BR112017023081B1

BR112017023081B1 - Dispositivo de cultura e método de detecção de um micro-organismo em uma amostra

Info

Publication number: BR112017023081B1
Application number: BR112017023081-0A
Authority: BR
Inventors: Jason W. Bjork; Evan D. Brutinel; Adam J. Stanenas
Original assignee: 3M Innovative Properties Company
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2022-02-01
Also published as: US20180312895A1; CN107532127B; BR112017023081A2; JP6448818B2; JP2018514212A; WO2016176173A1; CN107532127A; KR20170139148A; US10995356B2; US20200140916A1; EP3289060B1; EP3289060A1; KR101903642B1

Abstract

DISPOSITIVO DE CULTURA E MÉTODO DE DETECÇÃO DE UM MICROORGANISMO EM UMA AMOSTRA. A presente revelação fornece um dispositivo de cultura para a enumeração de colônias de micro-organismos. O dispositivo pode compreender uma base, uma folha de cobertura e um elemento espaçador não poroso disposto entre as mesmas. O elemento espaçador compreende uma abertura que define um compartimento de crescimento. Estão dispostos no compartimento de crescimento um agente gelificante solúvel em água fria, um reagente removedor de oxigênio seco, um sistema de tampão e uma quantidade eficaz de um reagente gerador de dióxido de carbono seco. O sistema de tampão é selecionado de modo que, quando o compartimento de crescimento for hidratado com um volume predeterminado de água desionizada, uma mistura aquosa com um pH menor que ou igual a 6,35 seja formada.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção fornece um dispositivo de cultura para a enumeração de colônias de micro-organismos. Mais precisamente, a presente invenção refere-se a um dispositivo de cultura e a um método de detecção de um micro-organismo em uma amostra.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Muitas bactérias são sensíveis a oxigênio e não crescem em sua presença. Pode ser útil, em vários ambientes, determinar a viabilidade de tais micro-organismos anaeróbicos. Por exemplo, pode ser importante determinar se micro-organismos anaeróbicos estão presentes no processamento de alimentos e bebidas e/ou nas instalações de embalagem. Também pode ser importante determinar a presença de micro-organismos anaeróbicos em ambientes médicos, por exemplo, para determinar a presença de patógenos em ensaios diagnósticos. Como um outro exemplo, as instalações de tratamento de água testam amostras para determinar a presença ou a ausência de tais micróbios.

[0003] Uma variedade de dispositivos está disponível para a cultura de micro-organismos. Por exemplo, micro-organismos têm sido cultivados há muito tempo com o uso de placas de Petri. Conforme conhecido na técnica, as placas de Petri são placas de fundo plano rasas e redondas com um meio adequado para o crescimento do micro-organismo, como ágar e nutrientes. O uso de meio de ágar, entretanto, pode ser inconveniente e demorado. Por exemplo, o meio de ágar deve ser esterilizado, fundido e resfriado antes da adição da amostra.

[0004] Além disso, pode ser difícil fornecer um ambiente adequado para o cultivo de micro-organismos anaeróbicos, como bactérias produtoras de ácido lático anaeróbicas, usando placas de Petri. Porque os micro-organismos anaeróbicos não se desenvolvem na presença de oxigênio, técnicas físicas e químicas pouco práticas podem ser necessárias para o cultivo desses organismos. Tipicamente, tais dispositivos devem ser modificados, ou seja, formatados ou configurados para proporcionar uma barreira física à transmissão de oxigênio.

[0005] Outras técnicas foram desenvolvidas, as quais usam agentes químicos incorporados em um dispositivo de cultivo anaeróbico para remover o oxigênio. De modo geral, tais dispositivos incluem um agente redutor ou fragmentos de membrana estéreis de bactérias incorporados em um gel ou um meio nutritivo. Além disso, a Patente US n° 3.338.794 descreve um dispositivo de cultivo de bactérias anaeróbicas formado a partir de camadas de filme impermeável a oxigênio e um meio nutritivo entre os filmes, que inclui um composto redutor.

[0006] Estes e outros dispositivos, entretanto, também podem ser dispendiosos e podem não ser prontamente descartáveis. Esses dispositivos também podem ser pouco práticos para montar e/ou usar. Embora tentativas tenham sido feitas para se produzir um dispositivo para cultivo de microorganismos anaeróbicos simples em um ambiente aeróbio, ainda existe a necessidade de dispositivos de cultura anaeróbica melhores.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0007] Em geral, a presente invenção se refere à detecção e, opcionalmente, à enumeração de micro-organismos em uma amostra. Em particular, a presente invenção se refere ao crescimento e à detecção de microorganismos obrigatoriamente anaeróbicos, microaerofílicos ou microaerotolerantes. Sabe-se agora que esse crescimento e essa detecção podem ser conduzidos usando um dispositivo de cultura de geração de ambiente anaeróbico de uma peça única.

[0008] O dispositivo de cultura inventivo e os métodos revelados na presente invenção fornecem o crescimento, a detecção e a diferenciação de bactérias formadoras de ácido lático (LAB) obrigatoriamente anaeróbicas e microaerotolerantes mesmo quando os micro-organismos são incubados em ambientes contendo oxigênio (por exemplo, contendo oxigênio atmosférico normal). Vantajosamente, isso elimina a necessidade de reagentes e equipamento de incubação especializado (por exemplo, frascos anaeróbios, sachês anaeróbios de uso único, catalisadores de paládio, caixas de luvas anaeróbicas) que são tipicamente necessários para cultivar micro-organismos anaeróbicos. Adicionalmente, os métodos da invenção fornecem a diferenciação de bactérias permitindo-se a detecção da produção de gás dióxido de carbono a partir de colônias individuais, eliminando, dessa forma, o tempo adicional de incubação necessário para o isolamento de culturas puras e o uso de tubos de fermentação para detectar a produção de gás. Além disso, a invenção se refere à enumeração de bactérias formadoras de ácido lático obrigatoriamente anaeróbicas ou microaerotolerantes em uma amostra. Os micro-organismos obrigatoriamente anaeróbicos ou microaerotolerantes compartilham a característica comum de que necessitam de ambientes com oxigênio reduzido, em que possam crescer e se reproduzir.

[0009] Um benefício adicional de um dispositivo da presente invenção é a capacidade de tamponagem. Isto elimina a necessidade de ajuste de pH de amostras de alimento e/ou mantém o meio de cultura no dispositivo em um pH ideal durante um período de tempo mais longo.

[0010] Em uma realização, a presente invenção fornece um dispositivo de cultura para a enumeração de colônias de micro-organismos. O dispositivo pode compreender uma base que tem superfícies interna e externa opostas, uma folha de cobertura que tem superfícies interna e externa opostas e um elemento espaçador não poroso disposto entre a base e a folha de cobertura. O elemento espaçador compreende uma abertura que define um formato e uma profundidade de um compartimento de crescimento. O elemento espaçador e o compartimento de crescimento são dispostos entre a superfície interna da base e a superfície interna da folha de cobertura. O dispositivo pode compreender adicionalmente uma primeira quantidade eficaz de um reagente removedor de oxigênio seco; um sistema de tampão seco disposto no compartimento de crescimento que, quando o compartimento de crescimento é hidratado com um volume predeterminado de água desionizada, forma uma mistura aquosa com um pH menor que ou igual a 6,35; e uma segunda quantidade eficaz de um reagente de geração de dióxido de carbono seco; disposto no compartimento de crescimento. O agente gelificante é aderido à base ou à folha de cobertura no compartimento de crescimento.

[0011] Em qualquer uma das realizações acima, o reagente removedor de oxigênio pode consistir essencialmente em partículas que têm um diâmetro menor que 106 mícrons. Em qualquer uma das realizações anteriores, o reagente gerador de dióxido de carbono pode consistir essencialmente em partículas que têm um diâmetro menor que 106 mícrons. Em qualquer das realizações acima, o dispositivo de cultura pode compreender adicionalmente um nutriente, um reagente indicador, um agente seletivo ou um agente redutor disposto no compartimento de crescimento. Em qualquer das realizações acima, o nutriente, o reagente indicador, o agente seletivo ou o agente redutor, se presentes no compartimento de crescimento, podem ser aderidos à base ou à folha de cobertura. Em qualquer uma das realizações acima, o reagente removedor de oxigênio pode ser selecionado do grupo que consiste em ferro ferroso ou um sal do mesmo ou ácido ascórbico ou um sal do mesmo. Em qualquer uma das realizações anteriores, o reagente gerador de dióxido de carbono pode ser selecionado do grupo que consiste em bicarbonato de sódio e carbonato de sódio.

[0012] Em outra realização, a presente invenção fornece um método de detecção de bactérias formadoras de ácido lático em uma amostra. O método pode compreender abrir o dispositivo de cultura de acordo com qualquer uma das realizações anteriores para fornecer acesso ao compartimento de crescimento no mesmo, colocar um volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento, colocar uma amostra no compartimento de crescimento, fechar o dispositivo de cultura, incubar o dispositivo de cultura durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de uma colônia microbiana no meio de cultura e detectar a colônia microbiana. Colocar o líquido aquoso e a amostra no compartimento de crescimento e fechar dispositivo de cultura pode compreender a formação de um meio de cultura microbiano semissólido delimitado pela base, a folha de cobertura e o espaçador do dispositivo de cultura; O meio de cultura pode ter um pH entre 4,0 e 6,35.

[0013] Em qualquer uma das realizações acima, a incubação do dispositivo de cultura durante um período de tempo compreende incubar o dispositivo de cultura durante o período de tempo em uma atmosfera aeróbica. Em qualquer uma das realizações anteriores do método, a detecção da colônia microbiana compreende adicionalmente a enumeração de uma ou mais colônias opticamente detectáveis no dispositivo de cultura. Em qualquer uma das realizações acima, a enumeração de uma ou mais colônias microbianas compreende adicionalmente a distinção de colônias produtoras de dióxido de carbono das colônias não produtoras de dióxido de carbono.

[0014] As expressões "preferencial" e "de preferência" referem-se às realizações da invenção que podem proporcionar certos benefícios, sob certas circunstâncias. Entretanto, outras realizações podem também ser preferenciais, sob circunstâncias iguais ou diferentes. Ademais, a menção de uma ou mais realizações preferenciais não acarreta que outras realizações não sejam úteis e não pretende excluir outras realizações do escopo da invenção.

[0015] O termo "compreende", e variações do mesmo, não tem um significado limitador quando esses termos aparecerem nas descrições e nas reivindicações.

[0016] Como usados aqui, "um", "uma", "o", "a", "ao menos um", "ao menos uma", "um ou mais" e "uma ou mais" são intercambiáveis. Dessa forma, por exemplo, um nutriente pode ser interpretado como tendo o significado de "um ou mais" nutrientes.

[0017] O termo "e/ou" significa um ou todos os elementos mencionados, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos elementos mencionados.

[0018] Conforme também usadas na presente invenção, as menções de faixas numéricas com extremos incluem todos os números contidos nessa faixa (por exemplo, de 1 a 5 inclui 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

[0019] O sumário supracitado da presente invenção não se destina a descrever cada uma das realizações apresentadas ou todas as implementações da presente invenção. A descrição a seguir exemplifica, mais particularmente, as realizações ilustrativas. Em diversos lugares ao longo do pedido, é fornecida orientação através de listas de exemplos, os quais podem ser usados em várias combinações. Em cada exemplo, a lista mencionada serve apenas como um grupo representativo e não deve ser interpretada como uma lista exclusiva.

[0020] Detalhes adicionais destas e de outras realizações são apresentados nos desenhos em anexo e na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens se tornarão evidentes a partir da descrição e dos desenhos e a partir das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0021] A Figura 1 é uma vista em planta de uma realização de um dispositivo de cultura, de acordo com a presente invenção.

[0022] A Figura 2 é uma vista em seção transversal lateral, ao longo da linha 2-2, do dispositivo de cultura da Figura 1.

[0023] A Figura 3 é uma vista lateral explodida do dispositivo de cultura da Figura 1.

DESCRIÇÃO DE REALIZAÇÕES DA INVENÇÃO

[0024] Antes que quaisquer realizações da presente invenção sejam explicadas em detalhe, deve-se compreender que a invenção não está limitada, em sua aplicação, aos detalhes de construção e à disposição de componentes demonstrada na descrição a seguir ou ilustrada nos desenhos a seguir. A invenção pode compreender outras realizações e ser praticada ou realizada de várias maneiras. Deve-se entender também que a fraseologia e terminologia usadas na presente invenção têm o propósito de descrição, e não devem ser consideradas limitadoras. O uso dos termos "incluindo", "compreendendo", ou "tendo" e as variações dos mesmos na presente invenção, pretendem abranger os itens mencionados após os mesmos e os equivalentes dos mesmos, bem como itens adicionais. Exceto onde especificado ou limitado de outro modo, os termos "conectado" e "acoplado", bem como as variações dos mesmos, são amplamente usados e abrangem conexões e acoplamentos tanto diretos como indiretos. Adicionalmente, "conectado" e "acoplado" não estão restritos a conexões ou acoplamentos físicos ou mecânicos. Deve-se compreender que outras realizações podem ser utilizadas e alterações estruturais ou lógicas podem ser feitas sem que se afaste do escopo da presente invenção. Além disso, os termos como "parte frontal", "parte traseira", "topo", "fundo" e similares são usados apenas para descrever a relação mútua entre os elementos, porém, não pretendem de forma alguma se referir às orientações específicas do aparelho, indicar ou conferir orientações necessárias ou requeridas do aparelho ou especificar como a invenção aqui descrita será usada, montada, exibida ou posicionada em uso.

