indicador de pH .

En algunas modalidades, el kit comprende un medio de cultivo deshidratado para soportar el crecimiento e identificación de bacterias que producen ácido. En algunas modalidades, el medio de cultivo deshidratado comprende un indicador de pH . En algunas modalidades, el kit comprende un medio de cultivo líquido para soportar el crecimiento e identificación de bacterias que producen ácido. En algunas modalidades, el medio de cultivo líquido comprende un indicador de pH .

Kits de la presente invención pueden comprender además un accesorio de preparación de muestra para ayudar en la preparación y/o inoculación de la muestra. Ejemplos no limitantes de accesorios de preparación de muestra incluyen un diluyente, un amortiguador, un dispositivo de adquisición de muestra (por ejemplo, un hisopo, una esponja, una espátula) , y una pipeta.

La invención será además ilustrada por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Todas las partes y porcentajes son expresados como partes en peso a menos que se indique de otro modo.

EJEMPLOS Ejemplo 1.

Detección de Bacterias de Ácido Láctico Aisladas de Muestras de Carne Procesada Usando un Indicador de pH de Clorofenol Rojo Placas de Conteo Aeróbico de 3M PETRIFILM se obtuvieron de 3M Company (St. Paul, MN) . Caldo de MRS DIFCO se obtuvo de BD-Diagnost ic Systems (Sparks, MD) .

Cuatro cepas de bacterias lácticas que producen ácido se aislaron de carnes procesadas. Dos de los cultivos se identificaron como Leuconostoc mesenteroides y Neisella viridescens , Lactococcus lactis subspecie lactis y Streptococcus oralis.

Bromocresol púrpura (BCP) indicador de pHs se obtuvo de Eastman Kodak (Rochester, NY) . Clorofenol rojo (CPR) (CAS NO. 4430-20-0) se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . Los indicador de pHs se agregaron individualmente al caldo de MRS para obtener concentraciones finales de BCP o CPR de 0.5 mM. Después de disolver el indicador de pH, las soluciones fueron esterilizadas por filtro.

Los cultivos bacterianos se prepararon inoculando cultivos puros en caldo de soya tríptica o caldo MRS . El caldo inoculado se incubó durante la noche a 25° C. Los cultivos se diluyeron durante la noche en el caldo de MRS (que contiene bromocresol púrpura) para obtener una suspensión de aproximadamente 10-100 unidades que forman colonia (CFU) por mililitro. Un mililitro de cada suspensión bacteriana diluida se usó para inocular placas de Conteo Aeróbico PETRIFILM de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las placas inoculadas se incubaron a temperaturas a 25°, 30° y 32° C, respectivamente .

Las placas fueron visualmente inspeccionadas para determinar signos de crecimiento bacteriano. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Ej em lo 2.

Detección de Bacterias de Ácido Láctico Aisladas de Muestras de Carne Procesada Usando un Indicador de pH de Clorofenol Rojo Una solución concentrada de clorofenol rojo estéril se agregó al diluyente de MRS a una concentración final de 0.21 g/L (0.5 mM) . Los cultivos bacterianos de ácido láctico se prepararon y diluyeron en la solución de MRS/clorofenol rojo como se describe en el Ejemplo 1 con la excepción de que S. oralis no se probó en este experimento. La suspensión bacteriana diluida se usó para inocular placas de Conteo Aeróbico PETRIFILM como se describe en el Ejemplo 1. Las placas se incubaron a 30° C y las placas fueron visualmente inspeccionadas para determinar signos de crecimiento bacteriano. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Ej em lo 3.

Detección de Bacterias de Ácido Láctico Aisladas de Muestras de Carne Procesada Usando un Indicador de pH de Clorofenol Rojo Una solución concentrada de clorofenol rojo estéril se agregó al diluyente de MRS como se describe en el Ejemplo 2. Una solución concentrada de fosfato dipotásico estéril (pH 7.0 +/- 0.2) se agregó al diluyente de MRS para proporcionar un amortiguador de fosfato de 28 mM adicional en el diluyente. Los cultivos bacterianos de ácido láctico se prepararon y diluyeron en la solución de MRS/clorofenol rojo como se describe en el Ejemplo 1 con la excepción de que S. oralis no se probó en este experimento. La suspensión bacteriana diluida se usó para inocular placas de Conteo Aeróbico PETRIFILM como se describe en el Ejemplo 1. Las placas se incubaron a 30° C y las placas fueron visualmente inspeccionadas para determinar signos de crecimiento bacteriano. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Ejemplo Indicador Adición de Temperatura Tiempo de Observaciones de pH Amortiguador de incubación incubación 1 Bromocresol Ninguno 25 C 18 - 24 hr L. lactis subespecies lactis: Colonias con zonas ácidas. Sin burbujas de gas 5 Púrpura: 0.02 g/1 30 C S. oralis: ND o 0.04 g/1 Leuconostoc: ND Weisella: Zonas ácidas sin colonias visbles. Sin burgujas de gas . 40 - 72 hr L. lactis subespecies lactis: Colonias con zonas ácidas. Sin burbujas de gas S. oralis: Zonas ácidas. Sin colonias visibles o burbujas de gas.

Leuconostoc: Zonas ácidas. Sin colonias visibles o burbujas de gas.

Weissela: Zonas ácidas y burbujas de gas. Colonias pálidas. 10 2 Clorofenol Ninguno 30 C 18 - 24 hr Las zonas ácidas fueron visibles para los tres microorganismos probados. 40 - 72 hr L. lactis subespecies lactis: Colonias con zonas ácidas y burbujas de gas.

Rojo: 0.21 g/1 Weisella: Colonias con zonas ácidas y burbujas de gas.

Leuconostoc: Zonas ácidas y burbujas de gas. Sin colonias visibles. . 3 28 mM 30 C 18 - 24 hr Clorofenol Zonas ácidas visibles con las tres cepas 40 - 72 hr L. lactis subespecies lactis: Colonias con zonas ácidas y burbujas de gas.

Rojo: 0.21 g/1 15 Weisella: Colonias con zonas ácidas y burbujas de gas.

Leuconostoc: Zonas ácidas. Sin colonias visibles.

Tabla 3. Detección de bacteria de ácido láctico en dispositivo de cultivo película delgada ND= datos no recolectados.

Ej emplo 4.

Análisis de Imagen de Imagen de Placa Petrifilm Se preparó durante la noche un cultivo de Weisella viridescens y diluyó en caldos de MRS individuales que contienen bromocresol púrpura o clorofenol rojo, como se describe en el Ejemplo 2. Las suspensiones diluidas se usaron para inocular Placas de Conteo Aeróbico 3M PETRIFILM. Después de la inoculación, las placas se incubaron a 30°C por 48 horas .

