KR20170139148A - 락트산 세균용 배양 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물의 콜로니를 계수하기 위한 배양 장치를 제공한다. 상기 장치는 기저부, 커버시트, 및 이들 사이에 배치된 비다공성 스페이서 부재를 포함할 수 있다. 상기 스페이서 부재는 성장 구획을 형성하는 개구(aperture)를 포함한다. 냉수-가용성 겔화제, 건조성 산소-포착 시약, 건조성 완충 시스템, 및 유효량의 건조성 이산화탄소-발생 시약이 상기 성장 구획 내에 배치된다. 상기 완충 시스템은, 상기 성장 구획이 미리 정해진 부피의 탈이온수로 수화될 때, pH가 6.35 이하인 수성 혼합물이 형성되도록 선택된다.

Description

락트산 세균용 배양 장치

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2015년 4월 29일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/154,312호에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

많은 세균은 산소에 민감하고, 그의 존재 하에서 성장하지 않을 것이다. 그러한 혐기성 미생물의 생존력을 결정하는 것이 다양한 환경에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 혐기성 미생물이 식품 및 음료 가공 및/또는 포장 시설에 존재하는 지를 결정하는 것이 중요할 수 있다. 의료 환경에서는, 예를 들어 진단 검정에서 병원체의 존재를 결정하기 위하여, 혐기성 미생물의 존재를 결정하는 것이 또한 중요할 수 있다. 다른 예로서, 수처리 시설은 그러한 미생물의 존재 또는 부재를 결정하기 위하여 물 샘플을 시험한다.

다양한 장치가 미생물을 배양시키는 데 이용가능하다. 예를 들어, 미생물은 페트리 접시를 사용하여 오랫동안 배양되어 왔다. 당업계에 알려진 바와 같이, 페트리 접시는 한천 및 영양소와 같은, 미생물의 성장에 적합한 배지를 갖는 둥글고 얕고 바닥이 편평한 접시이다. 그러나, 한천 배지의 사용은 불편하고 시간 소모적일 수 있다. 예를 들어, 한천 배지는 샘플을 첨가하기 전에 멸균되고, 융해되고, 냉각되어야 한다.

게다가, 페트리 접시를 사용하여 혐기성 미생물, 예컨대 혐기성 락트산-생성 세균을 배양하기에 적합한 환경을 제공하는 것이 어려울 수 있다. 혐기성 미생물은 산소의 존재 하에서는 잘 자라지 않기 때문에, 그러한 유기체를 성장시키기 위해서는 복잡한 물리적 및 화학적 기법이 요구될 수 있다. 전형적으로, 그러한 장치는 산소의 투과에 대한 물리적 장벽을 제공하도록 변경되어야 하며, 즉 그러하도록 형태가 만들어지거나 구성되어야 한다.

혐기성 배양 장치 내로 혼입되는 화학적 작용제를 사용하여 산소를 제거하는 다른 기법들이 개발되어 왔다. 일반적으로, 그러한 장치는 겔 또는 영양 배지 내로 혼입되는 세균의 멸균 막 단편(sterile membrane fragment) 또는 환원제를 포함한다. 게다가, 미국 특허 제3,338,794호는 산소 불투과성 필름 층들 및 필름들 사이에 있고 환원성 화합물을 포함하는 영양 배지로 형성된 혐기성 세균 배양 장치를 기재한다.

그러나, 이들 및 다른 장치는 또한 지나치게 고가일 수 있고, 용이하게 처분되지 못할 수 있다. 이들 장치는 또한 조립 및/또는 사용하기에 복잡할 수 있다. 호기성 환경에서 혐기성 미생물을 배양하기 위한 단순한 장치를 생성하기 위한 시도가 이루어져 왔지만, 개선된 혐기성 배양 장치에 대한 필요성이 남아 있다.

대체로, 본 발명은 샘플 내의 미생물의 검출, 및 선택적으로 그의 계수에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 미내기성(microaerotolerant), 미호기성(microaerophilic), 또는 절대-혐기성(obligately-anaerobic) 미생물의 성장 및 검출에 관한 것이다. 이러한 성장 및 검출이 자급식(self-contained) 혐기성 환경-생성 배양 장치를 사용하여 수행될 수 있음을 이제서야 알았다.

본 명세서에 개시된 본 발명의 배양 장치 및 방법은 미내기성 및 절대-혐기성 락트산 세균(LAB)의 성장, 검출, 및 감별을 위해 제공되는데, 이는 심지어 산소-함유(예를 들어, 표준 대기 중 산소-함유) 환경에서 미생물을 인큐베이션하는 동안에도 가능하다. 유리하게도, 이는, 혐기성 미생물을 배양하는 데 전형적으로 필요한 특수화된 인큐베이션 장비 및 시약(예를 들어, 혐기성 생물 자르(jar), 일회용 혐기성 생물 샤세(sachet), 팔라듐 촉매, 혐기성 글로브 박스)에 대한 필요성을 제거한다. 추가적으로, 본 발명의 방법은 개별 콜로니로부터의 이산화탄소 가스의 생성의 검출을 가능하게 하고, 이에 따라 순수 배양물의 단리에 필요한 추가의 인큐베이션 시간 및 가스 생성을 검출하기 위한 발효 튜브의 사용을 없앰으로써 세균의 감별을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 샘플 내의 미내기성 또는 절대-혐기성 락트산 세균의 계수에 관한 것이다. 미내기성 미생물과 절대-혐기성 미생물은, 이들이 성장되고 번식되기 위해서는 산소-감소된 환경을 필요로 한다는 공통적인 특징을 공유한다.

본 발명의 장치의 추가의 이득은 완충 능력이다. 이는 식품 샘플을 pH-조정해야 할 필요성을 없애고/없애거나 그것은 장치 내의 배양 배지를 장기간 동안 최적의 pH로 유지한다.