[0025] A presente invenção refere-se, em geral, à detecção e, opcionalmente, à enumeração de micro-organismos em uma amostra. Por exemplo, a presente invenção se refere ao crescimento e à detecção de um grupo diverso de micro-organismos conhecidos coletivamente como bactérias formadoras de ácido lático (deste ponto em diante, "LAB"). As LAB são caracterizadas pela habilidade de fermentar a glicose principalmente em ácido lático (bactérias formadoras de ácido lático "homofermentativas") ou em ácido lático, dióxido de carbono e etanol (bactérias formadoras de ácido lático "heterofermentativas"). Sabe-se agora que esse crescimento e essa detecção de micro-organismos LAB podem ser conduzidos usando um dispositivo de cultura gerador de ambiente enriquecido de dióxido de carbono e gerador de ambiente anaeróbico de uma peça única.

[0026] Certos micro-organismos crescem anaerobicamente. Além disso, outros micro-organismos como as LAB, são capazes de crescer na presença de oxigênio (isto é, os mesmos são "aerotolerantes"). Embora seu metabolismo fermentativo seja usado para produzir certos alimentos (por exemplo, iogurte, queijo, chucrutes), também são conhecidos como agentes de deterioração dos alimentos em carnes processadas, cerveja e vinho, por exemplo.

[0027] Sabe-se que um dispositivo de cultura gerador de ambiente enriquecido de dióxido de carbono e gerador de ambiente anaeróbico de uma peça única reidratável seco pode ser produzido. O dispositivo de cultura compreende uma quantidade eficaz de um reagente removedor de oxigênio substancialmente seco disposto em uma zona de crescimento do dispositivo de cultura e que é capaz de reidratação em um volume predeterminado de solução aquosa em que, mediante reidratação, o reagente consumidor de oxigênio é capaz de participar de uma reação de consumo de oxigênio. Adicionalmente, agora se sabe que a reação consumidora de oxigênio pode consumir oxigênio suficiente para facilitar o crescimento de um micro-organismo bacteriano formador de ácido lático anaeróbico. Além disso, o dispositivo de cultura pode ser mantido em um ambiente aeróbico, em que o dispositivo de cultura pode manter um ambiente de oxigênio reduzido por pelo menos cerca de oito dias, para facilitar o crescimento dos micro-organismos mencionados anteriormente.

[0028] Os dispositivos de cultura reidratáveis secos revelados na presente invenção fornecem inúmeras vantagens em relação à técnica. Por exemplo, a maioria das técnicas de enumeração e identificação de microorganismos anaeróbicos envolvem o uso de meio de cultura líquido (por exemplo, caldo ou ágar) que é submetido à autoclavagem antes do uso. A temperatura elevada de esterilização tende a conduzir a maior parte do oxigênio para fora dos meios líquidos. Após a esterilização, a agitação e/ou a exposição ao ar podem reintroduzir oxigênio ao meio. Em contraste, um dispositivo da presente invenção contém ingredientes que geram o desejado ambiente anaeróbico para cultivar micro-organismos anaeróbicos ou microaerofílicos.

[0029] Espécies bacterianas de interesse podem ser analisadas em uma amostra de teste que pode ser derivada de qualquer fonte, como um fluido fisiológico, por exemplo, sangue, saliva, fluido ocular, fluido sinovial, fluido cérebro- espinhal, pus, suor, exsudato, urina, muco, tecido mucoso (por exemplo, bucal, gengival, nasal, ocular, traqueal, bronquial, gastrointestinal, retal, uretral, ureteral, vaginal, cervical e membranas da mucosa uterina), leite de lactação, fezes ou similares. Adicionalmente, a amostra de teste pode ser derivada de um sítio corporal, por exemplo, ferimento, pele, narinas anteriores, cavidade nasofaringeal, cavidades nasais, vestíbulo nasal anterior, couro cabeludo, unhas, ouvido externo, ouvido médio, boca, reto, vagina, axila, períneo, ânus, ou outros sítios semelhantes.

[0030] Além de fluidos fisiológicos, outras amostras de teste podem incluir outros líquidos bem como sólido(s) dissolvido(s) ou suspenso(s) em um meio líquido. As amostras de interesse podem incluir correntes, água, alimentos, ingredientes alimentícios, bebidas, solo, plantas ou outra vegetação, ar, superfícies (por exemplo, paredes, pisos, equipamentos, utensílios em uma instalação de fabricação, hospital, clínica ou casa, por exemplo), e similares.

[0031] Os exemplos não limitadores dos gêneros de bactérias formadoras de ácido lático que podem ser detectados e enumerados nos dispositivos e métodos da presente descrição incluem os gêneros que pertencem à ordem de Lactobacillales. Esses gêneros incluem, por exemplo, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus e Streptococcus. Outros gêneros de LAB que podem ser detectados e enumerados nos dispositivos e métodos da presente invenção incluem, por exemplo, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weisella.

[0032] Em uma realização, a presente invenção fornece um dispositivo de cultura para cultivar e detectar as bactérias formadoras de ácido lático (LAB). Com referência às Figuras 1 a 3, um dispositivo de cultura 100 da presente invenção compreende uma base à prova d’água 10, uma folha de cobertura à prova d’água 20 e um elemento espaçador 30 disposto entre a base 10 e a folha de cobertura 20. A base 10 tem uma superfície interna 10b e uma superfície externa 10a oposta à superfície interna. A folha de cobertura 20 tem uma superfície interna 20b e uma superfície externa 20a oposta à superfície interna. Em qualquer realização, a superfície interna 10b da base 10 está disposta em relação face a face com a superfície interna 20b da folha de cobertura 20.

[0033] A base 10 é, de preferência, um filme relativamente rígido à prova d’água feito de um material (por exemplo, poliéster, polipropileno ou poliestireno) que não absorverá ou, de outro modo, será afetado adversamente pela água. A base 10 é, de preferência, produzida usando um material que é substancialmente não transmissível ao oxigênio gasoso. Alguns exemplos não limitadores de materiais adequados para a base 10 incluem filmes de poliéster de ao menos cerca de 15 μm a ao menos cerca de 180 μm de espessura, filmes de polipropileno de ao menos cerca de 100 μm a ao menos cerca de 200 μm de espessura, e filmes de poliestireno de ao menos cerca de 300 μm a cerca de 380 μm de espessura. Outras bases adequadas incluem os filmes de copolímero de álcool etileno vinílico, filmes de álcool polivinílico e filmes de cloreto de polivinilideno. A base 10 pode ser transparente se deseja-se visualizar colônias através da base.

[0034] A folha de cobertura 20 é usada para cobrir a superfície interna 10b da base 10, para definir o compartimento de crescimento 60, e, opcionalmente, para visualizar o compartimento de crescimento durante o transporte, o armazenamento, a incubação e/ou a contagem de colônias. A folha de cobertura 20 é, de preferência, um filme relativamente rígido à prova d’água feito de um material (por exemplo, poliéster, polipropileno ou poliestireno) que não absorverá, ou de outro modo, será afetado adversamente pela água. As folhas de cobertura 20 são, de preferência, transparentes para facilitar a contagem de colônias sem abrir o dispositivo de cultura 10 e são substancialmente impermeáveis a micro-organismos e vapor d’água.

[0035] De modo geral, as folhas de cobertura podem ser preparadas a partir de materiais como aqueles usados para preparar a primeira base 10. A folha de cobertura 20 é, de preferência, produzida usando um material que é substancialmente não transmissível ao oxigênio gasoso. Alguns exemplos não limitadores de materiais adequados para a base 10 incluem filmes de poliéster de ao menos cerca de 15 μm a ao menos cerca de 180 μm de espessura, filmes de polipropileno de ao menos cerca de 100 μm a ao menos cerca de 200 μm de espessura, e filmes de poliestireno de ao menos cerca de 300 μm a cerca de 380 μm de espessura. Outras bases adequadas incluem os filmes de copolímero de álcool etileno vinílico, filmes de álcool polivinílico e filmes de cloreto de polivinilideno. Conforme mostrado na Figura 1, a folha de cobertura 20 pode ser fixada de uma forma articulada (por exemplo, com o uso de fita adesiva de dupla-face) ao longo de uma borda das superfícies internas de cada uma dentre a base 10 e a folha de cobertura 20 para formar uma região de dobradiça 70. Opcionalmente, em qualquer realização, a folha de cobertura 20 pode compreender uma região de aba 75 que se estende além da base 10. A região de aba 75 pode ser convenientemente segurada ao abrir o dispositivo 100 para inocular o compartimento de crescimento 60 com uma amostra.

[0036] Um versado na técnica reconhecerá que a transmissibilidade de oxigênio gasoso através de um dado tipo de filme polimérico pode ser reduzida pelo aumento da espessura do filme polimérico. Em qualquer realização, a base e a folha de cobertura da presente invenção são filmes poliméricos tendo uma espessura adequada para serem substancialmente não transmissíveis ao oxigênio gasoso.

[0037] O elemento espaçador 30 inclui uma abertura 36. A abertura 36 forma uma cavidade que serve tanto para definir uma localização quanto a espessura de um compartimento de crescimento 60 do dispositivo de cultura 100. O elemento espaçador 30, juntamente com a base 10 e a folha de cobertura 20, definem os limites do compartimento de crescimento 60. O elemento espaçador 30 ajuda a confinar uma amostra aquosa (não mostrada) no interior do compartimento de crescimento 60 durante a inoculação do dispositivo de cultura 100.

[0038] A abertura 36, conforme ilustrada na Figura 1, define um formato circular. Entretanto, é contemplado que a abertura 36 possa definir outros formatos (por exemplo, quadrado, retângulo, oval). As paredes da abertura 36 fornecem uma cavidade de tamanho e formato predeterminados, e define a espessura do compartimento de crescimento 60 do dispositivo de cultura 100.

[0039] O elemento espaçador 30 deve ser espesso o suficiente para formar uma cavidade tendo um volume predeterminado, por exemplo, l mL, 2 mL, 3 mL, 5 mL, ou 10 mL, dependendo do tamanho do compartimento de crescimento 60 e do tamanho da amostra a ser colocada no dispositivo de cultura. Em qualquer realização, o elemento espaçador 30 é feito a partir de qualquer material não poroso que seja hidrofóbico (que não se molha), inerte a micro-organismos e opcionalmente que possa ser esterilizado. Em qualquer realização, o elemento espaçador 30 pode ser acoplado (por exemplo, por meio de um adesivo sensível à pressão) diretamente à base 10 ou à folha de cobertura 20. Adicionalmente ou alternativamente, o elemento espaçador 30 pode ser acoplado (por exemplo, por meio de uma fita adesiva 50), indiretamente, à base ou à folha de cobertura (por exemplo, o elemento espaçador pode ser acoplado ao primeiro ou ao segundo revestimento a seco que é revestido sobre a base ou a folha de cobertura, respectivamente).

[0040] O compartimento de crescimento 60 pode estar em qualquer local acessível no dispositivo de cultura 100 entre a base 10 e a folha de cobertura 20. De preferência, o compartimento de crescimento 60 está localizado distante das bordas periféricas 80 do dispositivo 100.

[0041] De preferência, o elemento espaçador 30 é construído de um material não poroso (por exemplo, um metal, vidro, uma resina polimérica) que não inibe substancialmente o crescimento de micro-organismos e não absorve água substancialmente ou bolhas macroscópicas de dióxido de carbono de um hidrogel que é colocado em contato com o elemento espaçador. Alguns exemplos não limitadores de materiais adequados a partir dos quais um elemento espaçador 30 pode ser feito incluem poliolefinas (por exemplo, polietileno, polipropileno, e similares), tereftalato de polietileno, poliuretano, poliestireno, cloreto de polivinilideno, metacrilato de polimetila, fluoreto de polivinilideno ou outros filmes poliméricos, por exemplo.

[0042] Um dispositivo da presente invenção compreende um agente gelificante seco solúvel em água fria disposto no compartimento de crescimento. De preferência, o agente gelificante é aderido diretamente ou indiretamente à base 10 e/ou à folha de cobertura 20 do dispositivo 100. Em qualquer realização, o agente gelificante pode ser uniformemente distribuído sobre a superfície interna 10b da base 10 e/ou a superfície interna 20b da folha de cobertura 20 no compartimento de crescimento 60 do dispositivo 100.

[0043] Os agentes gelificantes adequados para uso no primeiro revestimento a seco 24 incluem agentes gelificantes naturais e sintéticos solúveis em água fria. Agentes gelificantes naturais, como algina, carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose, goma guar, goma de alfarrobeira, goma xantana, e agentes gelificantes sintéticos, como poliacrilamida, poliuretano, óxidos de polietileno e misturas dos mesmos são em geral adequados. Agentes gelificantes adequados podem ser selecionados de acordo com os ensinamentos da presente invenção e as invenções de U.S. n° 4.565.783; 5.089.413, e 5.232.838. Agentes gelificantes preferenciais incluem goma guar, goma de alfarroba, e goma xantana; estes agentes gelificantes sendo individualmente úteis, ou de preferência, em combinação um com o outro.

[0044] Dessa forma, em qualquer realização, um dispositivo 100 da presente invenção pode compreender opcionalmente um primeiro revestimento a seco 14 aderido ao menos a uma porção ou a toda a superfície interna 10b da base 10 no compartimento de crescimento 60. O primeiro revestimento a seco 14, se estiver presente, pode compreender o agente gelificante seco solúvel em água fria. Opcionalmente, uma primeira camada adesiva 12 é aderida à base 10 e ao menos uma porção do primeiro revestimento a seco é aderida à primeira camada adesiva no compartimento de crescimento 60.