Después de la incubación, las placas se formaron en imagen usando un Lector de Placa Petrifilm (PPR) que se ajustó para barrer una Placa de Conteo Aeróbico PETRIFILM estándar. Las imágenes del mapa de bits generadas por el PPR se importaron en el software Adobe Photoshop® (Adobe Systems, San José, CA) . El software se usó para observar el canal verde de la imagen para visualizar zonas amarillas adyacentes a las colonias debido al ácido láctico asociado con la colonia .

Las imágenes rojas, verdes y azules se exportaron en el software IMAGE-PRO Plus versión 6.3.0.512 y las imágenes de color respectivas se convirtieron a imágenes en mapa de bits a escala de grises . El software se usó para seleccionar los píxeles en una línea diagonal que pasa a través de la zona coloreada de luz en la imagen roja. El perfil de línea debajo de cada imagen respectiva muestra la intensidad de píxel para cada píxel en la línea diagonal mostrada en la imagen.

Las imágenes del mapa de bits de una placa que contiene bromocresol púrpura se muestran en la FIG. 6. El pico agudo en la imagen del canal rojo corresponde a la colonia coloreada de rojo en el centro de la zona ácida. El pico amplio en la imagen del canal verde corresponde al indicador de pH (ácido) coloreado de amarillo adyacente a la zona de colonias bacterianas. Los agujeros agudos en la imagen del canal azul corresponden a las líneas de rejilla coloreadas de amarillo en el dispositivo de cultivo de película delgada.

Las imágenes del mapa de bits de una placa que contiene clorofenol rojo se muestran en la FIG. 7. No existe pico detectable en la imagen de canal rojo. El pico amplio en el canal verde corresponde a la zona indicadora de pH (ácido) coloreada de amarillo adyacente a las colonias bacterianas.

Los orificios agudos en el canal azul corresponden a las líneas de rejilla coloreadas de amarillo en el dispositivo de cultivo de película delgada.

Ejemplo 5.

Detección de Bacterias de Ácido Láctico en dispositivos de cultivo de película delgada usando tintes indicadores clorofenol rojo, bromocresol verde, y bromocresol azul.

Sal sódica de bromocresol verde (CAS No. 62625-32-5) , sal sódica de bromocresol azul (CAS No 34725-61-6) , y Clorofenol rojo (CAS NO. 4430-20-0) se obtuvieron de Sigma-Aldrich .

Una solución base diluyente que contiene los componentes del caldo de MRS y caldo de Letheen se preparó de conformidad con la fórmula en la Tabla 4. La solución base se dividió en cuatro alícuotas. Se agregó tinte indicador clorofenol rojo, bromocresol verde y bromocresol azul a una concentración de 0.5 mM a una de las cuatro alícuotas. Las cuatro alícuotas no reciben algún indicador de tinte de pH. Las alícuotas se esterilizaron por filtro de manera separada.

Tabla 4. Solución base Diluyente, se agregaron los ingredientes al agua y se agitaron hasta disolverla.

Ingrediente Cantidad (gramos) Proteosa peptona No. 3 10 Bacto Peptamina 10 Extracto de Levadura 5 Dextrosa 20 Extracto de Carne de Res 15 K2HP04 2 Polisorbato 80 6.0 Citrato de amonio 2.0 Acetato de sodio 5.0 Sulfato de magnesio 0.1 Sulfato de manganeso 0.05 Lecitina 0.7 Cloruro de sodio 5 Agua desionizada 1000 Durante la noche se prepararon cultivos de Lactococcus lactis subspecie lactis y Leuconostoc mesenteroides como se describe en el Ejemplo 1. Los cultivos se diluyeron durante la noche 1:10,000 en diluyente Butterfield. Los cultivos diluidos fueron subsecuentemente serialmente diluidos en la solución base diluyente (Tabla 4) a una concentración de aproximadamente 10-100 CFU/mL. Las suspensiones finales se usaron para inocular Placas de Conteo de Placa Aeróbica PETRIFILM por duplicado de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se incubó una serie de placas a 25° C y una serie se incubó a 32° C. Las placas se formaron en imagen con un Lector de Placa Petrifilm y las imágenes se observaron después de 24 horas, 48 horas, y 72 horas de incubación. Los resultados se resumen en la Tabla 5. Las colonias cuando estuvieron visibles, aparecen rojas debido al indicador de TTC en la placa. Las zonas amarillas típicamente aparecen como un halo alrededor de las colonias y fueron de al menos 2-3 mm de diámetro después de 24 horas de incubación. Las zonas parecen más grandes después de incubación adicional (por ejemplo, aproximadamente 5-10 mm de diámetro después de 48 horas y >10 mm de diámetro después de 72 horas) . Las burbujas de gas, cuando se presentaron, fueron colonias visibles adyacentes y/o se localizaron en las zonas amarillas. El número de burbujas de gas fue típicamente mayor con el tiempo de incubación aumentado.

Cultivo indicador de pH Temperatura Resultados de 24 horas Resultados de 48 horas Resultados de 72 horas Clorofenol 25° C ND ND ND 32° C Rojo Colonias; zonas amarillas Colonias; zonas amarillas Colonias; zonas amarillas grandes, gas L. ¡aclis Bromocresol 25° C Sin colonias visibles, zonas ácidas Colonias pálidas, zonas amarillo Colonias pálidas, zonas amarillo subspccics lactis o burbujas de gas pálido, sin burbujas de gas pálido, pequeñas burbujas de gas Verde 32° C Zonas amarillo pálido Colonias pálidas, zonas amarillo Colonias pálidas, zonas amarillo pálido, pequeñas burbujas de gas pálido, pequeñas burbujas de gas Bromofcnol 25° C Sin colonias visibles, zonas ácidas Colonias pálidas Colonias, gas o burbujas de gas Azul 32° C Sin colonias visibles, zonas ácidas Colonias pálidas Colonias, gas 10 o burbujas de gas Clorofenol 25° C ND ND ND 32° C Zonas amarillas Zonas amarillas, gas Colonias; zonas amarillas Rojo grandes, gas L. mesenleroides Bromocresol 25° C Colonias; zonas amarillas Colonias pálidas, zonas amarillo Colonias pálidas, zonas amarillo pálido, pequeñas burbujas de gas pálido, pequeñas burbujas de gas Verde 32° C Colonias; zonas amarillas Colonias pálidas, zonas amarillo Colonias pálidas, zonas amarillo pálido, pequeñas burbujas de gas pálido, pequeñas burbujas de gas Bromofenol 25° C Sin colonias visibles, zonas ácidas Sin colonias visibles, zonas ácidas Burbujas de gas solamente (sin o burbujas de gas o burbujas de gas colonias o zonas ácidas) Azul 32° C ND Colonias pálidas, burbujas de gas Colonias pálidas, burbujas de gas Tabla 5. Apariencia de colonias en dispositivos de cultivo de película delgada que contienen indicadores de pH . "ND" significa sin datos para el punto de tiempo.