일 태양에서, 본 발명은 미생물의 콜로니를 계수하기 위한 배양 장치를 제공한다. 상기 장치는 서로 반대편에 있는 내부 표면 및 외부 표면을 갖는 기저부(base), 서로 반대편에 있는 내부 표면 및 외부 표면을 갖는 커버시트(coversheet), 및 상기 기저부와 상기 커버시트 사이에 배치된 비다공성 스페이서 부재를 포함할 수 있다. 상기 스페이서 부재는 성장 구획의 형상 및 깊이를 형성하는 개구(aperture)를 포함한다. 상기 스페이서 부재 및 상기 성장 구획은 상기 기저부의 내부 표면과 상기 커버시트의 내부 표면 사이에 배치된다. 상기 장치는 제1 유효량의 건조성(dry) 산소-포착 시약; 상기 성장 구획 내에 배치되고, 상기 성장 구획이 미리 정해진 부피의 탈이온수로 수화될 때, pH가 6.35 이하인 수성 혼합물을 형성하는 건조성 완충 시스템; 및 제2 유효량의 건조성 이산화탄소-발생 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 이들은 상기 성장 구획 내에 배치된다. 상기 겔화제는 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트에 접착된다.

임의의 상기 실시 형태에서, 상기 산소-포착 시약은 직경이 106 마이크로미터 미만인 입자들로 본질적으로 이루어질 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에서, 상기 이산화탄소-발생 시약은 직경이 106 마이크로미터 미만인 입자들로 본질적으로 이루어질 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에서, 상기 배양 장치는 상기 성장 구획 내에 배치된 영양소, 지시 시약, 선택제(selective agent), 또는 환원제를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에서, 상기 성장 구획 내에 존재하는 경우, 상기 영양소, 상기 지시 시약, 상기 선택제, 또는 상기 환원제는 상기 기저부 또는 상기 커버시트에 접착될 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에서, 상기 산소-포착 시약은 제1철 또는 이의 염 또는 아스코르브산 또는 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에서, 상기 이산화탄소-발생 시약은 중탄산나트륨 및 탄산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 샘플에서 락트산 세균을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나의 배양 장치를 개방하여 그 안의 상기 성장 구획에 대한 접근을 제공하는 단계, 미리 정해진 부피의 수성 액체를 상기 성장 구획 내로 넣는 단계, 샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계, 상기 배양 장치를 폐쇄하는 단계, 상기 배양 배지 내에서의 미생물 콜로니의 형성을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 상기 배양 장치를 인큐베이션하는 단계, 및 상기 미생물 콜로니를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 수성 액체 및 상기 샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계 및 상기 배양 장치를 폐쇄하는 단계는 상기 배양 장치의 기저부, 커버시트, 및 스페이서에 의해 에워싸인 반고체 미생물 배양 배지를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양 배지는 pH가 4.0 내지 6.35일 수 있다.

임의의 상기 실시 형태에서, 상기 배양 장치를 일정 기간 동안 인큐베이션하는 단계는 상기 배양 장치를 호기성 분위기에서 상기 일정 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 임의의 상기 실시 형태에서, 미생물 콜로니를 검출하는 단계는 상기 배양 장치 내의 하나 이상의 광학적으로 검출가능한 콜로니를 계수하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 임의의 상기 실시 형태에서, 하나 이상의 미생물 콜로니를 계수하는 단계는 이산화탄소-생성 콜로니를 이산화탄소-무생성 콜로니와 구별하는 단계를 추가로 포함한다.

용어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 소정 상황 하에서 소정 효과를 제공할 수 있는 본 발명의 실시 형태를 지칭한다. 그러나, 동일한 또는 다른 상황 하에서 다른 실시 형태가 또한 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 실시 형태의 언급은 다른 실시 형태가 유용하지 않다는 것을 암시하지 않으며, 본 발명의 범주로부터 다른 실시 형태를 배제하고자 하는 것은 아니다.

용어 "포함한다" 및 그의 변형은 이들 용어가 설명 및 청구범위에 나타나는 경우 제한적 의미를 갖지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형 용어("a", "an", "the"), "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 상호 교환가능하게 사용된다. 따라서, 예를 들어, 영양소는 "하나 이상의" 영양소를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

용어 "및/또는"은 열거된 요소들 중 하나 또는 모두, 또는 열거된 요소들 중 임의의 둘 이상의 조합을 의미한다.

또한, 본 명세서에서, 종점(endpoint)에 의한 수치 범위의 언급은 그 범위 내에 포함되는 모든 수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함함).

본 발명의 상기의 개요는 본 발명의 각각의 개시된 실시 형태 또는 모든 구현 형태를 기재하고자 하는 것은 아니다. 하기 설명은 예시적인 실시 형태를 더욱 구체적으로 예시한다. 본 출원 전체에 걸쳐 여러 곳에서, 예들의 목록을 통해 지침이 제공되며, 이러한 예들은 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 각각의 경우에, 언급된 목록은 단지 대표적인 군으로서의 역할을 하며, 배타적인 목록으로 해석되어서는 안 된다.

이들 및 다른 실시 형태의 추가적인 상세 사항이 아래의 설명 및 첨부 도면에 기재된다. 다른 특징, 목적, 및 이점은 설명 및 도면으로부터 그리고 청구범위로부터 명백하게 될 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 배양 장치의 일 실시 형태의 평면도이다.
도 2는 도 1의 배양 장치의 선 2─2를 따른 측단면도이다.
도 3은 도 1의 배양 장치의 측분해도이다.