[0045] A folha de cobertura 20 pode ser isenta de qualquer revestimento (não mostrado). Alternativamente, se o dispositivo 100 não tiver um primeiro revestimento a seco 14 aderido à superfície interna 10b da base 10 no compartimento de crescimento 60, a folha de cobertura 20 pode compreender um segundo revestimento a seco 24 aderido à mesma no compartimento de crescimento. O segundo revestimento a seco 24, se estiver presente, pode compreender o agente gelificante seco solúvel em água fria. Opcionalmente, uma segunda camada adesiva 22 é aderida à folha de cobertura 20 e ao menos uma porção do segundo revestimento a seco 24 é aderida à segunda camada adesiva no compartimento de crescimento 60. Em qualquer realização, uma porção da camada da segunda camada adesiva 22 pode ser usada para facilitar a vedação da folha de cobertura 20 ao menos a uma porção do elemento espaçador 30.

[0046] Com relação ao primeiro e ao segundo revestimentos secos, os revestimentos podem compreender opcionalmente qualquer nutriente ou meio nutritivo que seja reconstituível em água fria, não interferindo substancialmente com o as propriedades de gelificação em água fria do agente gelificante e que suporta o crescimento de um micro-organismo anaeróbico. Nutriente ou nutrientes particulares adequados para uso no dispositivo de cultura dependerão do micro-organismo a ser cultivado no dispositivo, e serão facilmente selecionados pelos versados na técnica. Em geral, tais nutrientes são solúveis em água fria. Nutrientes adequados para suportar o crescimento bacteriano são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, extrato de levedura, peptona, açúcares, sais adequados e similares. Em qualquer realização, o primeiro e/ou o segundo revestimento a seco pode compreender adicionalmente um agente seletivo (por exemplo, um nutriente, um antibiótico, e combinações dos mesmos) que facilita o crescimento de um micro-organismo anaeróbico particular ou grupo de micro-organismos em relação a um outro micro-organismo ou grupo de micro-organismos. Os versados na técnica reconhecerão que uma variedade de outras formulações poderiam ser usadas e que estas não prejudicariam o escopo da presente invenção.

[0047] De preferência, quando o primeiro revestimento a seco 14 consiste principalmente em pó seco ou aglomerado de pó seco, o primeiro revestimento 14 é disposto em uma primeira camada adesiva 12 que é disposta ao menos sobre uma porção da superfície interna 10b da base 10. O primeiro revestimento a seco 14 pode ser depositado sobre a base 10 ou sobre a primeira camada adesiva opcional 12 usando processos de formulação, processos de revestimento de adesivos, e processos de revestimento líquido e/ou processos de revestimento a seco descritos, por exemplo, nas patentes US n° s 4.565.783; 5.089.413, e 5.232.838; as quais estão todas aqui incorporadas na íntegra, a título de referência em suas totalidades.

[0048] De preferência, quando o segundo revestimento a seco 24 consiste principalmente em pó seco ou aglomerado de pó seco, o segundo revestimento 24 é disposto em uma segunda camada adesiva 22 que é disposta ao menos sobre uma porção da superfície interna 20b da folha de cobertura 20. O segundo revestimento a seco 24 pode ser depositado sobre a folha de cobertura 20 ou sobre a segunda camada adesiva opcional 22 usando processos de formulação, processos de revestimento de adesivos, e processos de revestimento líquido e/ou processos de revestimento a seco descritos, por exemplo, nas patentes US n° s 4.565.783; 5.089.413, e 5.232.838; as quais estão todas aqui incorporadas na íntegra, a título de referência em suas totalidades.

[0049] O compartimento de crescimento 60 é definido como um volume disposto entre as superfícies internas da base 10 e da folha de cobertura 20 (superfícies internas 10b e 20b, respectivamente), o volume que circunda ao menos uma porção do primeiro revestimento a seco 14 e/ou do segundo revestimento a seco 24. Dessa forma, quando um líquido aquoso é distribuído no compartimento de crescimento, o líquido aquoso está em contato fluídico com ao menos uma porção do primeiro revestimento a seco 14, se presente, e/ou o segundo revestimento a seco 24, se estiver presente. A espessura do compartimento de cultura 60 pode variar dependendo, por exemplo, do volume de líquido aquoso (não mostrado) depositado no dispositivo de cultura, a presença de sólidos (por exemplo, particulados em suspensão e/ou uma membrana filtrante) associada à amostra (não mostrados), e/ou um elemento espaçador 30 no dispositivo de cultura 10.

[0050] Os dispositivos de cultura da presente invenção compreendem, ainda, uma quantidade eficaz de um reagente removedor de oxigênio seco, um sistema de tampão seco e uma quantidade eficaz de um reagente gerador de dióxido de carbono seco. Cada um dentre o reagente removedor de oxigênio, o sistema de tampão e o reagente gerador de dióxido de carbono é disposto no compartimento de crescimento. "Seco", como usado aqui, significa que o reagente é substancialmente isento de água. A frase "substancialmente isento de água" refere-se a um reagente que tem um teor de água não superior que aproximadamente o teor de água do material (por exemplo, fornecido como um pó ou como um revestimento aquoso desidratado) uma vez que foi permitido equilibrar-se com o meio ambiente.

[0051] Ao menos um componente seco (por exemplo, o agente gelificante) é hidratado com um líquido aquoso antes, durante, ou após a introdução (por exemplo, inoculação) do material de amostra no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura, conforme aqui descrito. Tipicamente, o material de amostra e/ou o líquido aquoso é introduzido no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura em condições ambiente (isto é, em um ambiente gasoso aeróbica). Dessa forma, após a inoculação do compartimento de crescimento com uma amostra sob condições aeróbicas, o líquido aquoso no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura compreende uma primeira concentração de oxigênio dissolvido. O reagente removedor de oxigênio no dispositivo de cultura funciona para reduzir a primeira concentração de oxigênio dissolvido no líquido aquoso no compartimento de crescimento para uma segunda concentração de oxigênio dissolvido que é substancialmente mais baixa do que a primeira concentração de oxigênio dissolvido. Essa redução da concentração de oxigênio dissolvido no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura inoculado facilita o crescimento de LAB obrigatoriamente anaeróbicas ou microerotolerantes no dispositivo de cultura.

[0052] Em qualquer realização, a quantidade eficaz do reagente removedor de oxigênio é selecionada de modo que a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido ocorra em cerca de 120 minutos após a colocação do reagente removedor de oxigênio em contato fluídico com o volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura. Em qualquer realização, a quantidade eficaz do reagente removedor de oxigênio é selecionada de modo que a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido ocorra em cerca de 60 minutos após a colocação do reagente removedor de oxigênio em contato fluídico com o volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura. Em qualquer realização, a quantidade eficaz do reagente removedor de oxigênio é selecionada de modo que a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido ocorra em cerca de 30 minutos após a colocação do reagente removedor de oxigênio em contato fluídico com o volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura.

[0053] Em qualquer realização, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido ocorre a uma temperatura entre a temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 23 graus C) e cerca de 42 graus C, inclusive. Dessa forma, em qualquer realização de um método de acordo com a presente invenção, não é necessário incubar o dispositivo de cultura em uma temperatura elevada (isto é, acima da temperatura ambiente), de modo a reduzir a primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido após colocar o reagente removedor de oxigênio em contato fluídico com o volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura.

[0054] Um versado na técnica reconhecerá que a quantidade de oxigênio removido do compartimento de crescimento de um dispositivo de cultura da presente invenção dentro de um período de tempo adequado para a cultura de micro-organismos depende, entre outros, da quantidade de reagente removedor de oxigênio no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura. Portanto, mediante o ajuste da quantidade de reagente removedor de oxigênio no compartimento de crescimento de acordo com a presente invenção, o dispositivo de cultura pode ser configurado para cultivar LAB microaerotolerantes ou para cultivar LAB obrigatoriamente anaeróbicas.

[0055] Diversos reagentes removedores de oxigênio são conhecidos incluindo, por exemplo, ácido ascórbico (por exemplo, ácido L- ascórbico) e seus sais, sais de ferro ferrosos, sais metálicos de sulfito, bissulfito e metabissulfito. Um reagente removedor de oxigênio adequado de acordo com a presente invenção consome oxigênio suficiente para criar um ambiente local de baixo oxigênio ou anaeróbico e produz quantidades e tipos de produtos de reação que podem estar em comunicação fluídica com as LAB sem substancialmente inibir o crescimento das LAB. Em qualquer realização, o reagente removedor de oxigênio está disposto no compartimento de crescimento em uma quantidade de cerca de 1,5 micromol/10 cm2 a cerca de 15 micromols/10 cm2.

[0056] Preferencialmente, em qualquer realização, o reagente removedor de oxigênio é fornecido sob a forma de um pó seco. Com mais preferência, em uma realização, o reagente removedor de oxigênio é fornecido como um pó seco que é triturado e classificado para formar uma população de partículas com uma distribuição de tamanho consistindo essencialmente em partículas com um diâmetro de 106 mícrons ou menos. Vantajosamente, um reagente removedor de oxigênio fornecido em partículas tendo um diâmetro menor do que 106 mícrons pode ser aderido à base ou à folha de cobertura (por exemplo, aderido a uma camada adesiva revestida sobre a base ou a folha de cobertura), em uma quantidade eficaz para criar e manter (por exemplo, até cerca de 24 horas de incubação, até cerca de 48 horas de incubação, até cerca de 72 horas de incubação, até 4 dias de incubação, até 5 dias de incubação, até 7 dias de incubação, ao menos 24 horas de incubação, ao menos 48 horas de incubação, ao menos 72 horas de incubação, ao menos 4 dias de incubação, ao menos 5 dias de incubação, ao menos 7 dias de incubação) um ambiente anaeróbico no compartimento de crescimento quando o dispositivo é inoculado com um volume predefinido de líquido aquoso, e fechado.

[0057] O adesivo usado na camada adesiva opcional 22 disposta sobre a folha de cobertura 20 pode ser igual ou diferente ao adesivo usado na camada adesiva opcional 12 disposta sobre a base 10. Além disso, o segundo revestimento a seco 24 disposto sobre a folha de cobertura 20 pode ser igual ou diferente do primeiro revestimento a seco 14 disposto sobre a base 10. Os revestimentos na folha de cobertura 20 podem cobrir toda a superfície voltada para a base, mas, de preferência, cobrem ao menos uma parte da superfície interna 20b que define ao menos uma porção do compartimento de crescimento 60 do dispositivo de cultura 100.

[0058] Em qualquer realização, um agente seletivo pode ser disposto no dispositivo em um revestimento a seco ou, opcionalmente, em uma camada adesiva no compartimento de crescimento.

[0059] Opcionalmente, o dispositivo de cultura da presente invenção inclui adicionalmente um meio para indicação de oxigênio em um dispositivo de cultura. De preferência, o meio é capaz de indicar uma quantidade (por exemplo, uma quantidade limite predeterminada ou uma quantidade relativa) de oxigênio presente no dispositivo. Vantajosamente, o meio pode indicar se ou quando o reagente removedor de oxigênio depletou adequadamente o oxigênio no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura a uma concentração que facilita o crescimento de LAB microarotolerantes ou obrigatoriamente anaeróbicas. Meios para detecção de oxigênio em um dispositivo de cultura são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, corantes redox (por exemplo, azul de metileno) e corantes fluorescentes extintos por oxigênio.

[0060] O meio pode ser um composto luminescente que indica a ausência de oxigênio no interior do dispositivo. Indicadores de oxigênio adequados são revelados na patente US n° 6.689.438, (Kennedy et al.), que está aqui integralmente incorporada, por referência. Os compostos luminescentes apropriados como indicadores para um dispositivo de cultura da presente invenção mostrarão luminescência que é extinta por oxigênio. Mais precisamente, os indicadores exibirão luminescência mediante exposição à sua frequência de excitação com uma emissão que é inversamente proporcional à concentração de oxigênio. O indicador pode ser revestido, laminado, ou extrudado sobre uma outra camada, ou porção de uma outra camada, no interior do dispositivo. Tal camada pode ser disposta no compartimento de crescimento e, opcionalmente, ser separada do compartimento de cultura por uma ou mais camadas permeáveis ao oxigênio. Compostos adequados para indicação do oxigênio incluem derivados de metalo de octaetilporfirina, tetrafenilporfirina, tetrabenzoporfirina, clorinas ou bacterioclorinas. Outros compostos adequados incluem coproporfirina de paládio (PdCPP), octaetilporfirina de platina e paládio (PtOEP, PdOEP), tetrafenilporfirina de platina e paládio (PtTPP, PdTPP), canforquinona (CQ), corantes do tipo xanteno, como Eritrosina B (EB). Outros compostos adequados incluem complexos de rutênio, ósmio e irídio com ligantes como 2,2'-bipiridina, 1,10-fenantrolina, 4,7- difenil-1,10-fenantrolina e similares. Exemplos adequados destes incluem, perclorato de tris(4,7,-difenil-1,10-fenantrolina)rutênio (II), perclorato de tris(2,2’- bipiridina)rutênio (II), perclorato de tris(1,10-fenantrolina)rutênio(II) e similares.

[0061] Um dispositivo de cultura da presente invenção inclui uma quantidade eficaz de um reagente gerador dióxido de carbono seco disposto no compartimento de crescimento. O reagente gerador dióxido de carbono, quando ativado pelo contato com um líquido aquoso no compartimento, estabelece um equilíbrio das seguintes espécies dissolvidas: um ou mais sais de ácido carbônico, ácido carbônico e dióxido de carbono. Vantajosamente, a quantidade eficaz do reagente gerador dióxido de carbono é suficiente para elevar o dióxido de carbono dissolvido a uma concentração que facilita o crescimento de LAB. Os resultados experimentais apresentados aqui mostram a relação entre a quantidade de reagente gerador de dióxido de carbono e o aumento da concentração de dióxido de carbono no hidrogel aquoso no compartimento de crescimento.