Ejemplo 6.

Preparación de medio de MRS para dispositivo de cultivo de película delgada (Placas I- VI, IX) Composiciones del medio mostrado en la Tabla 6 se prepararon de conformidad con el siguiente procedimiento y después se usaron para hacer las películas de placa delgada. El medio de caldo se preparó disolviendo piruvato de sodio (obtenido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ) con agua tratada con osmosis inversa (agua RO) , y después se agregaron Nutrientes de Caldo MRS (Remel R454064 obtenido de Thermo Fisher Scientific, (Lenexa, KS) ) hasta que se dispersa. El pH del medio preparado fue aproximadamente 6.6 y se ajustó usando ácido clorhídrico (HC1) a una concentración de 2.5 N o 1.0 N. de goma Guar (goma guar M150 MEYPROGAT, Meyhall Chemical AG) se agregó lentamente a la mezcla mientras se agita y después calienta a una temperatura de 80°C, y después se mezcla por aproximadamente otros 15 minutos sin calor. La mezcla de enfrió y refrigeró.

Adición de Clorofenol rojo Cuando se usó, el Clorofenol rojo ((CAS NO. 4430-20-0) obtenido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) se disolvió en agua RO antes de agregar los ingredientes restantes .

Adición de Cicloheximida Se preparó una solución de cicloheximida disolviendo cicloheximida (obtenida de Sigma-Aldrich, St .

Louis MO) en agua RO estéril. La solución se agregó al medio de caldo enfriado y se mezcló aproximadamente 15 minutos.

Adición de Nistatina Se preparó una solución de Nistatina disolviendo la nistatina en metanol se agregó agua estéril al medio de caldo enfriado y mezcló por aproximadamente 15 minutos.

Tabla 6 - Composiciones del Medio Usadas para Montajes de Placa de Película Delgada Composición Placa Placa II Placa III Placa IV Placa Placa Placa del Medio I V VI IX Agua RO- litro 1.0 1.5 1.5 1.0 1.0 1.0 1.0 Clorofoenol 0.3 0.2 0.2 0.4 0.2 rojo - gramos Piruvato de sodio 6.0 9.0 9.0 6.0 6.0 6.0 6.0 -gramos Nutrientes MRS- 104 156 156 104 104 104 104 gramos HCL - mL (conc) 8 (1N) 10 (2.5N) 4 (2.5N) 2 -- - 2 Guar- gramos 1 1 16.5 16.5 1 1.0 1 1.0 1 1.0 1 1.0 pH del medio de caldo* 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6 6.4 6.6 pH ajustado 5.8 5.8 5.8 6.3-6.4 — — 5.8 Soluciones aditivas Cicloheximida- 0.03 0.03 0.02 (gramos) Nistatina ~ - ~ 2500 Unidades ~ -- -- Agua - mL ~ 30 30 27 ~ - 27 Metanol - mL — -- ~ 3 ~ - 3 *pH del caldo ya preparado Montaje de Dispositivo de Cultivo de Película Delgada (Placas I-IX) Se prepararon Placas de cultivo de película delgada (Figura 1) usando las composiciones del medio descritas anteriormente para cada una de las placas. Un adhesivo resistente al agua recubierto con sustrato de papel impreso con una rejilla se recubrió en el lado de la línea de la rejilla con el medio a una amplitud de aproximadamente 7.5 pulgadas (19.1 cm) usando un cuchillo aplicador a un peso de recubrimiento objetivo de aproximadamente 0.46 g/l55cm2) . El sustrato recubierto se secó en un horno ajustado a 210°F (98.9°C) por aproximadamente 4 minutos.

El sustrato recubierto se cortó en una lámina de aproximadamente 16 pulgadas (10.6 cm de largo) . Un espesor de lámina de 0.46 mm de espuma de poliestireno de celda cerrada se laminó a una cinta de transferencia adhesiva en un revestidor. La lámina de espuma recubierta de adhesivo se cortó por troquel de manera que se tiene diez cortes circulares de 2 pulgadas (5.1 cm) de diámetro centrados dentro de áreas rectangulares en la lámina de 3-pulgadas (7.6 cm) por 3-pulgadas (7.6 cm) . El revestidor de liberación se removió y la espuma se laminó en el lado recubierto de caldo del sustrato. Una película superior preparada como se describe en el Ejemplo 12 de la Patente Estadounidense No. 4,565,783, la cual se incorpora en su totalidad en la presente por referencia, usando el guar tratado con óxido de etileno, se usó como una película de revestimiento y se unió a la lámina del sustrato con una cinta articulada. El compuesto se cortó entonces en placas rectangulares de 3-pulgadas (7.6 cm) por 4-pulgadas (10.2 cm) con el corte centrado dentro de 7.6 cm cuadrados de un borde de la placa.

La Placa VII se preparó en una manera similar excepto que el papel resistente al agua se usó sin un recubrimiento del medio de manera que la lámina de espuma cortada por troquel se laminó directamente al papel .

La Placa VIII se preparó laminando una Placa de Conteo Aeróbico Petrifilm 3M™ en la película superior descrita anteriormente.

Preparación de Medio Agar Universal para Cerveza Se preparó una composición de medio mezclando los componentes en las cantidades listadas en la Tabla 7 con 375 mililitros de agua desionizada hasta que se dispersa y después calienta a una temperatura de 80°C. La cerveza se agregó y mezcló por aproximadamente 15 minutos y el medio se refrigeró durante la noche.

Tabla 7 - Composición de Medio Agar Universal para Cerveza Componente Cantidad Compañía Catálogo No. CAS No.

Fosfato 0.158g JT Baker 4012-01 7758-1 1 -4 dipotásico Fosfato 0.155g JT Baker 3246-01 7778-77-0 monopotásico Sulfato de magnesio 0.062g Fis er M63-500 10034-99-8 Sulfato de manganeso lOf^L de soí. . Aldrich 04723H MQ 10034-96-5 (0.2997g/10ml H20) Cloruro de sodio ???µ? de soí. EM Science SX0420- 1 7647-14-5 (0.3036g/10ml H20) Sulfato ferroso ???µ? de soí. . Mallinckrodt 5056 7720-78-7 (0.2980g/10ml H20) Dextrosa 8.05g Sigma G-6152 492-62-6 Leche peptonizada 7.56g Oxoid LP0032 Extracto de Levadura 2.99g Difco 210929 Polvo de jugo de 6.06g Blue tomate California Goma guar 4.98g Cerveza 125ml dH20 375ml E emplo 7.