본 개시 내용의 임의의 실시 형태를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 그의 응용에 있어서 하기 설명에 기재되거나 하기 도면에 예시된 구성 및 구성요소의 배열의 상세 사항으로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명은 다른 실시 형태가 가능하며, 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용되는 표현 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며, 제한적인 것으로 간주되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 "구비하는", "포함하는" 또는 "갖는" 및 이들의 변형의 사용은 그 뒤에 열거된 항목 및 그의 등가물뿐만 아니라 추가적인 항목을 포괄하는 것으로 의도된다. 달리 명시되거나 제한되지 않는 한, 용어 "연결된" 및 "결합된" 및 이들의 변형은 폭넓게 사용되고, 직접 및 간접 둘 모두의 연결 및 결합을 포괄한다. 또한, "연결된" 및 "결합된"은 물리적인 또는 기계적인 연결 또는 결합으로 제한되지 않는다. 다른 실시 형태가 이용될 수 있으며, 구조적 또는 논리적 변화가 본 개시 내용의 범주로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, "전방", "후방", "상부", "저부" 등과 같은 용어는 단지 요소들이 서로 관련될 때 그러한 요소들을 기술하기 위해 사용되지만, 결코 장치의 특정 배향을 언급하거나, 장치의 필요한 또는 요구되는 배향을 나타내거나 암시하거나, 본 명세서에 기술된 본 발명이 사용 시에 어떻게 사용, 장착, 표시 또는 위치될 것인지를 특정하는 것으로 의도되지 않는다.

본 발명은 대체로 샘플 내의 미생물의 검출, 및 선택적으로 그의 계수에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 락트산 세균(이하, "LAB")으로 집합적으로 알려진 다양한 미생물군의 성장 및 검출에 관한 것이다. LAB는 글루코스를 주로 락트산으로 발효시키거나("호모발효성(homofermentative)" 락트산 세균) 또는 락트산, 이산화탄소, 및 에탄올로 발효시키는("헤테로발효성(heterofermentative)" 락트산 세균) 능력을 특징으로 한다. LAB 미생물의 이러한 성장 및 검출이 자급식 혐기성 환경-생성 및 풍부화된 이산화탄소 환경-생성 배양 장치를 사용하여 수행될 수 있음을 이제서야 알았다.

소정의 미생물들은 혐기적으로 성장된다. 게다가, LAB와 같은 다른 미생물들은 산소의 존재 하에서 성장할 수 있다(즉, 이들은 "내기성"이다). 이들의 발효 대사가 소정의 식품(예를 들어, 요거트, 치즈, 사우어크라우트(sauerkraut))을 생성하는 데 사용되지는 하지만, 이들은 또한, 예를 들어 가공 육류, 맥주, 및 와인에서의 식품 부패의 작용제로도 알려져 있다.

재수화가능한 자급식 혐기성 환경-생성 및 풍부화된 이산화탄소 환경-생성 건식 배양 장치가 제조될 수 있음을 이제서야 알았다. 배양 장치는, 배양 장치의 성장 구역 내에 배치되고, 미리 정해진 부피의 수용액 중에서 재수화될 수 있는 유효량의 실질적으로 건조성인 산소-포착 시약을 포함하며, 재수화 시에, 산소-소비 시약은 산소-소비 반응에 참여할 수 있다. 또한, 산소-소비 반응은 혐기성 락트산 세균 미생물의 성장을 촉진시키기에 충분히 산소를 소비할 수 있음을 이제서야 알았다. 더욱이, 배양 장치는 호기성 환경에서 유지될 수 있으며, 이때 배양 장치는 상기 언급된 미생물의 성장을 촉진시키기 위하여 적어도 약 8일 동안 산소-감소된 환경을 유지할 수 있다.

본 명세서에 개시된 재수화가능한 건식 배양 장치는 당 기술에 비하여 다수의 이점을 제공한다. 예를 들어, 혐기성 미생물을 계수하고 확인하기 위한 대부분의 기법은 사용 전에 오토클레이빙되는 액체 배양 배지(예를 들어, 브로스(broth) 또는 한천)의 사용을 수반한다. 멸균의 고온은 대부분의 산소를 액체 배지 밖으로 축출하는 경향이 있다. 멸균 후에, 교반 및/또는 공기에 대한 노출이 산소를 배지 내로 재도입시킬 수 있다. 대조적으로, 본 발명의 장치는 혐기성 또는 미호기성 미생물을 배양하는 데 요구되는 혐기성 환경을 생성하는 성분들을 함유한다.

관심 세균종은 임의의 공급원, 예컨대 생리학적 유체, 예를 들어 혈액, 타액, 수정체액, 활액, 뇌척수액, 고름, 땀, 삼출물, 소변, 점액, 점막 조직(예를 들어, 협측, 치은, 비강, 안내, 기관, 기관지, 위장, 직장, 요도, 요관, 질, 자궁경부, 및 자궁 점막 조직), 포유기 젖(lactation milk), 대변 등으로부터 유래될 수 있는 시험 샘플에서 분석될 수 있다. 또한, 시험 샘플은 신체 부위, 예를 들어 창상, 피부, 전비공(anterior nares), 비인두강, 비강, 전비전정(anterior nasal vestibule), 두피, 손발톱, 외이, 중이, 입, 직장, 질, 액와, 회음, 항문, 또는 다른 유사한 부위로부터 유래될 수 있다.

생리학적 유체 외에도, 다른 시험 샘플은 액체 매체 중에 용해 또는 현탁되는 다른 액체 및 고체(들)를 포함할 수 있다. 관심 샘플은 공정 스트림, 물, 식품, 식품 성분, 음료, 토양, 식물 또는 다른 초목, 공기, 표면(예를 들어, 제조 플랜트, 병원, 클리닉, 또는 가정에서의 벽, 바닥, 장비, 도구(utensils)) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 장치 및 방법에서 검출 및 계수될 수 있는 락트산 세균 속의 비제한적인 예에는 유산균목(order Lactobacillales)에 속하는 속이 포함된다. 이러한 속에는, 예를 들어 락토바실루스(Lactobacillus), 레우코노스톡(Leuconostoc), 페디오콕쿠스(Pediococcus), 락토콕쿠스(Lactococcus), 및 스트렙토콕쿠스(Streptococcus)가 포함된다. 본 발명의 장치 및 방법에서 검출 및 계수될 수 있는 LAB의 다른 속에는, 예를 들어 카르노박테리움(Carnobacterium), 엔테로콕쿠스(Enterococcus), 오에노콕쿠스(Oenococcus), 테트라게노콕쿠스(Tetragenococcus), 바고콕쿠스(Vagococcus), 및 웨이셀라(Weisella)가 포함된다.