[0062] Preferencialmente, em qualquer realização, o reagente gerador dióxido de carbono é fornecido sob a forma de um pó seco. Com mais preferência, em qualquer realização, o reagente gerador de dióxido de carbono é fornecido como um pó seco que é triturado e classificado para formar uma população de partículas com uma distribuição de tamanho consistindo essencialmente em partículas que têm um diâmetro menor do que 106 mícrons. Vantajosamente, partículas tendo um diâmetro menor do que 106 mícrons podem ser aderidas à base ou à folha de cobertura (por exemplo, aderidas a uma camada adesiva revestida sobre a base ou a folha de cobertura), em uma quantidade eficaz para criar e manter (por exemplo, até cerca de 24 horas de incubação, até cerca de 48 horas de incubação, até cerca de 72 horas de incubação, até 4 dias de incubação, até 5 dias de incubação, até 7 dias de incubação, ao menos 24 horas de incubação, ao menos 48 horas de incubação, ao menos 72 horas de incubação, ao menos 4 dias de incubação, ao menos 5 dias de incubação, ao menos 7 dias de incubação) um ambiente enriquecido com CO2 no compartimento de crescimento quando o dispositivo é inoculado com um volume predefinido de líquido aquoso, e fechado.

[0063] Um dispositivo de cultura da presente invenção inclui um sistema de tampão seco, disposto no compartimento que, quando hidratado com água desionizada, deixa a água com um pH menor que ou igual a 6,35. O pH ácido oferece várias vantagens: i) o ambiente ácido favorece seletivamente o crescimento de micro-organismos tolerantes ao ácido (por exemplo, LABs) em relação a outros micro-organismos que podem estar presentes em uma amostra e ii) o ambiente ácido pode deslocar o equilíbrio do reagente gerador de carbono em direção a uma proporção mais elevada de CO2 dissolvido. Ambas vantagens podem facilitar o crescimento de LABs no dispositivo de cultura.

[0064] Os sistemas de tampão usados em um dispositivo da presente invenção incluem qualquer tampão microbiologicamente compatível tendo um pKa de 7,0 ou menos; de preferência, cerca de 6,5 ou menos. Os componentes ácidos e básicos do sistema de tampão estão presentes no dispositivo de cultura em uma razão de modo que, quando um volume predefinido de água desionizada é colocado em contato com o sistema de tampão, o pH do compartimento de crescimento seja menor do que 6,35. Os sistemas de tampão adequados incluem, por exemplo, ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico e ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico de sódio e ácido succínico e succinato de sódio. Um versado na técnica reconhecerá que a razão de componentes ácidos e básicos do sistema de tampão pode ser ajustada para alcançar o pH desejado da mistura aquosa formada quando um volume predeterminado de líquido aquoso (por exemplo, compreendendo a amostra) é depositado no compartimento de crescimento e o dispositivo é fechado.

[0065] O dispositivo de cultura da presente invenção pode incluir opcionalmente um reagente indicador. Os reagentes indicadores adequados são úteis para detectar LAB. Opcionalmente, o reagente indicador pode distinguir certas LAB de outros micro-organismos LAB ou não LAB. Reagentes indicadores adequados incluem, por exemplo, um indicador de pH, um indicador redox, um substrato enzimático cromogênico, um substrato enzimático fluorogênico para detectar a presença de um micro-organismo. Um versado na técnica reconhecerá reagentes indicadores úteis para detectar LAB. O indicador não deve interferir substancialmente no reagente removedor de oxigênio. Em qualquer realização, o reagente indicador pode ser disposto no dispositivo em um revestimento a seco ou, opcionalmente, em uma camada adesiva no compartimento de crescimento.

[0066] O dispositivo de cultura da presente invenção pode incluir opcionalmente um reagente redutor. Reagentes redutores adequados são úteis para reduzir o potencial de oxidação-redução do meio de crescimento e, desse modo, facilitam o crescimento de LAB anaeróbicas. Agentes redutores adequados incluem, por exemplo, tioglicolato de sódio, L-cisteína, ditiotreitol, ditioeritritol e combinações dos mesmos.

[0067] Em qualquer realização, o compartimento de crescimento pode ser dimensionado para ser hidratado com um volume de 1 mililitro de líquido aquoso. Água compreende cerca de 0,54 μmols de oxigênio dissolvidos por mililitro. Dessa forma, o primeiro revestimento a seco e/ou o segundo revestimento a seco compreendem, de preferência, ao menos reagente removedor de oxigênio suficiente para consumir 0,54 μmols de oxigênio em um período de 120 minutos ou menos, em cerca de 22 graus C a cerca de 42 graus C. Com mais preferência, o primeiro revestimento a seco e/ou o segundo revestimento a seco compreendem, de preferência, ao menos reagente removedor de oxigênio suficiente para consumir mais do que 0,54 μmols de oxigênio em um período de 120 minutos ou menos, em cerca de 22 graus C a cerca de 42 graus C.

[0068] Em qualquer realização, o primeiro revestimento a seco e/ou o segundo revestimento a seco podem incluir quaisquer outros componentes, como corantes (por exemplo, um indicador de pH), agentes de reticulação, reagentes (por exemplo, reagentes seletivos ou reagentes indicadores como substratos enzimáticos cromogênicos ou fluorogênicos), ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos componentes anteriormente mencionados. Por exemplo, para alguns usos, é desejável a incorporação de um indicador de crescimento microbiano (por exemplo, um indicador de pH, um substrato enzimático cromogênico, um corante redox) no primeiro e/ou segundo revestimento a seco ou em um adesivo no qual o primeiro e/ou o segundo revestimento a seco estão aderidos. Corantes adequados incluem aqueles que são metabolizados pelos, ou que, de outro modo, reagem com os micro-organismos em crescimento, e que fazem com que as colônias sejam coloridas ou fluorescentes para uma visualização mais fácil. Tais corantes incluem cloreto de trifenil tetrazólio, vermelho de p-tolil tetrazólio, violeta de tetrazólio, azul de veratril tetrazólio e os corantes relacionados, e 5-bromo-4-chloroindolil fosfato. Outros corantes adequados incluem aqueles sensíveis às alterações de pH durante o crescimento de micro-organismos, como vermelho neutro.

[0069] Para alguns usos, é desejável formar um revestimento a seco que, quando reconstituído com um líquido aquoso, forma um hidrogel que é rígido o bastante para permitir a inoculação por estriamento. Para formar um meio que possa ser estriado, uma quantidade eficaz de um agente de reticulação adequado pode ser incorporada em um ou mais revestimentos secos que incluem um agente gelificante. Agentes de reticulação adequados não afetam substancialmente o crescimento dos micro-organismos de interesse. Tipos e quantidades adequados de agentes de reticulação são facilmente selecionados por aqueles versados na técnica. Por exemplo, com goma guar, agentes de reticulação como tetraborato de potássio, sais de alumínio ou sais de cálcio são adequados e podem ser adicionados em quantidades eficazes, por exemplo, menores do que cerca de 1,0 por cento em peso do revestimento a seco.

[0070] Ao menos um revestimento a seco pode opcionalmente incluir reagentes necessários para a realização de certos testes microbiológicos. Por exemplo, antibióticos podem ser incluídos para realização testes de suscetibilidade a antibiótico. Para identificação de micro-organismos, reagentes diferenciais que sofrem uma mudança de cor na presença de um tipo particular de micro-organismo podem ser incluídos.

[0071] Em qualquer realização, o sistema de tampão seco, o agente redutor, o reagente gerador de dióxido de carbono e/ou o reagente indicador podem ser dispostos no compartimento de crescimento como um pó seco (por exemplo, o pó seco 40 das Figuras 2 e 3) que não é aderido à primeira ou à segunda camadas adesivas. Alternativamente, o sistema de tampão seco, o agente redutor, o reagente gerador de dióxido de carbono e/ou o reagente indicador podem ser incluídos no primeiro e/ou no segundo revestimentos, conforme descrito na presente invenção.

[0072] Um dispositivo de cultura da presente invenção pode ser preparado usando uma variedade de técnicas. Em geral, um dispositivo pode ser feito artesanalmente ou com equipamentos comuns de laboratório, conforme descrito nas patentes US n°s 4.565.783; 5.089.413, e 5.232.838, por exemplo.

[0073] Um exemplo não limitador de um adesivo sensível à pressão adequado que pode ser usado na primeira camada de adesivo e/ou na segunda camada adesiva é um copolímero de 2-metilbutilacrilato / ácido acrílico em uma razão molar de 90/10. Outros adesivos sensíveis à pressão que podem ser usados incluem acrilato de iso-octila/ ácido acrílico em uma razão molar de 95/5 ou 94/6 e borracha de silicone. Adesivos que se tornam leitosos (por exemplo, opacos) quando expostos à água são menos preferenciais, mas podem ser usados em conjunto com uma base não transparente ou em situações onde a visualização das colônias não seja necessária. Adesivos ativados por calor tendo uma substância de ponto de fusão mais baixo sobre uma substância com ponto de fusão mais alto e/ou adesivos ativados por água, como mucilagem, são também conhecidos e podem ser usados nesta invenção. Ao incorporar um reagente indicador, como descrito acima, a fim de facilitar a visualização de colônias, é, de preferência, em geral para incorporar o reagente indicador, no adesivo ou mistura de revestimento em caldo, ao invés de pó.

[0074] A primeira camada adesiva e a segunda camada adesiva são revestidas (por exemplo, usando um revestidor tipo faca) sobre a superfície superior da base ou folha de cobertura para formar uma camada adesiva em uma espessura que é, de preferência, menor que o diâmetro médio das partículas de pó seco ou de pó aglomerado a serem aderidas ao adesivo. Em geral, o adesivo é revestido o suficiente para aderir as partículas ao substrato (por exemplo, o primeiro ou a folha de cobertura aqui descritos), mas não tanto que as partículas se tornem completamente incorporadas no adesivo. De modo geral, uma camada adesiva com espessura de cerca de 5 μm a cerca de 12 μm é adequada.

[0075] De preferência, quando o agente gelificante é incluído no primeiro revestimento a seco e/ou no segundo revestimento a seco, este é incluído em uma quantidade tal que uma quantidade predeterminada de água ou uma amostra aquosa, por exemplo, de 1 a 3 ml, colocada no compartimento de crescimento formará um hidrogel tendo uma viscosidade adequada, por exemplo, cerca de 1.500 cps (1,5 Pa.s), ou mais, quando medida em 60 rpm com um viscosímetro Brookfield Modelo L VF a 25°C. Hidrogéis dessa viscosidade permitem o manuseio e o empilhamento convenientes dos dispositivos de cultura durante a incubação e fornecem a formação de colônias distintas no meio. Por exemplo, 0,025 g a 0,050 g de goma guar em pó espalhada de forma substancialmente uniforme sobre uma área superficial de 20,3 cm2 proporcionará um meio suficientemente viscoso quando reconstituído com 1 a 3 mL de uma amostra aquosa. O tamanho das partículas de pó pode ser usado para controlar o peso de revestimento por unidade de área. Por exemplo, sob condições onde revestimentos de goma guar 100 mesh para um peso de cerca de 0,05 g/ 20,3 cm2, revestimentos de goma guar de 400 mesh para um peso de cerca de 0,025 g/20,3 cm2.

[0076] Em qualquer realização, o primeiro revestimento a seco ou o segundo revestimento a seco podem compreender um ou mais nutrientes para facilitar o crescimento de micro-organismos. Quando o revestimento é constituído essencialmente de pós ou de aglomerados de pó, a razão preferencial de agente gelificante para nutriente em um meio em pó aderido é determinada pelo micro-organismo específico a ser cultivado no dispositivo. Para propósitos gerais, entretanto, uma razão de cerca de 4 para 1 a cerca de 5 para 1 (total de agente gelificante para total de nutriente, com base no peso) pode ser preferencial. O pó em um meio em pó aderido pode ser aplicado à camada adesiva (por exemplo, a primeira camada adesiva 12 e/ou a segunda camada adesiva 22) por quaisquer meios adequados de aplicação de uma camada substancialmente uniforme. Exemplos de métodos adequados para aplicar a camada de pós incluem o uso de um dispositivo tipo agitador, ou o uso de um dispositivo de aplicação de revestimento em pó.

[0077] Nutrientes adequados para uso em um dispositivo da presente invenção incluem aqueles encontrados no meio de cultura para o cultivo e a detecção de LAB. Exemplos não limitadores de nutrientes adequados incluem uma fonte de peptona (por exemplo, extrato de carne, peptona de carne), extrato de levedura, uma digestão enzimática da caseína, e um carboidrato (por exemplo, maltose, glicose, trealose, sacarose). De preferência, o carboidrato está presente no dispositivo em uma quantidade que é alta o suficiente para facilitar o crescimento (produção de biomassa) de LAB para ácido lático ou outros metabólitos (por exemplo, CO2), que podem ser usados para detectar colônias de LAB.

[0078] Ao usar o dispositivo de cultura da presente invenção, uma contagem precisa das colônias de micro-organismos presentes pode ser desejável. Dessa forma, em qualquer realização, um dispositivo de cultura da presente invenção pode compreender um padrão de grade sobre a base ou, alternativamente, sobre a folha de cobertura. O padrão de grade pode incluir um padrão de grade quadrada como, por exemplo, o padrão de grade quadrada revelado na patente US n° 4.565.783. O padrão de grade pode ser produzido sobre a primeira camada ou folha de cobertura por meio de qualquer processo adequado, como métodos de impressão, por exemplo.

[0079] Em um outra realização, a presente invenção fornece um método de fabricação de um dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico de uma peça única. O método compreende aderir um agente gelificante solúvel em água fria sobre uma porção de uma base. O agente gelificante pode estar seco (por exemplo, na forma de partículas substancialmente isentas de água) quando aderido à base ou o agente gelificante pode estar aderido à base, como um revestimento líquido (por exemplo, um revestimento líquido aquoso) e, subsequentemente, seco a um estado substancialmente isento de água. O método compreende adicionalmente o posicionamento da base adjacente a uma folha de cobertura e a colocação de um elemento espaçador entre as mesmas, o elemento espaçador compreendendo uma abertura que define um compartimento de crescimento, conforme aqui descrito. Em qualquer realização, o elemento espaçador pode ser fixado (por exemplo, por meio de um adesivo) à base ou à folha de cobertura.