Detección de Bacterias de Ácido Láctico a partir de Muestras de Cerveza en la Presencia de Clorofenol Rojo Once cepas de bacterias lácticas que producen ácido (LAB) se obtuvieron de cervecerías comerciales y se clasificaron usando un procesador bioquímico VITEK Biomerieux) . Las once cepas se clasificaron como Lactobacillus brevis (2 cepas) , Lactobacillus plantarum, Pediococcus dawnosus (3 cepas) , Pediococcus acidilactici (2 cepas), Pediococcus dextrinicus, Lactobacillus delbrueckii, y Lactobacillus paracasei de conformidad con los procedimientos de identificación estándares.

Una solución indicadora de pH se preparó disolviendo 0.0798 gramos de sal sódica de clorofenol rojo ( (CPR) CAS NO. 123333-64-2 obtenido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ) en 198.0 mi de Amortiguador Buterfields estéril (EdgeBiologicals ; Memphis, TN) . Se realizaron diluciones seriales de dos partes para obtener concentraciones finales de 0 g/ml (no se agregó CPR) , 50 g /mi (O.lm ), 100 pg /mi (0.2mM), 200 µg /mi (0.4mM) y 400 µ9 /mi (0.8mM) en amortiguador de PCR.

Los cultivos bacterianos de cada cepa de LAB se prepararon inoculando cultivos puros en caldo estéril deMan, Rogosa y Sharpe ( (MRS , número de Producto R454064 obtenido de Remel (Lenexa, KS) ) . El caldo de MRS se preparó de conformidad con los lineamientos del fabricante. El caldo inoculado se incubó por 3 días a 28° C en una incubadora de dióxido de carbono al 99.9%. Los cultivos se diluyeron en amortiguador de CPR para obtener suspensiones que contienen aproximadamente 10-500 unidades que forman colonias (CFU) . Un mililitro de cada cultivo diluido se usó para inocular placas de película delgada (Placa I) . Adicionalmente, una décima de mililitro de la dilución bacteriana que contiene 100-5000 CFU se usó para inocular placas de agar (Placas de Agar Universal para Cerveza (obtenidas de AlphaBioSciences , Baltimore, MD) . Las placas de película delgada y placas de agar se incubaron por 5 días a 28° C en una incubadora de dióxido de carbono al 99.9%. Las placas fueron visualmente inspeccionadas para determinar signos de crecimiento bacteriano después de 2 días y 5 días. Los aislados recuperados a 2 días y 5 días se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8 - Crecimiento bacteriano con concentraciones variantes de clorofenol rojo 2 Días 5 Días Medio Agar Placa 1 Agar Placa 1 CPR Conc^g/ml 0 0 50 100 200 400 0 0 50 100 200 400 P.damonosus (1) - - - - - - + + + + + + P.damnosus (2) + + + + + + + + + + + + P.damnosus (3) - - - - - - - + + + + + + P.dextrinicus - - - - - - - + - - - - L.dclbrucckii + - - - - - + + + + + L.brevis (1) + + + + + + + + + + + + L.brevis (2) + + + + + + + + + + + + L.plantarum + + + + + + + + + + + + L.paracasei + + + + + + + + + + + + L.acidilactici (1) + + + + + + + + + + + + L.acidilactici (2) + + + + + + + + + + + + indica crecimiento; - indica sin crecimiento Ej emplo 8.

Detección de Bacterias de Ácido Láctico en Muestras de Cerveza en Medio de MRS Se preparó caldo MRS (Remel (Lenexa, KS) ) a concentraciones de 52 gramos por litro, 70 gramos por litro, 105 gramos por litro, y 140 gramos por litro. El caldo se esterilizó por vapor de conformidad con los lineamientos del fabricante .

Los cultivos de Lactobacillus brevis (3 cepas) y Pediococcus damnosus se prepararon como se describe en el Ejemplo 7. Los cultivos fueron serialmente diluidos en los caldos de MRS preparados para obtener suspensiones que contienen aproximadamente 10-200 unidades que forman colonias (CFU) por mililitro. Un mililitro de cada una de las diluciones bacterianas se inoculó en la Placa VII. Las placas se incubaron a 28°C por 4 días en una incubadora de dióxido de carbono al 99.9%. Las placas se verificaron por crecimiento después de 3 días y 4 días. A 3 días, dos de las tres cepas de bacterias de Lactobacillus brevis se hicieron crecer en ambos tipos de placas. Las otras Lactobacillus brevis y Pediococcus damnosus no se recuperaron por 4 días.

Ejemplo 9.

Detección de Bacterias de Ácido Láctico Filtradas a partir de Muestras de Cerveza Adicionadas Artificialmente Se preparó un cultivo de Lactobacillus brevis como se describe en el Ejemplo 1. El cultivo se diluyó en cerveza para obtener suspensiones que contienen aproximadamente 1 - 10 CFU por mililitro. Esto se realizó combinando O.Olml de cultivo con 99 mi de Amortiguador Butterfields estéril (Dilución A) . Después 0.0355 mi de Dilución A se combinaron con 355 mi de cerveza (Dilución B) . Una alícuota de 35 mi de Dilución B se filtró a través de una membrana de éster de celulosa mezclada de 0.45 µt? (Producto No. MSP000814 disponible de illipore (Billerica, MA) ) . Una segunda muestra de 35 mi de Dilución B se filtró a través de un filtro banco de 0.45 µt? Pall 60043 PES disponible de PALL Corporation (Port Washington, NY) ) . Una tercera muestra de 35 mi de Dilución B se filtró a través de un filtro PES de 0.45 µt? (Pall 66585 PES disponible de PALL Corporation (Port Washington, NY)) . Cuatro placas se prepararon para cada tipo de filtro como sigue: • UBA - Placa de Agar Universal para Cerveza, preparada de conformidad con los lineamientos del fabricante (AlphaB iosciences (Baltimore, MD) ) • La Placa VIII se hidrató con 1.0 mi de caldo MRS estéril (Remel) preparada de conformidad con los lineamientos del fabricante.

· La Placa I se hidrató con 1.0 mi de Amortiguador Butterfields estéril ( EdgeBiologi cal s (Memphis , TN) ) • La Placa I se hidrató mi con Amortiguador Butterfields que contiene 0.2 mg por mililitro de CPR .

Las placas se dejaron a temperatura ambiente por 30-60 minutos después se hidrataron para dejar solidificar el gel . Las películas superiores se enrollaron nuevamente de la película del fondo de manera que el gel se adhiere a las películas superiores. Los filtros se colocaron de lado derecho en el área de la zona de espuma o en el centro de la placa cuando no se usa el área de la zona de espuma. La película superior se enrolló nuevamente boca abajo en la placa y se suavizó usando presión ligera con los dedos. Para la placa de agar, el filtro se colocó de lado derecho en la superficie de agar. Las placas se incubaron a 28°C por 5 días en una incubadora de C02 al 99.9%. Las placas se verificaron para determinar el crecimiento a 3 días y 5 días. A 3 días, la bacteria L. brevis crece en tanto las placas Petrifilm como en las Placas de Agar Universal para Cerveza. Los resultados se resumen en la Tabla 9.