일 태양에서, 본 발명은 락트산 세균(LAB)을 배양 및 검출하기 위한 배양 장치를 제공한다. 도 1 내지 도 3을 참조하면, 본 발명의 배양 장치(100)는 방수성 기저부(10), 방수성 커버시트(20), 및 기저부(10)와 커버시트(20) 사이에 배치된 스페이서 부재(30)를 포함한다. 기저부(10)는 내부 표면(10b) 및 내부 표면 반대편에 있는 외부 표면(10a)을 갖는다. 커버시트(20)는 내부 표면(20b) 및 내부 표면 반대편에 있는 외부 표면(20a)을 갖는다. 임의의 실시 형태에서, 기저부(10)의 내부 표면(10b)은 커버시트(20)의 내부 표면(20b)과 대면하는 관계로 배치된다.

기저부(10)는 바람직하게는, 물을 흡수하지 않거나 달리 물에 의해 불리한 영향을 받지 않을 재료(예를 들어, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 또는 폴리스티렌)로 제조된 비교적 강성인 방수성 필름이다. 기저부(10)는 바람직하게는 기체 산소에 대해 실질적으로 불투과성인 재료를 사용하여 제조된다. 기저부(10)에 적합한 재료의 비제한적인 예에는 적어도 약 15 μm 내지 적어도 약 180 μm 두께의 폴리에스테르 필름, 적어도 약 100 μm 내지 적어도 약 200 μm 두께의 폴리프로필렌 필름, 및 적어도 약 300 μm 내지 약 380 μm 두께의 폴리스티렌 필름이 포함된다. 다른 적합한 기저부는 에틸렌 비닐 알코올 공중합체 필름, 폴리비닐 알코올 필름, 및 폴리비닐리덴 클로라이드 필름을 포함한다. 기저부(10)는 기저부를 통해 콜로니를 관찰하기를 원한다면 투명할 수 있다.

커버시트(20)는 기저부(10)의 내부 표면(10b)을 덮기 위해, 성장 구획(60)을 형성하기 위해, 그리고 선택적으로 이송, 저장, 인큐베이션, 및/또는 콜로니 계수 동안 성장 구획을 관찰하기 위해 사용된다. 커버시트(20)는 바람직하게는, 물을 흡수하지 않거나 달리 물에 의해 불리한 영향을 받지 않을 재료(예를 들어, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 또는 폴리스티렌)로 제조된 비교적 강성인 방수성 필름이다. 커버시트(20)는 배양 장치(10)를 개방하지 않고도 콜로니의 계수를 용이하게 하기 위하여 바람직하게는 투명하고, 미생물 및 수증기에 대해 실질적으로 불투과성이다.

일반적으로, 커버시트는 기저부(10)를 제조하는 데 사용된 것들과 같은 재료로 제조될 수 있다. 커버시트(20)는 바람직하게는 기체 산소에 대해 실질적으로 불투과성인 재료를 사용하여 제조된다. 기저부(10)에 적합한 재료의 비제한적인 예에는 적어도 약 15 μm 내지 적어도 약 180 μm 두께의 폴리에스테르 필름, 적어도 약 100 μm 내지 적어도 약 200 μm 두께의 폴리프로필렌 필름, 및 적어도 약 300 μm 내지 약 380 μm 두께의 폴리스티렌 필름이 포함된다. 다른 적합한 기저부는 에틸렌 비닐 알코올 공중합체 필름, 폴리비닐 알코올 필름, 및 폴리비닐리덴 클로라이드 필름을 포함한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 커버시트(20)는 기저부(10) 및 커버시트(20) 각각의 내부 표면의 한쪽 에지를 따라 (예를 들어, 양면 접착 테이프를 사용하여) 힌지-유사 방식으로 부착되어 힌지 영역(70)을 형성할 수 있다. 선택적으로, 임의의 실시 형태에서, 커버시트(20)는 기저부(10)를 넘어서 연장되는 탭 영역(75)을 포함할 수 있다. 탭 영역(75)은 성장 구획(60)에 샘플을 접종하기 위하여 장치(100)를 개방할 때 편리하게 파지될 수 있다.

당업자는 주어진 유형의 중합체 필름을 통한 산소 가스의 투과성이 중합체 필름의 두께를 증가시킴으로써 감소될 수 있음을 인식할 것이다. 임의의 실시 형태에서, 본 발명의 기저부 및 커버시트는 기체 산소에 대해 실질적으로 불투과성이 되기에 적합한 두께를 갖는 중합체 필름이다.

스페이서 부재(30)는 개구(36)를 포함한다. 개구(36)는 둘 모두 배양 장치(100)의 성장 구획(60)의 위치 및 두께를 형성하는 역할을 하는 웰(well)을 형성한다. 스페이서 부재(30)는, 기저부(10) 및 커버시트(20)와 함께, 성장 구획(60)의 경계를 형성한다. 스페이서 부재(30)는 배양 장치(100)의 접종 동안 성장 구획(60) 내에 수성 샘플(도시되지 않음)을 가두도록 돕는다.

도 1에 예시된 바와 같은 개구(36)는 원형 형상을 형성한다. 그러나, 개구(36)는 다른 형상(예를 들어, 정사각형, 직사각형, 난형)을 형성할 수 있는 것으로 고려된다. 개구(36)의 벽은 미리 정해진 크기 및 형상의 웰을 제공하고, 배양 장치(100)의 성장 구획(60)의 두께를 형성한다.

스페이서 부재(30)는 성장 구획(60)의 크기 및 배양 장치 내에 넣어지는 샘플의 크기에 따라, 예를 들어 1 mL, 2 mL, 3 mL, 5 mL, 또는 10 mL의 미리 정해진 부피를 갖는 웰을 형성하기에 충분히 두꺼워야 한다. 임의의 실시 형태에서, 스페이서 부재(30)는 소수성(비습윤성)이고, 미생물에 대해 불활성이고, 선택적으로 멸균가능한 임의의 비다공성 재료로 제조된다. 임의의 실시 형태에서, 스페이서 부재(30)는 (예를 들어, 감압 접착제를 통해) 기저부(10) 또는 커버시트(20)에 직접 결합될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 스페이서 부재(30)는 (예를 들어, 접착 테이프(50)를 통해) 기저부 또는 커버시트에 간접적으로 결합될 수 있다(예를 들어, 스페이서 부재는, 각각 기저부 또는 커버시트 상에 코팅된 제1 또는 제2 건조성 코팅에 결합될 수 있다).