[0080] A base é posicionada adjacente à folha de cobertura de modo que ao menos uma porção do agente gelificante aderido fica voltada para o compartimento de crescimento disposto entre a base e a folha de cobertura. Opcionalmente, em qualquer realização, uma primeira camada adesiva pode ser aplicada (por exemplo, com o uso de processos de revestimento conhecidos na técnica) à base e o agente gelificante solúvel em água fria pode ser aderido à primeira camada adesiva.

[0081] Em uma realização alternativa, o agente gelificante solúvel em água fria pode ser aderido à dita folha de cobertura por meio de qualquer um dos processos descritos para aderir o agente gelificante à base. A secagem do agente gelificante aderido, se o agente gelificante é revestido com líquido, pode ser realizada por meio de diversos processos conhecidos na técnica. O revestimento pode ser seco em um forno (por exemplo, um forno por gravidade, um forno de convecção), por exemplo, de acordo com o processo descrito na patente US n° 5.601.998, que está aqui integralmente incorporada, por referência. De preferência, o agente gelificante aderido é submetido à secagem até que o meio esteja substancialmente isento de água. Como usado aqui, as expressões "substancialmente seco", "substancialmente isento de água" ou similares refere-se a um revestimento que tem um conteúdo de água não maior que aproximadamente o conteúdo de água do revestimento desidratado, uma vez que tenha sido deixado se equilibrar com o ambiente.

[0082] O método compreende adicionalmente a deposição do reagente removedor de oxigênio, do sistema de tampão e do reagente gerador de dióxido de carbono dentro do compartimento de crescimento do dispositivo de cultura. Em qualquer realização, qualquer um ou todos dentre o reagente removedor de oxigênio, o sistema de tampão e o reagente gerador de dióxido de carbono podem ser depositados no compartimento de crescimento como um pó seco. Opcionalmente, qualquer um ou todos dentre o reagente removedor de oxigênio, o sistema de tampão e o reagente gerador de dióxido de carbono podem ser aderidos a um adesivo (por exemplo, uma primeira camada adesiva ou segunda camada adesiva, conforme aqui descrito) no compartimento de crescimento. Outros componentes opcionais (por exemplo, reagentes indicadores, agentes seletivos, nutrientes), também podem ser depositados no compartimento de crescimento, opcionalmente, aderidos a uma camada adesiva.

[0083] O posicionamento da base adjacente à folha de cobertura, de modo que o agente gelificante aderido esteja voltado para o compartimento de crescimento disposto entre a base e a folha de cobertura pode ser realizado de uma variedade de formas. Um exemplo representativo de posicionamento da base e da folha de cobertura adjacentes entre si, de modo que uma porção do agente gelificante se sobreponha ao compartimento de crescimento é mostrado nas Figuras 1 a 3. Pode-se notar que a configuração sobreposta permite que um operador deposite um líquido aquoso entre a base e a folha de cobertura, colocando, assim, o agente gelificante, o reagente removedor de oxigênio, o sistema de tampão e o reagente gerador de dióxido de carbono em comunicação fluida.

[0084] Em ainda uma outra realização, a presente invenção apresenta um método para detecção de um micro-organismo. O método usa qualquer realização do dispositivo de cultura da presente invenção descrito acima. O dispositivo de cultura compreende uma base; uma folha de cobertura; um elemento espaçador disposto entre as superfícies internas da base e da folha de cobertura, o elemento espaçador compreendendo uma abertura que define um formato e uma profundidade de um compartimento de crescimento; um agente gelificante seco solúvel em água fria aderido à base ou à folha de cobertura no compartimento de crescimento; e uma quantidade eficaz de um reagente removedor de oxigênio, um sistema de tampão e uma quantidade eficaz de um reagente gerador de dióxido de carbono seco, cada um disposto no compartimento de crescimento, conforme descrito na presente invenção.

[0085] Em qualquer realização, o método compreende abrir o dispositivo de cultura para permitir o acesso ao compartimento de crescimento no mesmo, colocar um volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento, colocar uma amostra no compartimento de crescimento, fechar o dispositivo de cultura, incubar o dispositivo de cultura durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de uma colônia microbiana no meio de cultura e detectar a colônia microbiana, sendo que a colocação do líquido aquoso e da amostra no compartimento de crescimento e o fechamento do dispositivo de cultura compreendem a formação de um meio de cultura microbiano semissólido delimitado pela base, pela folha de cobertura e pelo espaçador do dispositivo de cultura; o meio de cultura tendo um pH entre 4,0 e 6,35.

[0086] Em qualquer realização, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 0,1 mililitro a cerca de 10 mililitros. Em qualquer realização, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 1 mililitro. Em qualquer realização, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 2 mililitros. Em qualquer realização, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 3 mililitros. Em qualquer realização, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 4 mililitros. Em qualquer realização, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 5 mililitros. Em qualquer realização, o volume predeterminado de líquido aquoso usado para hidratar e/ou inocular o dispositivo de cultura é cerca de 10 mililitros. Em qualquer realização, o líquido aquoso usado para hidratar a região de crescimento do dispositivo de cultura é distribuído sobre uma área que resulta em aproximadamente um mililitro de líquido por 20,3 cm2 da região de crescimento.

[0087] Em qualquer realização do método, a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento compreende colocar simultaneamente a amostra no compartimento de crescimento. Por exemplo, a amostra pode ser um líquido (por exemplo, água ou amostra de bebida a ser testada para contaminação microbiana) ou a amostra pode ser uma amostra sólida ou semissólida suspensa em um veículo líquido ou diluente.

[0088] Alternativamente, em qualquer realização, a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento não compreende colocar simultaneamente a amostra no compartimento de crescimento. Por exemplo, a amostra pode compreender um líquido, um sólido, ou um material semissólido que é colocado dentro do compartimento de crescimento antes ou após um volume predefinido (de preferência, estéril) de veículo líquido ou diluente é colocado no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura.

[0089] Tipicamente, o dispositivo de cultura é colocado em uma superfície geralmente plana, e a base e a folha de cobertura são separadas (por exemplo, a folha de cobertura é levantada) para permitir acesso ao compartimento de crescimento do dispositivo de cultura, enquanto o compartimento de crescimento está sendo hidratado e/ou inoculado. Vantajosamente, o dispositivo de cultura pode ser hidratado e/ou inoculado em um ambiente aeróbico (isto é, ar). Tipicamente, um líquido aquoso (que pode incluir material da amostra a ser testada) usado para hidratar o dispositivo é pipetado sobre o compartimento entre a base e a folha de cobertura. Depois que o volume predefinido de líquido aquoso é depositado no compartimento de crescimento, o dispositivo de cultura é fechado (por exemplo, abaixando a folha de cobertura, até entrar em contato com o elemento espaçador). Opcionalmente, um espalhador plano ou côncavo, similar àqueles usados para inocular dispositivos de cultura PETRIFILM, pode ser usado para distribuir o líquido aquoso sobre uma área predefinida no dispositivo de cultura.

[0090] Em qualquer realização do método, a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento pode compreender colocar simultaneamente a amostra no compartimento de crescimento. Nessas realizações, a amostra pode compreender um líquido aquoso e/ou a amostra pode ser diluída ou suspensa em um líquido aquoso.

[0091] Alternativamente, em qualquer realização, a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento não compreende colocar simultaneamente a amostra no compartimento de crescimento. Nessas realizações, um volume predeterminado de líquido aquoso pode ser colocado (por exemplo, pipetado) no compartimento de crescimento antes ou após a colocação da amostra no compartimento de crescimento. Por exemplo, a amostra pode ser capturada em um filtro de membrana, que é colocado no interior do compartimento de crescimento antes ou após o agente gelificante ser hidratado com um líquido aquoso.

[0092] Em qualquer realização do método, a colocação da amostra no compartimento de crescimento compreende a colocação de um ou mais aditivos para o compartimento de crescimento. Um ou mais aditivos podem ser colocados no compartimento de cultura com a amostra ou separadamente. Um ou mais aditivos podem desempenhar uma variedade de funções no método. Por exemplo, em qualquer realização, o um ou mais aditivos podem compreender um nutriente (por exemplo, um nutriente seco) ou um meio nutritivo (por exemplo, um meio nutritivo seco) para facilitar o crescimento de LAB no dispositivo. Estes nutrientes e meios nutritivos são bem conhecidos na técnica e podem ser selecionados com base no micro-organismo específico a ser cultivado. O nutriente e o meio nutritivo não devem interferir substancialmente com o reagente removedor de oxigênio. Isso pode ser prontamente testado mediante o uso de um sensor de oxigênio (por exemplo, um sensor de oxigênio planar, de 5 mm de diâmetro, número de peça 200000023; obtido junto à Presens Precision Sensing GmnH; Regensburg, DE), conforme descrito nos Exemplos 2 a 3 da publicação PCT n° WO2015/061213; que está aqui integralmente incorporada, a título de referência.

[0093] Alternativa ou adicionalmente, em uma realização, o aditivo compreende um ou mais agentes seletivos (por exemplo, um antibiótico, um sal) que favorece o crescimento de um micro-organismo em relação a pelo menos um outro micro-organismo. Em uma realização, o agente seletivo favorece o crescimento de LAB em relação aos micro-organismos LAB ou não LAB. Alternativa ou adicionalmente, em uma realização, o aditivo compreende um reagente indicador (por exemplo, um indicador de pH, um indicador redox, um substrato enzimático cromogênico, um substrato enzimático fluorogênico) para a detecção da presença de um micro-organismo. Um versado na técnica reconhecerá agentes seletivos e reagentes indicadores úteis para detectar LAB. O agente seletivo e/ou o indicador não devem interferir substancialmente no reagente removedor de oxigênio. Isso pode ser facilmente testado pelo uso de um sensor de oxigênio conforme descrito acima.

[0094] Em qualquer realização, uma quantidade eficaz do agente seletivo permite substancialmente a germinação e o crescimento de bactérias formadoras de ácido lático em um dispositivo de cultura, e a quantidade eficaz de agente seletivo inibe substancialmente o crescimento de espécies de E. coli, S. aureus, C. sporogenes, C. perfringens, Bacteroides fragilis, Prevotella melaninogencia e/ou Fusobacterium.

[0095] Ao entrar em contato com líquido aquoso no compartimento de crescimento; os componentes secos (por exemplo, o reagente removedor de oxigênio, o sistema de tampão, o reagente gerador de dióxido de carbono, o nutriente, o reagente indicador, o agente redutor e/ou o agente seletivo) e o líquido aquoso formam uma mistura que compreende uma primeira concentração de oxigênio dissolvido e uma primeira concentração de dióxido de carbono dissolvido.

[0096] Em qualquer realização, a primeira concentração de oxigênio dissolvido na mistura aquosa no compartimento de crescimento pode ser uma concentração que inibe substancialmente o crescimento de um microorganismo obrigatoriamente anaeróbico, um micro-organismo microaerofílico e/ou um micro-organismo microaerotolerante. Nessas realizações, a colocação dos componentes em comunicação fluida aquosa inicia uma reação de remoção de oxigênio, reduzindo, assim, a primeira concentração de oxigênio dissolvido no líquido aquoso no compartimento de crescimento para uma segunda concentração que é mais baixa do que a primeira concentração (por exemplo, ao menos cerca de 25% mais baixa, ao menos cerca de 50% mais baixa, ao menos cerca de 60% mais baixa, ao menos cerca de 70% mais baixa, ao menos cerca de 80%, ao menos cerca de 90%, ao menos cerca de 95%, ao menos cerca de 98%, ao menos cerca de 99% mais baixa, ou mais do que 99% mais baixa do que a primeira concentração).

[0097] Em qualquer realização, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido pode compreender a redução do oxigênio dissolvido na mistura aquosa no compartimento de crescimento para uma segunda concentração que é suficientemente baixa para suportar o crescimento de LAB (por exemplo, LAB aerotolerantes ou LAB obrigatoriamente anaeróbicos).

[0098] Em qualquer realização, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido compreende a redução do oxigênio dissolvido para a segunda concentração na mistura aquosa no compartimento de crescimento em menos ou igual a cerca de 120 minutos após a mistura ser formada. Em qualquer realização, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido compreende a redução do oxigênio dissolvido para a segunda concentração na mistura aquosa no compartimento de crescimento em menos que ou igual a cerca de 90 minutos após a mistura ser formada. Em qualquer realização, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido compreende a redução do oxigênio dissolvido para a segunda concentração na mistura aquosa no compartimento de crescimento em menos que ou igual a cerca de 60 minutos após a mistura ser formada. Em qualquer realização, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido compreende a redução do oxigênio dissolvido para a segunda concentração na mistura aquosa no compartimento de crescimento em menos que ou igual a cerca de 45 minutos após a mistura ser formada. Em qualquer realização, a redução da primeira concentração de oxigênio dissolvido para a segunda concentração de oxigênio dissolvido compreende a redução do oxigênio dissolvido para a segunda concentração na mistura aquosa no compartimento de crescimento em menos que ou igual a cerca de 30 minutos após a mistura ser formada.

[0099] Em qualquer realização, a primeira concentração de dióxido de carbono dissolvido na mistura aquosa no compartimento de crescimento pode ser uma concentração que sustenta o crescimento de um micro-organismo. Nessas realizações, colocar os componentes em uma comunicação fluida aquosa inicia uma reação de geração de dióxido de carbono, aumentando, assim, a primeira concentração de dióxido de carbono disponível na mistura aquosa no compartimento de crescimento para uma segunda concentração (por exemplo, em < 90 minutos, em < 60 minutos ou em < 30 minutos) que é mais alta (por exemplo, cerca de 2 vezes a primeira concentração, cerca de 4 vezes a primeira concentração, cerca de 5 vezes a primeira concentração, cerca de 9,4 vezes a primeira concentração) do que a primeira concentração, conforme mostrado nos Exemplos. O dióxido de carbono disponível adicional não resulta na formação de macroscópicos (isto é, bolhas de gás > 1 mm de diâmetro) no hidrogel formado no compartimento de crescimento, quando um dispositivo de cultura da presente invenção é inoculado e incubado.