Tabla 9 - Recuperación de Bacterias a partir de Filtros Tipo de Control sin Filtro Pall Filtro Pall Filtro placa filtro (blanco) (negro) illipore (negro) UBA medio claro/ CFU blancas, CFU blancas, CFU blancas, amarillo, sin pequeñas pequeñas pequeñas CFU Placa VIII medio claro; CFU pequeñas , CFU CFU sin CFU rosa pequeñas , pequeñas , rosa ligeramente rosas , blancas Placa I medio claro; CFU pequeñas, CFU pequeñas rosa sin CFU rosa rosa/púrpura oscuras/ oscuras púrpura , CFU pequeñas Placa VI medio púrpura ,- CFU pequeñas , rosa rosa sin CFU rosa, con oscuras , oscuras/ zonas ácidas /púrpura CFU púrpura , CFU amarilla pequeñas con pequeñas con zonas zonas amarillas amarillas brumosas brumosas Se prepararon las placas como se describe anteriormente usando los filtros de membrana de éster de celulosa mezclado en una Placa UBA y Placa I, excepto que los filtros se colocaron boca abajo y del lado derecho en la Placa I y UBA. Una segunda serie de filtros idénticos se colocó boca abajo en la placa. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10 - Crecimiento bacteriano y orientación de filtro Orientación del Filtro del lado filtro boca abajo filtro derecho UBA ' Aproximadamente 25 aproximadamente 25 colonias colonias Placa I Aproximadamente 50 aproximadamente 30 colonias colonias Ejemplo 10.

Crecimiento de Bacteria en Medio MRS sobre un Intervalo de pH Se prepararon cuatro preparaciones de medio de MRS (R454064 disponible de Remel (Lenexa, KS) ) . El medio se preparó de conformidad con los lineamientos del fabricante con las siguientes excepciones. Además del medio nutriente de MRS, se agregó piruvato de sodio a la mezcla nutriente. Adicionalmente previo a someter a autoclave el medio, el pH se tomó usando un medidor de pH. El pH del medio se ajustó a 3.5, 4.5, 5.5 o 6.5 usando HCl 1N o NaOH 1N. El medio se sometió a autoclave de conformidad con los lineamientos del fabricante. Después de enfriar el medio a temperatura ambiente, se removió asépticamente una alícuota del medio de la muestra y el pH se tomó nuevamente con un medidor de pH. El pH no cambió significantemente (+/- 0.1 pH unidades) durante el proceso de someterlo al autoclave.

Se prepararon durante la noche cultivos bacterianos de L. brevis y P.damnosus (2 cepas) como se describe en el Ejemplo 7. Los cultivos se diluyeron serialmente en los caldos de MRS ajustados a pH 4 para obtener 25-250cf u/ml . Un mi de cada cultivo diluido se inoculó sobre la Placa VII. Los resultados de prueba se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11 - Crecimiento Bacteriano y pH Bacteria pH3.5 pH4.5 pH5.5 pH6.5 Día 1 L. brevis — — — — P. damnosus— cepa 1 — — — — P. damnosus - cepa 2 — — — — Día 4 L. brevis — — + + P. damnosus - cepa 1 — — + — P. damnosus - cepa 2 — — — — Día 6 L. brevis — + + + P. damnosus - cepa 1 — + + — P. damnosus - cepa 2 — + + — Día 7 L. brevis — + + + P. damnosus - cepa 1 — + + + P. damnosus - cepa 2 — + + + + Crecimiento positivo — Crecimiento negativo Ejemplo 11.

Detección de Bacterias de Ácido Láctico con Levadura y Cicloheximida Se prepararon durante la noche cultivos de Lactobacillus brevis en caldo de MRS y Saccharomyces cerevisiae en caldo de dextrosa de peptona de levadura (YPD) como se describe en el Ejemplo 7. Los cultivos se diluyeron serialmente para obtener suspensiones, cada una que contiene aproximadamente 100 cfu/ml de las especies individuales (ya sea L. ¿>revis o S. cerevisiae) .

Se preparó una tercera suspensión que contiene 100 cfu/mL total de ambas especies. Una segunda serie de 3 suspensiones se preparó en la misma manera (solamente L. brevis, solamente S. cerevisiae, y ambos organismos) excepto que cada solución final también contiene 100 ppm (10 mg/mL) de cicloheximida ((CAS No. 66-81-9), vendida bajo el nombre comercial Actidiona y obtenida de Sigma (Fluka) . La cicloheximida se agregó usando una solución base de cicloheximida preparada disolviendo 100 ppm de cicloheximida a Amortiguador Butterfield y se filtró estéril la solución a través de un filtro de 0.2 µp\. La solución base de agregó al amortiguador diluyente.

Un mililitro de cada una de las suspensiones bacterianas se usó para inocular la Placa I . Las placas se incubaron a 28°C por 48 hr en un inoculador que tiene un ambiente de dióxido de carbono al 99.9%. Las placas se inspeccionaron para determinar el crecimiento de colonias y los resultados se resumen en la Tabla 12. El crecimiento indica la presencia de colonias. Las concentraciones de cicloheximida de 0, 5, 10, 40, y 100 ppm preparadas en la misma manera descrita anteriormente, se probaron y todas proporcionaron resultados similares con dos morfologías de colonia distintas que aparecen en las placas sin cicloheximida, una morfología de colonia distinta en las placas con cicloheximida, y sin crecimiento en la placa con solamente S. cerevisiae .

Tabla 12 - Crecimiento de colonia con cicloheximida Bacteria Observación Lactobacillus brevis— con Crecimiento 1 - morfología de colonia distinta cicloheximida Lactobacillus brevis - sin Crecimiento 1- morfología de colonia distinta cicloheximida Saccharomyces cerevisiae— con Sin crecimiento cicloheximida Saccharomyces cerevisiae - sin Crecimiento 1- morfología de colonia distinta cicloheximida Lactobacillus brevis y Crecimiento 1- morfología de colonia distinta Saccharomyces - con cicloheximida Lactobacillus brevis y Crecimiento - 2 morfologías de colonias distintas Saccharomyces - sin cicloheximida Ejemplo 12.

Detección de Bacterias de Ácido Láctico a partir de Muestras de Cerveza con Medio que Contiene Cicloheximida Ocho cepas de LAB se obtuvieron de cervecerías comerciales y se clasificaron usando un procesador bioquímico VITEK . Las ocho cepas se clasificaron como Lactobacillus buchneris, Lactobacillus brevis (2 cepas) , Lactobacillus paracasei , Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilacti y Pediococcus damnosus (2 cepas) . Adicionalmente cinco cepas de levadura se aislaron y clasificaron como Saccharomyces cerivisiae (4 cepas) y Saccharomyces diastaticus .