성장 구획(60)은 배양 장치(100)에서 기저부(10)와 커버시트(20) 사이의 임의의 접근가능한 위치에 있을 수 있다. 바람직하게는, 성장 구획(60)은 장치(100)의 주변 에지들(80)로부터 떨어져서 위치된다.

바람직하게는, 스페이서 부재(30)는 미생물의 성장을 실질적으로 억제하지 않고, 스페이서 부재와 접촉된 하이드로겔 유래의 물 또는 거시적인 이산화탄소 버블을 실질적으로 흡수하지 않는 비다공성 재료(예를 들어, 금속, 유리, 중합체 수지)로 구성된다. 스페이서 부재(30)를 제조할 수 있기에 적합한 재료의 비제한적인 예에는, 예를 들어 폴리올레핀(예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등), 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드 또는 다른 중합체 필름이 포함된다.

본 발명의 장치는 성장 구획 내에 배치된 건조성 냉수-가용성 겔화제를 포함한다. 바람직하게는, 겔화제는 장치(100)의 기저부(10) 및/또는 커버시트(20)에 직접 또는 간접적으로 접착된다. 임의의 실시 형태에서, 겔화제는 장치(100)의 성장 구획(60)에서 기저부(10)의 내부 표면(10b) 및/또는 커버시트(20)의 내부 표면(20b) 상에 균일하게 분포될 수 있다.

제1 건조성 코팅(24)에 사용하기에 적합한 겔화제는 냉수-가용성 천연 및 합성 겔화제를 포함한다. 알긴, 카르복시메틸 셀룰로스, 타라 검, 하이드록시에틸 셀룰로스, 구아 검, 로커스트 빈 검, 잔탄 검과 같은 천연 겔화제, 및 폴리아크릴아미드, 폴리우레탄, 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 합성 겔화제, 및 이들의 혼합물이 일반적으로 적합하다. 적절한 겔화제가 본 발명의 교시 내용, 및 미국 특허 제4,565,783호; 제5,089,413호; 및 제5,232,838호의 개시 내용에 따라 선택될 수 있다. 바람직한 겔화제는 구아 검, 로커스트 빈 검, 및 잔탄 검을 포함하며; 이들 겔화제는 개별적으로 유용하거나, 또는 바람직하게는 서로 조합하는 것이 유용하다.

따라서, 임의의 실시 형태에서, 본 발명의 장치(100)는 선택적으로 성장 구획(60)에서 기저부(10)의 내부 표면(10b)의 적어도 일부분 또는 전부에 접착된 제1 건조성 코팅(14)을 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 제1 건조성 코팅(14)은 건조성 냉수-가용성 겔화제를 포함할 수 있다. 선택적으로, 제1 접착제 층(12)은 기저부(10)에 접착되고, 제1 건조성 코팅의 적어도 일부분은 성장 구획(60)에서 제1 접착제 층에 접착된다.

커버시트(20)에는 어떠한 코팅도 존재하지 않을 수 있다(도시되지 않음). 대안적으로, 장치(100)가 성장 구획(60)에서 기저부(10)의 내부 표면(10b)에 부착된 제1 건조성 코팅(14)을 갖지 않는다면, 커버시트(20)는 성장 구획에서 거기에 접착된 제2 건조성 코팅(24)을 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 제2 건조성 코팅(24)은 건조성 냉수-가용성 겔화제를 포함할 수 있다. 선택적으로, 제2 접착제 층(22)은 커버시트(20)에 접착되고, 제2 건조성 코팅(24)의 적어도 일부분은 성장 구획(60)에서 제2 접착제 층에 접착된다. 임의의 실시 형태에서, 제2 접착제 층(22)의 층 일부분은 스페이서 부재(30)의 적어도 일부분에 대한 커버시트(20)의 밀봉을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다.

제1 및 제2 건조성 코팅과 관련하여, 이들 코팅은 선택적으로, 냉수-재구성가능하고, 겔화제의 냉수 겔화 특성을 실질적으로 방해하지 않고, 혐기성 미생물의 성장을 지원하는 임의의 영양소 또는 영양 배지를 포함할 수 있다. 배양 장치에 사용하기에 적합한 특정 영양소 또는 영양소들은 장치에서 성장시키고자 하는 미생물에 좌우될 것이며, 당업자에 의해 용이하게 선택될 것이다. 일반적으로, 그러한 영양소는 냉수-가용성이다. 세균 성장을 지원하기에 적합한 영양소는 당업계에 알려져 있으며, 제한 없이, 효모 추출물, 펩톤, 당, 적합한 염 등을 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 건조성 코팅은 특정 혐기성 미생물 또는 미생물군의 성장을 다른 미생물 또는 미생물군에 비하여 촉진시키는 선택제(예를 들어, 영양소, 항생제, 및 이들의 조합)를 추가로 포함할 수 있다. 당업자는 다양한 다른 제형이 사용될 수 있고 이들은 본 발명의 범주로부터 제외되지 않음을 인식할 것이다.