[0100] Se o dispositivo de cultura é hidratado antes de o material de amostra ser colocado no aparelho, o agente gelificante solúvel em água fria pode ser opcionalmente deixado hidratar e formar um gel (por exemplo, à temperatura ambiente) por cerca de vários minutos até cerca de 30 minutos ou mais antes que o dispositivo seja reaberto para inocular com o material de cultura. Durante o período em que o agente gelificante pode hidratar e formar um gel, o reagente removedor de oxigênio reduz a concentração de oxigênio dissolvido no agente gelificante hidratado de uma primeira concentração para uma segunda concentração que facilita o crescimento de LAB microaerotolerantes ou obrigatoriamente anaeróbicas, conforme aqui discutido.

[0101] Antes ou depois do compartimento de crescimento do dispositivo de cultura ser hidratado, o material da amostra pode ser colocado em contato com o compartimento de crescimento de uma variedade de maneiras que são conhecidas na técnica. Em qualquer realização, o material de amostra é colocado em contato com a área de crescimento através da deposição do material de amostra na área de crescimento. Isso pode ser feito, por exemplo, por pipetagem, colocando o compartimento de crescimento em contato com um chumaço que foi usado para obter o material da amostra (por exemplo, através de esfregaço de uma superfície), colocando o compartimento de crescimento em contato com uma alça ou agulha de inoculação (por exemplo, com o uso de uma técnica de placa por estrias), ou colocando um dispositivo de captura de amostra (por exemplo, um chumaço, uma esponja, ou filtro de membrana) diretamente no compartimento de crescimento, e fechando novamente o dispositivo de cultura. Após a amostra ser depositada e o dispositivo de cultura ser fechado novamente (tomando cuidado para não aprisionar bolhas de ar visíveis macroscopicamente no dispositivo de cultura), o reagente removedor de oxigênio retoma a depleção do oxigênio dissolvido no compartimento de crescimento.

[0102] Em qualquer realização, após os componentes secos no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura serem hidratados e o agente gelificante formar um gel, o dispositivo de cultura pode ser usado como uma placa de contato (por exemplo, uma placa Rodac). Dessa forma, após o gel ter sido formado, a base e a folha de cobertura do dispositivo de cultura são separadas, expondo o gel hidratado. O gel hidratado é colocado em contato com uma superfície a ser amostrada, e o dispositivo de cultura é fechado novamente, tomando cuidado para não aprisionar bolhas de ar macroscopicamente visíveis no dispositivo de cultura. Ao se fechar novamente o dispositivo, o gel hidratado retorna para o compartimento de crescimento no interior do dispositivo de cultura. Vantajosamente, o procedimento de placa de contato pode ser realizado em ambiente aeróbico e, após fechar novamente o dispositivo de cultura, um ambiente com oxigênio reduzido pode ser restabelecido no dispositivo de cultura pelo reagente removedor de oxigênio.

[0103] Em qualquer realização do método, após a amostra ser colocada no compartimento de crescimento e fechada, o dispositivo de cultura é incubado por um período de tempo (por exemplo, um período de tempo predeterminado). As condições de incubação (por exemplo, a temperatura de incubação) podem afetar a taxa de crescimento de LAB, como é bem conhecido por um versado na técnica. Por exemplo, a incubação a temperaturas mais baixas (por exemplo, cerca de 25°C) pode permitir a detecção de LAB psicrotróficas). A incubação a temperaturas mais elevadas (por exemplo, cerca de 30°C, cerca de 32°C, cerca de 35°C, cerca de 37°C) pode facilitar o crescimento mais rápido de certas LAB mesofílicas.

[0104] Em algumas realizações, após a inoculação, o dispositivo de cultura pode ser incubado durante ao menos cerca de 16 horas, ao menos cerca de 18 horas, ao menos cerca de 24 horas, ou ao menos cerca de 48 horas. Em algumas realizações, o dispositivo de cultura pode ser incubado por não mais que cerca de 24 horas, não mais que cerca de 48 horas, ou não mais que cerca de 72 horas. Em determinadas realizações preferenciais, o dispositivo de cultura é incubado durante cerca de 24 horas a cerca de 48 horas. Em qualquer realização, o dispositivo de cultura pode ser incubado e manter um ambiente de oxigênio reduzido no mesmo, por cerca de 72 horas, por cerca de 96 horas, por cerca de 120 horas, por cerca de 7 dias, por cerca de 8 dias ou antes da detecção ou contagem de colônias de LAB que crescem no compartimento de crescimento. Em qualquer realização, a incubação do dispositivo de cultura por um período de tempo suficiente para permitir a formação de uma colônia microbiana compreende a incubação do dispositivo de cultura durante o período de tempo em uma atmosfera aeróbica (isto é, o dispositivo de cultura não é colocado em um recipiente de oxigênio reduzido ou caixa de luvas para incubação).

[0105] Após o dispositivo de cultura inoculado ser incubado, o método compreende adicionalmente a detecção de uma colônia microbiana. As colônias microbianas podem ser detectadas no dispositivo de cultura por uma variedade de técnicas que são conhecidas na técnica. Após um período de incubação adequado, a ausência de um micro-organismo pode ser detectada em um dispositivo de cultura pela ausência de colônias observáveis, ausência de uma alteração em um indicador de crescimento (por exemplo, um indicador de pH, um substrato enzimático cromogênico, um indicador de oxirredução como TTC, um substrato enzimático fluorogênico) e ausência de bolhas de gás associadas ao metabolismo do carboidrato fermentável no meio de crescimento.

[0106] Uma zona ácida associada a uma colônia de microorganismos pode ser detectada visualmente e/ou com o uso de um sistema de imageamento. Por exemplo, em um método em que o meio de cultura compreende púrpura de bromocresol como um indicador de pH, o meio de cultura terá uma aparência púrpura ou cinza a cerca de um pH neutro. À medida que os micro-organismos crescem e fermentam um carboidrato (por exemplo, glicose) no meio de cultura, o indicador púrpura de bromocresol aparecerá amarelo adjacente às colônias de bactérias em crescimento. Por exemplo, em um método em que o meio de cultura compreende vermelho de clorofenol como um indicador de pH, o meio de cultura terá uma aparência vermelha ou violeta a cerca de um pH neutro. À medida que os micro-organismos fermentam um carboidrato no meio de cultura, o indicador vermelho de clorofenol aparecerá amarelo adjacente às colônias de micróbios.

[0107] As bolhas de gás, caso estejam presentes no compartimento de crescimento e associadas a uma colônia de microorganismos (por exemplo, ou tocando a colônia ou em uma distância de cerca de 1 mm ou menos a partir da colônia), podem ser detectadas visualmente e/ou com o uso de um sistema de imageamento. As bolhas de gás podem ser associadas a uma colônia visível e/ou uma zona ácida detectável através de uma alteração na cor do indicador de um pH em uma região adjacente à colônia de micro-organismos. A bolha de gás pode compreender dióxido de carbono gerado pela fermentação anaeróbica de um carboidrato, por exemplo.

[0108] Em qualquer uma das realizações anteriores, o método pode compreender ainda a obtenção de uma imagem do dispositivo de cultura. Nessas realizações, a detecção da presença ou ausência de um LAB compreende a exibição, a impressão ou a análise da imagem do dispositivo de cultura. O sistema de formação de imagens compreende um dispositivo de imageamento e pode compreender um processador. Em algumas realizações, o dispositivo de formação de imagens pode compreender um scanner de linha ou um scanner de área (por exemplo, uma câmera). O dispositivo de formação de imagens pode incluir um escâner monocromático (por exemplo, preto-e-branco) ou um escâner policromático (por exemplo, colorido). Vantajosamente, os sistemas de formação de imagens monocromáticas podem fornecer imagens de resolução mais alta, o que pode otimizar a exatidão do resultado e/ou reduzir o tempo necessário para detectar a presença de micro-organismos no dispositivo de cultura.

[0109] Em algumas realizações, o sistema de formação de imagens compreende, ainda, um sistema de iluminação. O sistema de iluminação pode incluir pelo menos uma fonte de luz visível de amplo espectro (por exemplo, uma luz "branca"). Em algumas realizações, o sistema de iluminação pode incluir pelo menos uma fonte de luz visível de espectro estreito (por exemplo, um diodo emissor de luz que emite uma largura de banda relativamente estreita da luz visível como, por exemplo, luz vermelha, verde ou azul). Em certas realizações, o sistema de iluminação pode incluir uma fonte de luz visível de espectro estreito (por exemplo, um diodo emissor de luz) com um pico de emissão de luz em um comprimento de onda pré-selecionado (cerca de 525 nm).

[0110] A imagem pode ser obtida a partir da luz refletida pelos componentes (por exemplo, colônias microbianas, meio de crescimento e indicadores) para o compartimento de crescimento do dispositivo de cultura ou a imagem pode ser obtida a partir de luz transmitida através dos componentes no compartimento de crescimento do dispositivo de cultura. Sistemas de imageamento adequados e os correspondentes sistemas de iluminação são descritos, por exemplo, na publicação de patente internacional n° WO 2005/024047 e nas publicações dos pedidos de patentes U.S. n° US 2004/0101954 e US 2004/0102903, cada uma das quais sendo aqui incorporada, a título de referência, em sua totalidade. Alguns exemplos não limitadores de sistemas de imageamento adequados incluem o leitor de placa PETRIFILM (PPR), disponível junto à 3M Company (St. Paul, MN, EUA), o contador de colônias PETRISCAN disponível junto à Spiral Biotech (Norwood, MA, EUA), e os scanners de placas PROTOCOL e ACOLYTE disponíveis junto à Synbiosis (Cambridge, Reino Unido).

[0111] Em algumas realizações, a obtenção de uma imagem compreende a obtenção de uma imagem de comprimento de onda inclinado. Por exemplo, o sistema de formação de imagens pode incluir um filtro de inclinação que inclina a luz coletada pelo dispositivo de formação de imagens. Os elementos filtrantes são conhecidos na técnica e incluem tanto filtros de "corte" (isto é, filtros que permitem a passagem de comprimentos de onda da luz ou acima ou abaixo de um certo comprimento de onda especificado) e filtros de "passagem de banda" (isto é, filtros que permitem a passagem de comprimentos de onda de luz entre certos limites superior e inferior especificados). Um filtro de inclinação pode ser posicionado entre a fonte de iluminação e o dispositivo de cultura. Alternativa ou adicionalmente, um filtro de inclinação pode ser posicionado entre o dispositivo de cultura e o dispositivo de formação de imagens.

REALIZAÇÕES EXEMPLIFICADORAS

[0112] A Realização A é um dispositivo de cultura para a enumeração de colônias de micro-organismos alvo, sendo que o dispositivo compreende: uma base tendo superfícies interna e externa opostas; uma folha de cobertura tendo superfícies interna e externa opostas; um elemento espaçador não poroso, disposto entre a base e a folha de cobertura, sendo que o elemento espaçador é acoplado à base ou à folha de cobertura, sendo que o elemento espaçador compreende uma abertura que define um formato e uma profundidade de um compartimento de crescimento, sendo que o elemento espaçador e o compartimento de crescimento estão dispostos entre a superfície interna da base e a superfície interna da folha de cobertura; uma quantidade eficaz de um reagente removedor de oxigênio disposta no compartimento de crescimento, sendo que o reagente removedor de oxigênio consiste essencialmente em partículas que têm um diâmetro menor do que 106 mícrons; um agente gelificante solúvel em água fria seco, disposto no compartimento, sendo que o agente gelificante é aderido à base ou à folha de cobertura no compartimento de crescimento; um sistema de tampão seco disposto no compartimento de crescimento que, quando o compartimento de crescimento é hidratado com um volume predeterminado de água desionizada, forma uma mistura aquosa com um pH menor ou igual a 6,35; e uma quantidade eficaz de um reagente gerador de dióxido de carbono seco, disposto no compartimento de crescimento, sendo que o reagente gerador de dióxido de carbono consiste essencialmente em partículas tendo um diâmetro menor do que 106 mícrons.

[0113] A Realização B é o dispositivo de cultura da Realização A, sendo que o reagente removedor de oxigênio consiste essencialmente em partículas tendo um diâmetro menor do que 106 mícrons.

[0114] A Realização C é o dispositivo de cultura da Realização A ou da Realização B, sendo que o reagente gerador de dióxido de carbono consiste essencialmente em partículas que têm um diâmetro menor do que 106 mícrons.

[0115] A Realização D é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores, compreendendo adicionalmente um nutriente seco disposto no compartimento de crescimento, sendo que o nutriente é selecionado para facilitar o crescimento do micro-organismo alvo.

[0116] A Realização E é o dispositivo de cultura da Realização D, sendo que o nutriente compreende um carboidrato fermentável.

[0117] A Realização F é o dispositivo de cultura da Realização E, sendo que o carboidrato é selecionado do grupo consistindo em glicose, maltose, sacarose e trealose.

[0118] A Realização G é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores, compreendendo adicionalmente um primeiro reagente indicador disposto no compartimento de crescimento, sendo que o primeiro reagente indicador é selecionado para detectar o crescimento do micro-organismo alvo.

[0119] A Realização H é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores, compreendendo adicionalmente uma quantidade eficaz de um agente seletivo disposto no compartimento de crescimento, sendo que o agente seletivo é selecionado para inibir o crescimento de um micro-organismo não alvo.