Cultivos bacterianos de cada cepa de LAB se prepararon como se describe en el Ejemplo 7. Los cultivos de levadura se prepararon inoculando cultivos puros en Dextrosa de Peptona de Levadura (BD; Franklin Lakes, NJ) preparada de conformidad con los lineamientos del fabricante. Los cultivos de levadura inoculados se incubaron 18-24 horas aeróbicamente a temperatura ambiente (aproximadamente 24°C).

Las placas de cultivo de película delgada (Placa IX) se hidrataron con 1.0 mi de Amortiguador Butterfields por 60 minutos antes del uso.

Los cultivos de bacteria y levadura se diluyeron para proporcionar 10-250 cfu por medio de plaqueado. Se usaron cinco diluyentes diferentes como sigue: • Diluyente A - Amortiguador Butterfields (EdgeBiologicals ; Memphis, TN) • Diluyente B - muestra de cerveza sin levadura · Diluyente C - muestra de cerveza sin levadura • Diluyente D muestra de cerveza con levadura de cerveza • Diluyente E muestra de cerveza con levadura de cerveza Los cultivos bacterianos (L . juc neri , L.brevis (2 cepas), L .plantarum, F. acidlactici y L.paracasei) se diluyeron para obtener 10-250 CFU/media para Diluyentes D y E como sigue: 1. Se combinaron O.OlmL del cultivo con 99.0 mi de Diluyente A 2. Se combinaron 0.02 mi de Dilución 1 con 2.0 mi de Diluyente D (o E) 3. Se combinaron 0.2 mi de Dilución 2 con 2.0 mi de Diluyente D (o E) 4. Se combinaron 0.1485 mi de Dilución 1 con 99.0 mi de Diluyente B (o C) .

Se prepararon Diluciones para P. damnosus (2 cepas) y las 5 cepas de levadura en la misma manera excepto que 0.1 mi del cultivo se diluyó con 99.0ml de Diluyente A.

Para muestras diluidas en el Diluyente A2 , D o E, 1.0 mi de Dilución 3 se inoculó directamente en la Placa IX.

Para muestras diluidas en el Diluyente Al, B o C, 30ml de Dilución 4 se filtraron cada una a través de una membrana de éster de celulosa mezclada de 0.45 pm (HAWG047S6 disponible de Millipore; Billerica, MA) . Los filtros se colocaron sobre la Placa IX como se describe en el Ejemplo 9.

Las placas se incubaron a 28°C en una incubadora de dióxido de carbono al 99.9% por 7 días. Las placas se examinaron para determinar el número de unidades que forman colonia y si las placas fueron rojas o amarillas indicando la producción de ácido. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 13. Detección de Bacterias de Ácido Láctico on Cicloheximida en el Medio Método Filtrado Directo Diluyente Al B c A2 D E Sin bacteria 0* 0* 0* 0* 0* L.plantarum -150** -150** -100** -25** ~40** -50** P.damnosus (1) -50** -100** -100** 0* 0* 0* L.paracasei -100** -250** -250** -100** -100** -100** P.acidüactici -100** 100* -100** -100** 0* 0* S.cervisiae (1) 0* 0* 0* 0* 0* 0* S.cervisiae (2) 0* 1* 0* 0* 0* 0* S.cervisiae (3) 0* 0* 0* 0* 0* 0* S.diastaticus 0* 0* 0* 0* 0* 0* S.cervisiae (4) 0* 0* 0* 0* 0* 0* P.damnosus (2) -20** o** o** -100** 0* 0* L.buchneri -100** -100** -100** -100** -100* -50* L.brevis (1) -100** -100** -50** -25** -30* -20* L.brevis (2) -100** -75** -100** -100** -100* -75* *Rojo **Amarillo **Contaminado Ejemplo 13.

Detección de Bacterias? de Ácido Láctico con medio que contiene Nistatina Se hicieron crecer durante la noche cultivos de Lactobaci 1 lus brevis, Pediococcous damnosus y 5 cepas de Saccharomyces cerevisiae en caldo de MRS (cultivos bacterianos) o caldo de dextrosa peptona de levadura (YPD) (cultivos de levadura) . Estos cultivos fueron serialmente diluidos, proporcionando suspensiones que contienen aproximadamente 100 cfu/mL de los organismos. Una segunda serie de suspensiones se preparó y se agregaron 500 U/mL de Nistatina (CAS No. 1400-61-9 de Sigma) a las suspensiones. Se preparó una solución base agregando sólidos de Nistatina a 100% de etanol para hacer una solución de 25,000 U/mL la cual entonces se agregó a las suspensiones de bacterias/ levadura para obtener la concentración deseada de Nistatina. Un mililitro de cada una de las diferentes soluciones se inoculó entonces sobre la Placa I. Las placas inoculadas se incubaron a 28°C por 48-144 hr en una incubadora de C02 al 99.9%. Las placas que contienen colonias de Lactobaci 1 lus brevis o Pediococcous damnosus crecen si la Nistatina está presente o no. Placas que contienen Saccharomyces cerevisiae crecen solamente en las placas que no contienen Nistatina.

Ej em lo 14.

LAB común en alimentos sobre placas de cultivo de película delgada Se prepararon durante la noche cultivos bacterianos de cinco cepas bacterianas como se describe en el Ejemplo 7. Las cepas se obtuvieron de procesadores de alimentos comerciales y se clasificaron usando un bioprocesador VITEK e identificaron como Lactobacillus fermentum , La tococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides , Streptococcus mitis y Weissella viridescens . Los cultivos se diluyeron hasta aproximadamente 10 cfu (El) o 100 cfu (E2) en Amortiguador Butterfields e inocularon sobre la Placa V y Placa VI .

Cada uno de los cultivos también se diluyó en la misma manera excepto que las diluciones El y E2 del cultivo se mezclaron 1:1 con caldo de MRS de doble intensidad que contiene 400mg/L de Clorofenol rojo. Estas mezclas entonces se inocularon en Placas de Conteo Aeróbico 3M PETRIFILM. Las placas inoculadas se incubaron a temperaturas de 25°C, 30°C, o 35°C y se verificaron para determinar el crecimiento y la presencia de ácido a 24, 48 y, 72hrs. Las zonas amarillas que indican el ácido producido por las bacterias se dan en ya sea % de la placa que es amarilla, o el número de zonas distinguibles en la placa. Las colonias son el número de cfu en la placa. Los resultados se muestran en las Tablas 14 - 18. La placa que está con asterisco (*) es una Placa de Conteo Aeróbico 3M™ Petrifilm™.