바람직하게는, 제1 건조성 코팅(14)이 건조성 분말 또는 건조성 분말 집괴(agglomerate)로 주로 이루어지는 경우, 제1 코팅(14)은 기저부(10)의 내부 표면(10b)의 적어도 일부분 상에 배치되는 제1 접착제 층(12) 상에 배치된다. 제1 건조성 코팅(14)은 배합 공정, 접착제 코팅 공정, 및 액체-코팅 공정 및/또는 건조-코팅 공정을 사용하여 기저부(10) 상에 또는 선택적인 제1 접착제 층(12) 상에 침적될 수 있는데, 상기 공정들은, 예를 들어 미국 특허 제4,565,783호; 제5,089,413호; 및 제5,232,838호에 기재되어 있으며, 이들은 모두 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

바람직하게는, 제2 건조성 코팅(24)이 건조성 분말 또는 건조성 분말 집괴로 주로 이루어지는 경우, 제2 코팅(24)은 커버시트(20)의 내부 표면(20b)의 적어도 일부분 상에 배치되는 제2 접착제 층(22) 상에 배치된다. 제2 건조성 코팅(24)은 배합 공정, 접착제 코팅 공정, 및 액체-코팅 공정 및/또는 건조-코팅 공정을 사용하여 커버시트(20) 상에 또는 선택적인 제2 접착제 층(22) 상에 침적될 수 있는데, 상기 공정들은, 예를 들어 미국 특허 제4,565,783호; 제5,089,413호; 및 제5,232,838호에 기재되어 있으며, 이들은 모두 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

성장 구획(60)은 기저부(10) 및 커버시트(20)의 내부 표면들(각각 내부 표면(10b) 및 내부 표면(20b)) 사이에 배치된 부피로서 형성되며, 부피는 제1 건조성 코팅(14) 및/또는 제2 건조성 코팅(24)의 적어도 일부분을 포함한다. 따라서, 수성 액체가 성장 구획 내에 분포되는 경우, 수성 액체는, 존재하는 경우 제1 건조성 코팅(14) 및/또는 존재하는 경우 제2 건조성 코팅(24)의 적어도 일부분과 유체 접촉해 있다. 성장 구획(60)의 두께는, 예를 들어, 배양 장치 내에 침적된 수성 액체(도시되지 않음)의 부피, 샘플(도시되지 않음)과 관련된 고체(예를 들어, 현탁된 미립자 및/또는 막 필터)의 존재, 및/또는 배양 장치(10) 내의 스페이서 부재(30)에 따라 변동될 수 있다.

본 발명의 배양 장치는 유효량의 건조성 산소-포착 시약, 건조성 완충 시스템, 및 유효량의 건조성 이산화탄소-발생 시약을 추가로 포함한다. 산소-포착 시약, 완충 시스템, 및 이산화탄소-발생 시약 각각은 성장 구획 내에 배치된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "건조성"은 시약이 실질적으로 수분이 없음을 의미한다. 어구 "실질적으로 수분이 없는"은, 일단 주위 환경과 평형을 이룰 수 있게 되었다면, 수분 함량이 (예를 들어, 분말로서 또는 탈수된 수성 코팅으로서 제공된) 재료의 대략적인 수분 함량보다 크지 않은 시약을 지칭한다.

적어도 하나의 건조성 성분(예를 들어, 겔화제)은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 배양 장치의 성장 구획 내로의 샘플 물질의 도입(예를 들어, 접종) 전에, 동안에, 또는 후에 수성 액체로 수화된다. 전형적으로, 샘플 물질 및/또는 수성 액체는 주위 조건에서(즉, 호기성 기체 환경에서) 배양 장치의 성장 구획 내로 도입된다. 따라서, 호기성 조건 하에서 성장 구획에 샘플을 접종한 후에, 배양 장치의 성장 구획 내의 수성 액체는 제1 용존-산소 농도를 포함한다. 배양 장치 내의 산소-포착 시약은 성장 구획에서의 수성 액체 중의 제1 용존-산소 농도를 제1 용존-산소 농도보다 실질적으로 더 낮은 제2 용존-산소 농도로 감소시키도록 기능한다. 접종된 배양 장치의 성장 구획에서의 용존-산소 농도의 이러한 감소는 배양 장치에서의 절대-혐기성 또는 미내기성 LAB의 성장을 촉진시킨다.

임의의 실시 형태에서, 산소-포착 시약의 유효량은, 제1 용존-산소 농도의 제2 용존-산소 농도로의 감소가 산소-포착 시약을 배양 장치의 성장 구획에서 미리 정해진 부피의 수성 액체와 유체 접촉되게 한 후 약 120분 이내에 일어나도록 선택된다. 임의의 실시 형태에서, 산소-포착 시약의 유효량은, 제1 용존-산소 농도의 제2 용존-산소 농도로의 감소가 산소-포착 시약을 배양 장치의 성장 구획에서 미리 정해진 부피의 수성 액체와 유체 접촉되게 한 후 약 60분 이내에 일어나도록 선택된다. 임의의 실시 형태에서, 산소-포착 시약의 유효량은, 제1 용존-산소 농도의 제2 용존-산소 농도로의 감소가 산소-포착 시약을 배양 장치의 성장 구획에서 미리 정해진 부피의 수성 액체와 유체 접촉되게 한 후 약 30분 이내에 일어나도록 선택된다.

임의의 실시 형태에서, 제1 용존-산소 농도의 제2 용존-산소 농도로의 감소는 주위 온도(예를 들어, 약 23℃) 내지 약 42℃(종점 포함)의 온도에서 일어난다. 따라서, 본 발명에 따른 방법의 임의의 실시 형태에서, 산소-포착 시약을 배양 장치의 성장 구획에서 미리 정해진 부피의 수성 액체와 유체 접촉되게 한 후에 제1 용존-산소 농도를 제2 용존-산소 농도로 감소시키기 위하여 승온에서(즉, 주위 온도보다 높은 온도에서) 배양 장치를 인큐베이션할 것이 요구되지 않는다.

당업자는 미생물을 배양하기에 적합한 기간 이내에 본 발명의 배양 장치의 성장 구획으로부터 제거되는 산소의 양이 배양 장치의 성장 구획에서의 산소-포착 시약의 양에 특히 의존함을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 성장 구획에서의 산소-포착 시약의 양을 조정함으로써, 배양 장치는 미내기성 LAB를 배양하도록 또는 절대-혐기성 LAB를 배양하도록 구성될 수 있다.