[0120] A Realização I é o dispositivo de cultura da Realização H, sendo que o agente seletivo é selecionado dentre o grupo consistindo em cicloeximida, um polieno macrolídeo, anfotericina B, natamicina e filipina.

[0121] A Realização J é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores, compreendendo adicionalmente uma quantidade eficaz de um agente redutor disposto no compartimento de crescimento.

[0122] A Realização K é o dispositivo de cultura da Realização J, sendo que o agente redutor é selecionado do grupo consistindo em tioglicolato de sódio, ditiotreitol e ditioeritritol.

[0123] A Realização L é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores, sendo que o reagente removedor de oxigênio está aderido à base ou à folha de cobertura no compartimento de crescimento.

[0124] A Realização M é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores, sendo que o componente do sistema de tampão está aderido à base ou à folha de cobertura no compartimento de crescimento.

[0125] A Realização N é o dispositivo de qualquer uma das Realizações anteriores, sendo que o sistema de tampão compreende um componente selecionado do grupo consistindo em 2-(N-morfolino)etano sulfônico e 2-sódio(N-morfolino)etano sulfônico e ácido succínico e succinato de sódio.

[0126] A Realização O é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores, sendo que o reagente gerador de dióxido de carbono está aderido à base ou à folha de cobertura no compartimento de crescimento.

[0127] A Realização P é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores, sendo que o reagente gerador de dióxido de carbono compreende um carbonato metálico.

[0128] A Realização Q é o dispositivo de cultura da Realização P, sendo que o carbonato metálico é selecionado do grupo que consiste em bicarbonato de sódio e carbonato de sódio.

[0129] A Realização R é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações D a K, sendo que o nutriente está aderido à base ou à folha de cobertura no compartimento de crescimento.

[0130] A Realização S é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações G a R, sendo que o primeiro reagente indicador está aderido à base ou à folha de cobertura no compartimento de crescimento.

[0131] A Realização T é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações H a S, sendo que o agente seletivo está aderido à base ou à folha de cobertura no compartimento de crescimento.

[0132] A Realização U é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações I a T, sendo que o agente redutor está aderido à base ou à folha de cobertura no compartimento de crescimento.

[0133] A Realização V é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores: sendo que a superfície interna da base tem um primeiro adesivo aderido à mesma; sendo que um ou mais dos primeiros componentes dispostos no compartimento de crescimento são aderidos ao primeiro adesivo; sendo que o primeiro componente é selecionado do grupo consistindo no agente gelificante, no reagente removedor de oxigênio, no sistema tampão, no nutriente, no reagente indicador, no agente seletivo, no agente redutor e uma combinação de quaisquer dois ou mais dos primeiros componentes anteriores.

[0134] A Realização W é o dispositivo de cultura da Realização V: sendo que um segundo componente é disposto no primeiro adesivo; sendo que o segundo componente é selecionado do grupo que consiste no reagente indicador, agente seletivo, e combinações dos mesmos.

[0135] A Realização X é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores: sendo que a superfície interna da folha de cobertura tem um segundo adesivo aderido à mesma; sendo que um ou mais dos terceiros componentes dispostos no compartimento de crescimento são aderidos ao segundo adesivo; sendo que o terceiro componente é selecionado do grupo consistindo no agente gelificante, no reagente removedor de oxigênio, no sistema de tampão, no nutriente, no reagente indicador, no agente seletivo, no agente redutor e uma combinação de quaisquer dois ou mais dos terceiros componentes anteriores.

[0136] A Realização Y é o dispositivo de cultura da Realização X: sendo que um quarto componente é disposto no segundo adesivo; sendo que o quarto componente é selecionado do grupo que consiste no reagente indicador, agente seletivo, e combinações dos mesmos.

[0137] A Realização Z é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores, sendo que o reagente gerador de dióxido de carbono compreende um sal de ácido carbônico.

[0138] A Realização AA é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores, sendo que o reagente removedor de oxigênio compreende ferro ferroso ou um sal do mesmo, ou ácido ascórbico ou um sal do mesmo.

[0139] A Realização AB é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores, sendo que compreende adicionalmente um segundo reagente indicador disposto em comunicação fluida com o compartimento de crescimento, sendo que o segundo reagente indicador indica uma presença de micro-organismos não alvo e do micro-organismo alvo.

[0140] A Realização AC é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores, sendo que o reagente removedor de oxigênio é disposto no compartimento de crescimento em uma quantidade de cerca de 1,5 micromol/10 cm2 a cerca de 15 micromols/10 cm2 de área superficial da base ou da folha de cobertura no compartimento de crescimento.

[0141] A Realização AD é o dispositivo de cultura de qualquer uma das Realizações anteriores, sendo que o reagente gerador de dióxido de carbono é disposto no compartimento de crescimento em uma quantidade de cerca de 1 micromol/10 cm2 a cerca de 15 micromols/10 cm2 de área superficial da base ou da folha de cobertura no compartimento de crescimento.

[0142] A Realização AE é um método de detecção de um micro-organismo em uma amostra, sendo que o método compreende: abrir o dispositivo de cultura de acordo com qualquer uma das Realizações anteriores para fornecer acesso ao compartimento no mesmo; colocar um volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento; colocar uma amostra no compartimento de crescimento; fechar o dispositivo de cultura, sendo que a colocação do líquido aquoso e da amostra no compartimento de crescimento e o fechamento do dispositivo de cultura compreendem a formação de um meio de cultura microbiano semissólido delimitado pela base, folha de cobertura e elemento espaçador do dispositivo de cultura; o meio de cultura tendo um pH entre 4,0 e 6,35; incubar o dispositivo de cultura inoculado por tempo suficiente para permitir a formação de uma colônia microbiana no meio de cultura; e detectar a colônia microbiana.

[0143] A Realização AF é o método da Realização AE, sendo que a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento compreende colocar simultaneamente a amostra no compartimento de crescimento.

[0144] A Realização AG é o método da Realização AE, sendo que a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento não compreende colocar simultaneamente a amostra no compartimento de crescimento.

[0145] A Realização AH é o método da Realização AG, sendo que a colocação da amostra no compartimento de crescimento ocorre após a colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento.

[0146] A Realização AI é o método da Realização AG, sendo que a colocação da amostra no compartimento de crescimento ocorre antes da colocação do volume predeterminado no compartimento de crescimento.

[0147] A Realização AJ é o método de qualquer uma das Realizações AE a AI, sendo que a colocação da amostra no compartimento de crescimento compreende a colocação de um aditivo no compartimento de crescimento.

[0148] A Realização AK é o método de qualquer uma das Realizações AE a AJ, sendo que a colocação do aditivo no compartimento de crescimento compreende a colocação de uma quantidade eficaz de um agente seletivo ou um indicador.

[0149] A Realização AL é o método da Realização AK, sendo que a quantidade eficaz do agente seletivo permite substancialmente o crescimento de bactérias formadoras de ácido lático no dispositivo de cultura, e a quantidade eficaz de agente seletivo inibe substancialmente o crescimento de espécies de E. coli, S. aureus, C. sporogenes, C. perfringens, Bacteroides fragilis, Prevotella melaninogencia e/ou Fusobacterium.

[0150] A Realização AM é o método de qualquer uma das Realizações AE a AL, sendo que a incubação do dispositivo de cultura durante um período de tempo compreende incubar o dispositivo de cultura durante o período de tempo em uma atmosfera aeróbica.

[0151] A Realização AN é o método de qualquer uma das Realizações AE a AM, sendo que após a incubação do dispositivo de cultura, a detecção da colônia microbiana compreende adicionalmente a enumeração de uma ou mais colônias opticamente detectáveis no dispositivo de cultura.

[0152] A Realização AO é o método de qualquer uma das Realizações AE a AN, sendo que o dispositivo de cultura compreende o reagente indicador disposto no compartimento de crescimento, sendo que a detecção da colônia microbiana compreende a detecção de uma mudança óptica associada ao reagente indicador, sendo que a mudança óptica é detectada próxima à colônia microbiana.

[0153] A Realização AP é o método de acordo com a Realização AO, sendo que a mudança óptica compreende uma mudança de cor.

[0154] A Realização AQ é o método de qualquer uma das Realizações de AE a AP, sendo que a detecção da colônia microbiana compreende detectar opticamente uma bolha de gás próxima à colônia no compartimento de crescimento.

[0155] A Realização AR é o método de qualquer uma das Realizações AN a AQ, sendo que a enumeração de uma ou mais colônias microbianas compreende adicionalmente a distinção de colônias produtoras de dióxido de carbono das colônias não produtoras de dióxido de carbono.

[0156] Os objetivos e as vantagens da presente invenção são ilustrados, adicionalmente, pelos exemplos a seguir, porém, os materiais e as quantidades particulares relatados nesses exemplos, bem como outras condições e detalhes, não devem ser interpretados como limitando indevidamente esta invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DE UM DISPOSITIVO DE CULTURA GERADOR DE AMBIENTE ANAERÓBICO EM PEÇA ÚNICA

[0157] O dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico em peça única de acordo com a Figura 1 foi construído. A base consistia em um filme de poliéster com 0,127 mm (5 mil) de espessura (filme de poliéster orientado biaxialmente MELINEX Grau 377 (PET), obtido junto à DuPont Teijin, Chester, VA, EUA). Uma formulação em pó de nutrientes (listada na Tabela 1) e goma guar (16 g/l) foram agitadas em água desionizada para alcançar uma mistura substancialmente uniforme. O pH da mistura foi definido para ser de 5,8 +/- 0,5 e ajustado com ácido ou base, se necessário, para alcançar o valor alvo. A mistura foi revestida com lâmina sobre a base, conforme descrito na patente US n° 4.565.783 e seca durante 8 minutos a 98,9°C (210°F) em um forno de convecção. A camada de nutrientes foi revestida a uma espessura que resultou em um peso de revestimento alvo (após secagem) de 3,6 mg/cm2 (0,56 g/24 pol2). Após a secagem, um espaçador de filme de polietileno (Optimum Plastics, Bloomer, WI, EUA) de aproximadamente 0,508 mm (20 mils) de espessura foi aderido ao revestimento a seco na base por meio de uma camada fina de um adesivo sensível à pressão (98%, em peso de acrilato de isooctila copolimerizado com ácido acrílico a 2%, em peso). O espaçador continha uma abertura de diâmetro circular de 6,03 cm (2 3/8 de polegada) que definia o orifício no espaçador ilustrado na Figura 1. A abertura circular definia o perímetro do compartimento de crescimento do dispositivo.

[0158] Ascorbato de sódio (Sigma-Aldrich Corporation, Saint Louis, MO, EUA) e bicarbonato de sódio (Sigma - Aldrich Corporation) foram individualmente moídos e então, passados através de uma peneira de 140 mesh (resultando em um tamanho de partícula menor do que 106 mícrons). Uma mistura homogênea de goma guar (89,75% em peso disponível junto à Dupont, Danisco, Copenhagen, Dinamarca), ascorbato de sódio peneirado (10% em peso), e bicarbonato de sódio peneirado (0,25% em peso) foi preparada. A folha de cobertura consistia em um filme de poliéster transparente (PET) (0,073 mm de espessura) que foi revestido em um lado com um segundo adesivo sensível à pressão (96%, em peso de acrilato de iso-octila copolimerizado com acrilamida a 4%) a um peso de revestimento de 1,3 mg/cm2 (0,2 g/24 pol2). A mistura homogênea de goma guar, ascorbato de sódio peneirado e bicarbonato de sódio peneirado foi, então, revestida com pó sobre o adesivo da folha de cobertura. A folha de cobertura foi fixada à base ao longo de uma borda, usando-se uma fita adesiva de dupla-face e os dispositivos foram cortados em retângulos de aproximadamente 7,6 cm (3") por 10,1 cm (4"), similares àqueles mostrados na Figura 1. O lado revestido da folha de cobertura foi orientado para estar voltado para o espaçador e o compartimento de crescimento. TABELA 1. FORMULAÇÃO EM PÓ DE NUTRIENTES USADA PARA REVESTIR A BASE DO DISPOSITIVO DO EXEMPLO 1

EXEMPLO 2

[0159] Um dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico em uma peça única foi preparado de acordo com a descrição do Exemplo 1, com a exceção de que, ao invés do revestimento com mistura de pó do Exemplo 1, o adesivo da folha de cobertura foi revestido com uma mistura de pó de goma guar (89,7%, em peso), ascorbato de sódio (10%, em peso) e bicarbonato de sódio (0,3%, em peso).

EXEMPLO 3

[0160] Um dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico em uma peça única foi preparado de acordo com a descrição do Exemplo 1, com a exceção de que, ao invés do revestimento com mistura de pó do Exemplo 1, o adesivo da folha de cobertura foi revestido com uma mistura de pó de goma guar (89,5%, em peso), ascorbato de sódio (10%, em peso) e bicarbonato de sódio (0,5%, em peso).

EXEMPLO 4

[0161] Um dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico em uma peça única foi preparado de acordo com a descrição do Exemplo 1, com a exceção de que, ao invés do revestimento com mistura de pó do Exemplo 1, o adesivo da folha de cobertura foi revestido com uma mistura de pó de goma guar (89,0%, em peso), ascorbato de sódio (10%, em peso) e bicarbonato de sódio (1,0%, em peso).

EXEMPLO 5

[0162] Um dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico em uma peça única foi preparado de acordo com a descrição do Exemplo 1, com a exceção de que, ao invés do revestimento com mistura de pó do Exemplo 1, o adesivo da folha de cobertura foi revestido com uma mistura de pó de goma guar (88,0%, em peso), ascorbato de sódio (10%, em peso) e bicarbonato de sódio (2,0%, em peso).