Temp 24 Horas 48 Horas 72 Horas Dilución Placa °C Zonas Amarillas Colonias Zonas Amarillas Colonias Zonas Amarillas Colonias 10 * 25 14 0 10 0 80% Amarilla 9 100 * 25 80% Amarilla 0 100% Amarilla 0 100% Amarilla 72 10 Placa V 25 14 7 50% Amarilla 23 80% Amarilla 23 100 Placa V 25 80% Amarilla 17 100% Amarilla 172 100% Amarilla 172 10 Placa VI 25 12 0 16 16 100% Amarilla 16 100 Placa VI 25 80% Amarilla 0 100% Amarilla 88 100% Amarilla 88 10 * 30 19 0 70% Amarilla 0 100% Amarilla 0 100 * 30 100% Amarilla 0 100% Amarilla 0 100% Amarilla 0 10 Placa V 30 17 17 17 17 100% Amarilla 17 100 Placa V 30 100% Amarilla 172 100% Amarilla 172 100% Amarilla 172 10 Placa VI 30 16 16 16 16 75%) Amarilla 16 100 Placa VI 30 100% Amarilla 171 100% Amarilla 171 100% Amarilla 171 10 * 35 18 0 75% Amarilla 0 100% Amarilla 19 100 * 35 100% Amarilla 0 100% Amarilla 0 100% Amarilla 185 10 Placa V 35 24 24 24 24 100% Amarilla 24 100 Placa V 35 100% Amarilla 192 100% Amarilla 192 100% Amarilla 192 10 Placa VI 35 19 19 19 19 100% Amarilla 19 100 Placa VI 35 100% Amarilla 172 100% Amarilla 172 100% Amarilla 172 Tabla 14. Detección de contaminantes comunes de alimentos de LAB-L, mesenteroides Temp 24 Horas 48 Horas 72 Horas Dilución Placa °C Zonas Amarillas Colonias Zonas Amarillas Colonias Zonas Amarillas Colonias 10 * 25 1 1 4 4 4 4 100 * 25 7 55 100% Amarilla 71 100% Amarilla 71 10 Placa V 25 0 3 5 5 5 5 100 Placa V 25 8 33 50% Amarilla 51 100% Amarilla 51 10 Placa VI 25 0 0 2 2 2 2 100 Placa VI 25 13 44 75% Amarilla 62 100% Amarilla 62 10 * 30 3 3 3 3 3 3 100 * 30 59 59 100% Amarilla 59 100% Amarilla 59 10 Placa V 30 5 6 6 6 6 6 100 Placa V 30 63 63 100% Amarilla 63 100% Amarilla 63 10 Placa VI 30 0 5 9 9 9 9 100 Placa VI 30 21 45 100% 54 100% 54 10 * 35 8 8 8 8 8 8 100 * 35 50% Amarilla 60 100% Amarilla 60 100% Amarilla 60 10 Placa V 35 4 8 6 8 10 10 100 Placa V 35 50% Amarilla 66 1 0% Amarilla 66 100% Amarilla 66 10 Placa VI 35 3 6 6 6 7 7 100 Placa VI 35 20 46 75% Amarilla 46 100% Amarilla 46 Tabla 15. Detección de contaminantes comunes de alimentos de LAB-Lactococcus lac Temp 24 Horas 48 Horas 72 Horas Dilución Placa °C Zonas Amarillas Colonias Zonas Amarillas Colonias Zonas Amarillas Colonias 10 * 25 0 0 0 0 4 6 100 * 25 0 0 0 0 75% Amarilla 65 5 10 Placa V 25 0 0 0 0 0 0 100 Placa V 25 0 0 0 0 0 0 10 Placa VI 25 0 0 0 0 0 0 100 Placa VI 25 0 0 0 0 0 0 10 * 30 0 0 5 0 5 5 100 * 30 0 0 100% Amarilla 0 100% Amarilla 53 10 10 Placa V 30 0 0 0 0 1 4 100 Pl ca V 30 0 0 0 0 3 25 10 Placa VI 30 0 0 0 0 6 6 100 Placa VI 30 0 0 0 0 18 22 10 * 35 5 5 5 5 60% Amarilla 5 100 * 35 34 12 100% Amarilla 78 100% Amarilla 78 10 Placa V 35 0 0 3 4 4 4 15 100 Placa V 35 0 0 21 38 100% Amarilla 38 10 Placa VI 35 0 0 4 5 6 7 100 Placa VI 35 0 0 1 16 75% Amarilla 22 Tabla 16 Detección de contaminantes comunes de alimentos de LABA-Lactobacillus fermentum Temp 24 Horas 48 Horas 72 Horas Dilución Placa °C Zonas Amarillas Colonias Zonas Amarillas Colonias Zonas Amarillas Colonias 10 * 25 0 0 0 0 1 0 5 100 * 25 0 0 0 0 13 0 10 Placa V 25 0 0 0 0 1 1 100 Placa V 25 0 0 0 0 3 4 10 Placa VI 25 0 0 5 1 5 5 100 Placa VI 25 0 0 9 1 10 6 10 * 30 0 0 2 0 3 0 100 * 30 0 0 11 0 16 7 10 Placa V 30 0 0 0 0 0 0 100 Placa V 30 0 0 0 0 0 6 10 Placa VI 30 0 0 0 0 0 0 100 Placa VI 30 0 0 0 0 9 9 10 35 0 0 0 0 2 0 100 * 35 0 0 0 0 7 0 15 10 Placa V 35 0 0 0 0 0 0 100 Placa V 35 0 0 4 7 4 9 10 Placa VI 35 0 0 0 0 0 0 100 Placa VI 35 0 0 0 0 0 0 Tabla 17 . Detección de contaminantes comunes de alimentos de LAB-Streptococcus mitis Temp 24 Horas 48 Horas 72 Horas Dilución Placa °C Zonas Amarillas Colonias Zonas Amarillas Colonias Zonas Amarillas Colonias 10 * 25 0 0 24 0 60% Amarilla 26 100 * 25 0 0 90% Amarilla 0 100% Amarilla 21 3 10 Placa V 25 0 0 0 0 0 0 100 Placa V 25 0 0 0 0 0 0 10 Placa VI 25 0 0 0 0 0 0 100 Placa VI 25 0 0 0 0 0 0 10 * 30 0 0 26 0 100% Amarilla 26 100 * 30 0 0 100% Amarilla 0 100% Amarilla 222 10 10 Placa V 30 0 0 0 0 0 0 100 Placa V 30 0 0 0 0 0 0 10 Placa VI 30 0 0 0 0 0 0 100 Placa VI 30 0 0 0 0 0 0 10 * 35 0 0 60% Amarilla 0 100% Amarilla 32 100 * 35 0 0 100% Amarilla 195 100% Amarilla 195 10 Placa V 35 0 0 0 0 0 0 100 Placa V 35 0 0 0 0 0 0 10 Placa VI 35 0 0 0 0 0 0 100 Placa VI 35 0 0 0 0 0 0 Tabla 18 . Detección de contaminantes comunes de alimentos de LAB-Weissella viridescens Ejemplo 15.