다수의 산소-포착 시약이 알려져 있으며, 이에는, 예를 들어 아스코르브산(예를 들어, L-아스코르브산) 및 이의 염, 제1철 염, 금속 아황산염, 금속 중아황산염, 및 금속 메타중아황산염이 포함된다. 본 발명에 따른 적합한 산소-포착 시약은, 저산소 또는 혐기성 국소 환경을 만들어내고, LAB의 성장을 실질적으로 억제하지 않고서 LAB와 유체 연통할 수 있는 반응 생성물의 양 및 유형을 생성하기에 충분히 산소를 소비한다. 임의의 실시 형태에서, 산소-포착 시약은 약 1.5 마이크로몰/10 ㎠ 내지 약 15 마이크로몰/10 ㎠의 양으로 성장 구획 내에 배치된다.

바람직하게는, 임의의 실시 형태에서, 산소-포착 시약은 건조성 분말의 형태로 제공된다. 더 바람직하게는, 임의의 실시 형태에서, 산소-포착 시약은 직경이 106 마이크로미터 미만인 입자들로 본질적으로 이루어진 크기 분포를 갖는 입자들의 집단을 형성하도록 밀링되고 분급된 건조성 분말로서 제공된다. 유리하게는, 장치에 미리 정해진 부피의 수성 액체를 접종하고 그것을 폐쇄할 때, 성장 구획에서 혐기성 환경을 생성하고 (예를 들어, 최대 약 24시간의 접종, 최대 약 48시간의 접종, 최대 약 72시간의 접종, 최대 4일의 접종, 최대 5일의 접종, 최대 7일의 접종, 적어도 24시간의 접종, 적어도 48시간의 접종, 적어도 72시간의 접종, 적어도 4일의 접종, 적어도 5일의 접종, 적어도 7일의 접종을) 유지하기에 유효한 양으로, 직경이 106 마이크로미터 미만인 입자들로 제공된 산소-포착 시약이 기저부 또는 커버시트에 접착될(예를 들어, 기저부 또는 커버시트 상에 코팅된 접착제 층에 접착될) 수 있다.

커버시트(20) 상에 배치된 선택적인 접착제 층(22)에 사용된 접착제는 기저부(10) 상에 배치된 선택적인 접착제 층(12)에 사용된 접착제와 동일하거나 상이할 수 있다. 게다가, 커버시트(20) 상에 배치된 제2 건조성 코팅(24)은 기저부(10) 상에 배치된 제1 건조성 코팅(14)과 동일하거나 상이할 수 있다. 커버시트(20) 상의 코팅은 기저부를 대면하는 표면 전체를 덮을 수 있지만, 바람직하게는 배양 장치(100)의 성장 구획(60)의 적어도 일부분을 형성하는 내부 표면(20b)의 적어도 일부를 덮는다.

임의의 실시 형태에서, 선택제는 건조성 코팅으로 장치 내에 배치될 수 있거나, 또는 선택적으로, 성장 구획 내의 접착제 층 중에 용해될 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 배양 장치는 배양 장치 내의 산소를 지시하기 위한 수단을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 이러한 수단은 장치 내에 존재하는 산소의 양(예를 들어, 미리 정해진 역치량 또는 상대량)을 지시할 수 있다. 유리하게는, 이러한 수단은 산소-포착 시약이 배양 장치의 성장 구획 내의 산소를 미내기성 또는 절대-혐기성 LAB의 성장을 촉진시키는 농도로 적합하게 고갈시켰는지의 여부 또는 그것이 이루어진 시기를 지시할 수 있다. 배양 장치 내의 산소를 검출하기 위한 수단은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 산화환원 염료(예를 들어, 메틸렌 블루) 및 산소-소광 형광 염료를 포함한다.

이러한 수단은 장치 내부에서의 산소의 부재를 지시하는 발광 화합물일 수 있다. 적합한 산소 지시약이 미국 특허 제6,689,438호(케네디(Kennedy) 등)에 개시되어 있으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명의 배양 장치를 위한 지시약으로서 적절한 발광 화합물은 산소에 의해 소광되는 발광을 나타낼 것이다. 더 정확하게는, 이러한 지시약은 그의 여기 주파수(excitation frequency)에 대한 노출 시에 발광될 것이며, 이때의 방출은 산소 농도에 반비례한다. 이 지시약은 장치 내의 다른 층 상에, 또는 다른 층의 일부분 상에 코팅, 라미네이팅, 또는 압출될 수 있다. 그러한 층은 성장 구획 내에 배치될 수 있고, 선택적으로, 하나 이상의 다른 산소 투과성 층에 의해 성장 구획과 분리된다. 산소를 지시하기에 적합한 화합물은 옥타에틸포르피린, 테트라페닐포르피린, 테트라벤조포르피린, 클로린, 또는 박테리오클로린의 금속 유도체를 포함한다. 다른 적합한 화합물은 팔라듐 코프로포르피린(PdCPP), 백금 및 팔라듐 옥타에틸포르피린(PtOEP, PdOEP), 백금 및 팔라듐 테트라페닐포르피린(PtTPP, PdTPP), 캄퍼퀴논(CQ), 및 잔탄 유형 염료, 예컨대 에리트로신 B(EB)를 포함한다. 다른 적합한 화합물은 2,2'-바이피리딘, 1,10-페난트롤린, 4,7-다이페닐-1,10-페난트롤린 등과 같은 리간드를 갖는 루테늄, 오스뮴 및 이리듐 착물을 포함한다. 이들의 적합한 예에는 트리스(4,7,-다이페닐-1,10-페난트롤린)루테늄(II) 퍼클로레이트, 트리스(2,2'-바이피리딘)루테늄(II) 퍼클로레이트, 트리스(1,10-페난트롤린)루테늄(II) 퍼클로레이트 등이 포함된다.