EXEMPLO 6. MEDIÇÕES DA CONCENTRAÇÃO DE CO2 NOS DISPOSITIVOS DOS EXEMPLOS 1 A 5

[0163] O dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico em peça única dos Exemplos 1 a 5 foram monitorados quanto à geração de CO2 usando um transmissor de fibra ótica mini v2 pCO2 (PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, DE cat# 200001207) com o software fornecido pelo fornecedor para medição da tensão de CO2. Cada dispositivo foi aberto levantando a folha de cobertura para expor a região de crescimento do compartimento de crescimento. Um mililitro de tampão de Butterfield estéril foi depositado no compartimento de crescimento de cada placa. Um sensor de CO2 fino (5 mm de diâmetro e 200 mícrons de espessura) (Planar pCO2 Minisensor Spot, PreSens Precision Sensing GmbH, cat# 200001178) foi imediatamente colocado no compartimento de crescimento hidratado, e a folha de cobertura foi suavemente abaixada até que ela entrasse em contato a região de crescimento hidratada e o espaçador. Um distribuidor plástico plano foi pressionado sobre o dispositivo fechado para espalhar o líquido através do compartimento de crescimento. Após o fechamento do dispositivo, a fluorescência do sensor foi monitorada usando um cabo de fibra óptica polimérica para o transmissor. As medições da concentração de CO2 no compartimento de crescimento hidratado foram registradas imediatamente após o fechamento do dispositivo e 90 minutos mais tarde. Na Tabela 2 o aumento médio em vezes na concentração de CO2 medida após 90 minutos é reportada (n=5). TABELA 2

EXEMPLO 7. PREPARAÇÃO E USO DE UM DISPOSITIVO DE CULTURA GERADOR DE AMBIENTE ANAERÓBICO EM PEÇA ÚNICA

[0164] O dispositivo de cultura gerador de ambiente anaeróbico em peça única de acordo com a Figura 1 foi construído. A base foi revestida e preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1, com a única exceção de que goma guar (14 g/l) foi combinada com a formulação de nutrientes da Tabela 3, em vez da formulação na Tabela 1.

[0165] Ascorbato de sódio (Sigma-Aldrich Corporation, Saint Louis, MO, EUA) e bicarbonato de sódio (Sigma - Aldrich Corporation) foram individualmente moídos e então, passados através de uma peneira de 140 mesh (resultando em um tamanho de partícula menor do que 106 mícrons). Uma mistura homogênea de goma guar (89,7% em peso disponível junto à Dupont, Danisco, Copenhagen, Dinamarca), ascorbato de sódio peneirado (10%, em peso) e bicarbonato de sódio peneirado (0,3%, em peso) foi preparada. A folha de cobertura consistia em um filme de poliéster transparente (PET) (0,073 mm de espessura) que foi revestido em um lado com um segundo adesivo sensível à pressão (96%, em peso de acrilato de iso-octila copolimerizado com acrilamida a 4%) a um peso de revestimento de 1,3 mg/cm2 (0,2 g/24 pol2). Uma quantidade-traço de cloreto de trifenil tetrazólio (cerca de 0,003 mg/24 pol2 (0,48 mg/cm2)) foi incorporada no adesivo. A mistura homogênea de goma guar, ascorbato de sódio peneirado e bicarbonato de sódio peneirado foi, então, revestida com pó sobre o adesivo da folha de cobertura. A folha de cobertura foi fixada à base ao longo de uma borda, usando-se uma fita adesiva de dupla-face e os dispositivos foram cortados em retângulos de aproximadamente 7,6 cm (3") por 10,1 cm (4"), similares àqueles mostrados na Figura 1. O lado revestido da folha de cobertura foi orientado para estar voltado para o espaçador e o compartimento de crescimento.

[0166] Amostras individuais das cepas bacterianas de Lactobacillus, Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides ssp dextranicum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbruekii, Streptococcus alactolyticus, Lactococcus garvieae, e Pediococcus acidilactici foram obtidas como isolados naturais de amostras de alimento e de bebidas. Suspensões individuais foram preparadas em tampão de Butterfield e diluídas em série para se obter suspensões com concentrações finais (de organismos individuais) que forneceram contagens de UFC de cerca de 100. Um mililitro de cada suspensão foi usado para inocular dispositivos de cultura individuais produzidos de acordo com o Exemplo. Os dispositivos de cultura foram inoculados pelo levantamento da folha de cobertura para expor a região de crescimento do compartimento de crescimento, pipetagem de um mililitro da suspensão para o compartimento de crescimento, abaixando suavemente a folha de cobertura até que entre em contato com a suspensão e o espaçador, e pressionando suavemente o espalhador de plástico plano sobre o dispositivo fechado para espalhar a suspensão líquida por todo o compartimento de crescimento.

[0167] Após a inoculação, os dispositivos de cultura foram incubados a 32°C durante 48 horas em uma incubadora aeróbica. Após a incubação, as colônias de cor vermelha em cada dispositivo de cultura foram contadas por exame visual. A média da contagem de colônia (n=2) foi determinada para cada organismo.

[0168] Como uma referência comparativa, as placas de ágar foram inoculadas com suspensões individuais da mesma diluição e volume como usado anteriormente com o dispositivo de cultura deste Exemplo. A placa de ágar foi preparada com o uso de Ágar Lactobacilli MRS (Becton Dickinson Corporation, New Franklin, NJ, EUA). O ágar (70 g) foi sequencialmente suspenso em 1 L de água purificada; fervido durante 1 minuto para dissolver o pó; autoclavado a 121°C durante 15 minutos; e resfriado até 45 a 50°C. O meio resfriado (15 a 20 ml por placa) foi, então, vertido em placas de Petri estéreis que continham 1 mL da suspensão de amostra individual. O inóculo foi distribuído por toda a placa girando a placa em uma direção, e, então na direção oposta. A placa inoculada foi, então, colocada em uma câmara anaeróbica junto com um sachê gerador de gás (GASPAK EZ Anaerobe Sachet, Becton Dickinson Corp.) que forneceu uma atmosfera anaeróbia durante o período de incubação. As placas de ágar foram incubadas a 32°C durante 48 horas. Após a incubação, as colônias nas placas foram contadas por exame visual. A média da contagem de colônia (n=2) foi determinada para cada organismo.

[0169] Na Tabela 4, a razão entre a média de contagem de colônias determinada usando o dispositivo de cultura do Exemplo comparada com a média de contagem de colônias determinada com o uso de uma placa de ágar de referência é mostrada para cada organismo testado [isto é, razão=(média de contagem de colônias usando o dispositivo de cultura do Exemplo)/(média de contagem de colônia usando a placa de ágar de referência)]. TABELA 3. FORMULAÇÃO EM PÓ DE NUTRIENTES USADA PARA REVESTIR A BASE DO DISPOSITIVO DO EXEMPLO 7

TABELA 4. RAZÕES DE CONTAGEM DE COLÔNIAS PARA CEPAS BACTERIANAS DO EXEMPLO 7 [RAZÃO=(MÉDIA DA CONTAGEM DE COLÔNIAS USANDO O DISPOSITIVO DE CULTURA DO EXEMPLO 7)/(MÉDIA DA COLÔNIA USANDO A PLACA DE ÁGAR DE REFERÊNCIA)]

[0170] A invenção completa de todas as patentes, pedidos de patente, publicações, e material disponível eletronicamente citados no presente documento estão aqui incorporados, a título de referência. Caso exista qualquer inconsistência entre a invenção do presente pedido e a invenção (ou invenções) de qualquer documento aqui incorporado, a título de referência, a invenção do presente pedido deve prevalecer. A descrição detalhada e os exemplos anteriormente mencionados foram oferecidos somente por uma questão de clareza de entendimento. Nenhuma limitação desnecessária deve ser inferida a partir dos mesmos. A invenção não se limita aos detalhes exatos mostrados e descritos, visto que variações óbvias aos versados na técnica estarão incluídas na invenção definida pelas reivindicações.

[0171] Todos os cabeçalhos são para a comodidade do leitor e não devem ser usados para limitar o significado do texto que segue aos cabeçalhos, a menos que esteja especificado.

[0172] Várias modificações podem ser feitas sem se afastar do escopo da invenção. Essas e outras realizações estão no escopo das reivindicações a seguir.

Claims

1. DISPOSITIVO DE CULTURA (100), para a enumeração de colônias de micro-organismos alvo, compreendendo: uma base (10) tendo superfícies interna (10b) e externa opostas (10a); uma folha de cobertura (20) tendo superfícies interna (20b) e externa (20a) opostas; um elemento espaçador (30) não poroso, disposto entre a base (10) e a folha de cobertura (20), em que o elemento espaçador (30) é acoplado à base (10) ou à folha de cobertura (20), em que o elemento espaçador (30) compreende uma abertura (36) que define um formato e uma profundidade de um compartimento de crescimento (60), sendo que o elemento espaçador (30) e o compartimento de crescimento (60) estão dispostos entre a superfície interna (10b) da base (10) e a superfície interna (20b) da folha de cobertura (20); um agente gelificante solúvel em água fria seco (14, 24), disposto no compartimento de crescimento (60), em que o agente gelificante (14, 24) é aderido à base (10) ou à folha de cobertura (20) no compartimento de crescimento (60); o dispositivo de cultura (100) caracterizado por compreender adicionalmente: um reagente removedor de oxigênio seco disposto no compartimento de crescimento (60) em uma quantidade de 1,5 micromol/10 cm2 de área superficial da base (10) ou da folha de cobertura (20) no compartimento de crescimento (60) a 15 micromols/10 cm2 de área superficial da base (10) ou da folha de cobertura (20) no compartimento de crescimento (60); um sistema de tampão seco disposto no compartimento de crescimento (60) que, quando o compartimento de crescimento (60) é hidratado com um volume predeterminado de água desionizada, forma uma mistura aquosa com um pH menor que ou igual a 6,35; e um reagente gerador de dióxido de carbono seco disposto no compartimento de crescimento (60) em uma quantidade de 1 micromol/10 cm2 de área superficial da base (10) ou da folha de cobertura (20) no compartimento de crescimento (60) a 15 micromols/10 cm2 de área superficial da base (10) ou da folha de cobertura (20) no compartimento de crescimento (60).

2. DISPOSITIVO (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo reagente de eliminação de oxigênio consistir de partículas que tenham um diâmetro menor que 106 mícrons e pelo reagente gerador de dióxido de carbono consistir de partículas que tenham um diâmetro menor que 106 mícrons.

3. DISPOSITIVO (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por compreender adicionalmente um nutriente seco disposto no compartimento de crescimento (60), em que o nutriente é selecionado para facilitar o crescimento do micro-organismo alvo.

4. DISPOSITIVO (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender adicionalmente um primeiro reagente indicador disposto no compartimento de crescimento (60), em que o primeiro reagente indicador é selecionado para a detecção do crescimento do micro-organismo alvo.

5. DISPOSITIVO (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender adicionalmente um agente seletivo disposto no compartimento de crescimento (60), em que o agente seletivo é selecionado para inibir o crescimento de um micro-organismo não alvo.

6. DISPOSITIVO (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender adicionalmente um agente redutor disposto no compartimento de crescimento (60).

7. DISPOSITIVO (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo reagente gerador de dióxido de carbono compreender um carbonato metálico ou um sal de ácido carbônico; e pelo reagente removedor de oxigênio compreender ferro ferroso ou um sal do mesmo ou ácido ascórbico ou um sal do mesmo.

8. DISPOSITIVO (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado: pela superfície interna (10b) da base (10) ter um primeiro adesivo (12) aderido à mesma; por um ou mais dos primeiros componentes dispostos no compartimento de crescimento (60) serem aderidos ao primeiro adesivo (12); pelo primeiro componente ser selecionado do grupo consistindo no agente gelificante, no reagente removedor de oxigênio, no sistema tampão, no nutriente, no reagente indicador, no agente seletivo, no agente redutor e uma combinação de quaisquer dois ou mais dos primeiros componentes anteriores.

9. DISPOSITIVO (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado: pela superfície interna (20b) da folha de cobertura (20) ter um segundo adesivo (22) aderido à mesma; por um ou mais dos terceiros componentes dispostos no compartimento de crescimento (60) serem aderidos ao segundo adesivo (22); pelo terceiro componente ser selecionado do grupo consistindo no agente gelificante, no reagente removedor de oxigênio, no sistema de tampão, no nutriente, no reagente indicador, no agente seletivo, no agente redutor e uma combinação de quaisquer dois ou mais dos terceiros componentes anteriores.

10. MÉTODO DE DETECÇÃO DE UM MICRO-ORGANISMO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender as etapas de: abrir um dispositivo de cultura (100), conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, para fornecer acesso ao compartimento de crescimento (60) no mesmo; colocar um volume predefinido de líquido aquoso no compartimento de crescimento (60); colocar uma amostra no compartimento de crescimento (60); fechar o dispositivo de cultura (100), em que a colocação do líquido aquoso e da amostra no compartimento de crescimento (60) e o fechamento do dispositivo de cultura (100) compreendem a formação de um meio de cultura microbiano semissólido delimitado pela base (10), folha de cobertura (20) e elemento espaçador (30) do dispositivo de cultura (100); o meio de cultura tendo um pH entre 4,0 e 6,35; incubar o dispositivo de cultura (100) inoculado por tempo suficiente para permitir a formação de uma colônia microbiana no meio de cultura; e detectar a colônia microbiana.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela colocação da amostra no compartimento de crescimento (60) compreender a colocação de um aditivo no compartimento de crescimento (60), em que o aditivo compreende um agente seletivo ou um indicador para a detecção de crescimento microbiano.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado pela incubação do dispositivo de cultura (100) durante um período de tempo compreender incubar o dispositivo de cultura (100) durante o período de tempo em uma atmosfera aeróbica.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pela detecção da colônia microbiana compreender detectar opticamente uma bolha de gás próxima à colônia no compartimento de crescimento (60).