Detección de LAB en alimentos Se prepararon cultivos bacterianos y diluyeron como se describe en el Ejemplo 14 excepto que las diluciones se hicieron con agua de peptona al 0.1%. Una mezcla que contiene los cinco microorganismos (con un total de 1000 - 10,000 cfu) se inoculó en Aderezo Francés comercialmente disponibles que tienen un pH de aproximadamente 4.

Aproximadamente 11 gramos de ensalada salada inoculada se mezclaron con 99 mi de 0.1% de agua de peptona en un aparato Stomacher a 230 RPM por 1 minuto. Se tomó una dilución de 1:10 de esta bolsa. Se realizaron diluciones adicionales para obtener diluciones 1:100 y 1:1000 con agua de peptona al 0.1%. El pH de cada una de las muestras se ajustó a 6.5+/- 0.2 usando HCl 1M, y después se inocularon sobre la Placa V (denotada Placa V en la Tabla 19) .

Cada uno de los cultivos también se diluyó de la misma manera excepto que la última dilución se hizo en una mezcla 50-50 de caldo MRS que contiene 200mg/L de Clorofenol rojo y el cultivo diluido. Los cultivos diluidos se inocularon sobre placas de Conteo Aeróbico 3M PETRIFILM (AC) como se describe en el Ejemplo 1. Estas placas son denotada AC en la Tabla 19. Se probó una segunda serie de placas sin ajustar el pH de la muestra el cual fue aproximadamente 4. Todas las placas inoculadas se incubaron a 30°C por 24, 48, y 72 horas. Las colonias se detectaron como puntos rojos en las placas rodeadas por una zona ácida. Las placas se inspeccionaron para determinar los conteos de colonia para cada placa y los resultados se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19 - Conteos de Bacterias en Aderezo Francés Inoculación Inicial Conteos - 24 Horas Conteos 48 - Horas Conteos - 72 Horas de Bacterias Dilución Placa V AC Placa V AC Placa V AC pH~4.0±0.2 0 1:10 0 0 0 0 0 0 0 1:100 0 0 0 0 3 0 0 1:1000 0 0 0 0 1 0 -lOcfu - lOOcfu 1:10 0 0 30 38 32 46 -lOcfu- lOOcñi 1:100 4 0 4 1 7 1 -lOcfu- lOOcfu 1:1000 0 0 0 0 1 0 -lOOcfu - lOOOcfu 1:10 2 0 103 37 103 37 -lOOcfu - lOOOcfu 1:100 18 3 21 6 24 24 -lOOcfu - lOOOcfu 1:1000 0 0 2 0 5 l H ~ 6.5 ± 0.2 0 1:10 0 0 0 3 2 4 0 1:100 0 0 0 0 4 0 0 1:1000 0 0 0 0 2 0 -lOcfu- lOOcfu 1:10 24 15 55 39 55 39 -lOcfu- lOOcfu 1:100 3 0 10 0 12 1 -lOcfu - lOOcfu 1:1000 0 0 0 0 3 0 -lOOcfu - lOOOcfu 1:10 139 83 139 83 139 83 -lOOcfu - lOOOcfu 1:100 18 6 32 6 32 28 -lOOcfu - lOOOcfu 1:1000 3 0 7 0 10 1 La presente invención ha sido ahora descrita con referencia a varias modalidades específicas vistas por el inventor para la cual están disponibles descripciones permisibles. Modificaciones no sustanciales de la invención, que incluyen modificaciones no vistas actualmente, pueden sin embargo, constituir equivalentes a esta. De este modo, el alcance de la presente invención no debe ser limitado por los detalles y estructuras descritos en la presente, sino preferentemente solamente por las siguientes reivindicaciones y equivalentes a estas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para detectar bacterias que producen ácido, caracterizado porque comprende: proporcionar un dispositivo de cultivo de película delgada que comprende un agente gelificante soluble en agua fría, un medio de cultivo para soportar el crecimiento de la bacteria de ácido láctico, un indicador de pH con un intervalo de transición que se extiende por debajo de pH 7.0, un carbohidrato que puede ser fermentado por bacterias que producen ácido, y una muestra sospechosa de contener bacterias que producen ácido; combinar un volumen predeterminado de muestra y el medio de cultivo para formar una primera mezcla; combinar, en el dispositivo de cultivo, la primera mezcla, el indicador de pH, y el carbohidrato fermentable ; incubar el dispositivo de cultivo por un periodo de tiempo; y detectar la presencia o ausencia de un microorganismo .

2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende combinar la muestra con un diluyente capaz de neutralizar un desinfectante químico.

3. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque incubar el dispositivo de cultivo comprende incubar el dispositivo anaeróbicamente .

4. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque además comprende : proporcionar un sistema de imagen; y obtener una imagen de un área de crecimiento del dispositivo de cultivo; en donde detectar la presencia o ausencia de un microorganismo comprende desplegar, imprimir, o analizar la imagen del área de crecimiento.

5. Método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el sistema de imagen comprende una fuente de iluminación y en donde obtener una imagen del área de crecimiento comprende iluminar el área de crecimiento.

6. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque además comprende la etapa de enumerar microorganismos.

7. Un dispositivo de cultivo de película delgada, caracterizado porque comprende: un miembro de cuerpo que comprende un sustrato a prueba de agua, de auto-soporte que tiene superficies superior e inferior; y un recubrimiento seco en la superficie superior del sustrato, en donde el recubrimiento comprende un medio de cultivo para soportar el crecimiento de bacterias que producen ácido; un agente gelificante soluble en agua fría; y un indicador de pH con un intervalo de transición que se extiende por debajo de pH 7.0; en donde el medio de cultivo comprende monooleato de polioxietilen (20) sorbitán o acetato de sodio.

8. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende un carbohidrato que puede ser fermentado por bacterias que producen ácido.

9. Un kit caracterizado porque comprende: un dispositivo de cultivo de película delgada que comprende un agente gelificante soluble en agua fría; un medio de cultivo para soportar el crecimiento de bacterias que producen ácido; un carbohidrato que puede ser fermentado por bacterias que producen ácido; y un indicador de pH.

10. Kit de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el dispositivo de cultivo comprende el medio de cultivo, indicador de pH, el carbohidrato que puede ser fermentado por bacterias que producen ácido, o una combinación de cualquiera de los dos mencionados anteriormente.