본 발명의 배양 장치는 성장 구획 내에 배치된 유효량의 건조성 이산화탄소-발생 시약을 포함한다. 이산화탄소-발생 시약은, 성장 구획에서 수성 액체와의 접촉에 의해 활성화될 때, 하기의 용존종(dissolved species)들의 평형을 확립시킨다: 탄산의 하나 이상의 염, 탄산, 및 이산화탄소. 유리하게는, 이산화탄소-발생 시약의 유효량은 용존 이산화탄소를 LAB의 성장을 촉진시키는 농도로 상승시키기에 충분하다. 본 명세서에 제시된 실험 결과는 이산화탄소-발생 시약의 양과 성장 구획에서의 수성 하이드로겔 중의 이산화탄소 농도의 증가 사이의 관계를 나타낸다.

바람직하게는, 임의의 실시 형태에서, 이산화탄소-발생 시약은 건조성 분말의 형태로 제공된다. 더 바람직하게는, 임의의 실시 형태에서, 이산화탄소-발생 시약은 직경이 106 마이크로미터 미만인 입자들로 본질적으로 이루어진 크기 분포를 갖는 입자들의 집단을 형성하도록 밀링되고 분급된 건조성 분말로서 제공된다. 유리하게는, 장치에 미리 정해진 부피의 수성 액체를 접종하고 그것을 폐쇄할 때, 성장 구획에서 CO₂-풍부화된 환경을 생성하고 (예를 들어, 최대 약 24시간의 접종, 최대 약 48시간의 접종, 최대 약 72시간의 접종, 최대 4일의 접종, 최대 5일의 접종, 최대 7일의 접종, 적어도 24시간의 접종, 적어도 48시간의 접종, 적어도 72시간의 접종, 적어도 4일의 접종, 적어도 5일의 접종, 적어도 7일의 접종을) 유지하기에 유효한 양으로, 직경이 106 마이크로미터 미만인 입자들로, 기저부 또는 커버시트에 접착될(예를 들어, 기저부 또는 커버시트 상에 코팅된 접착제 층에 접착될) 수 있다.

본 발명의 배양 장치는 성장 구획 내에 배치된 건조성 완충 시스템을 포함하며, 건조성 완충 시스템은, 탈이온수로 수화될 때, 물의 pH가 6.35 이하가 되게 한다. 산성 pH는 몇몇 이점을 제공한다: i) 산성 환경은 샘플 내에 존재할 수 있는 다른 미생물에 비하여 내산성(acid-tolerant) 미생물(예를 들어, LAB)의 성장을 선택적으로 유리하게 하고, ii) 산성 환경은 이산화탄소 발생 시약의 평형을 더 높은 비율의 용존 CO₂ 쪽으로 이동시킬 수 있다. 이들 이점 둘 모두는 배양 장치에서 LAB의 성장을 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 장치에 사용되는 완충 시스템은 pK_a가 7.0 이하; 바람직하게는, 약 6.5 이하인 임의의 미생물학적으로 적합한 완충액을 포함한다. 완충 시스템의 산성 및 염기성 성분들은, 미리 정해진 부피의 탈이온수가 완충 시스템과 접촉될 때, 성장 구획에서의 pH가 6.35 미만이 되도록 하는 비로 배양 장치 내에 존재한다. 적합한 완충 시스템은, 예를 들어 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 및 소듐 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산, 및 석신산 및 소듐 석시네이트를 포함한다. 당업자는, (예를 들어, 샘플을 포함하는) 미리 정해진 부피의 수성 액체가 성장 구획 내에 침적되고 장치가 폐쇄될 때 형성되는 수성 혼합물의 원하는 pH를 달성하기 위하여 완충 시스템의 산 성분과 염기 성분의 비가 조정될 수 있음을 인식할 것이다.

본 발명의 배양 장치는 선택적으로 지시 시약을 포함한다. 적합한 지시 시약은 LAB를 검출하는 데 유용하다. 선택적으로, 지시 시약은 소정의 LAB를 다른 LAB 또는 비-LAB 미생물과 구별할 수 있다. 적합한 지시 시약은, 예를 들어, 미생물의 존재를 검출하기 위한, pH 지시약, 산화환원 지시약, 발색성 효소 기질, 및 형광발생성 효소 기질을 포함한다. 당업자는 LAB를 검출하는 데 유용한 지시 시약을 인식할 것이다. 지시약은 산소-포착 시약을 실질적으로 방해해서는 안 된다. 임의의 실시 형태에서, 지시 시약은 건조성 코팅으로 장치 내에 배치될 수 있거나, 또는 선택적으로, 성장 구획 내의 접착제 층 중에 용해될 수 있다.

본 발명의 배양 장치는 선택적으로 환원제를 포함한다. 적합한 환원 시약은 성장 배지의 산화-환원 전위를 낮추는 데 유용하고, 그럼으로써 혐기성 LAB의 성장을 촉진시킨다. 적합한 환원제는, 예를 들어 소듐 티오글리콜레이트, L-시스테인, 다이티오트레이톨, 다이티오에리트리톨, 및 이들의 조합을 포함한다.

임의의 실시 형태에서, 성장 구획은 1 밀리리터 수성 액체 부피로 수화되도록 치수가 정해질 수 있다. 물은 밀리리터당 약 0.54 μmol의 용존 산소를 포함한다. 따라서, 제1 건조성 코팅 및/또는 제2 건조성 코팅은 바람직하게는, 약 22℃ 내지 약 42℃에서 120분 이하의 기간에 0.54 μmol의 산소를 소비하기에 충분한 산소-포착 시약을 적어도 포함한다. 더 바람직하게는, 제1 건조성 코팅 및/또는 제2 건조성 코팅은 바람직하게는, 약 22℃ 내지 약 42℃에서 120분 이하의 기간에 0.54 μmol보다 많은 산소를 소비하기에 충분한 산소-포착 시약을 적어도 포함한다.

임의의 실시 형태에서, 제1 건조성 코팅 및/또는 제2 건조성 코팅은 다수의 다른 성분들, 예컨대 염료(예를 들어, pH 지시약), 가교결합제, 시약(예를 들어, 선택적 시약 또는 지시 시약, 예컨대 발색성 또는 형광발생성 효소 기질), 또는 전술한 성분들의 임의의 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 용도를 위하여, 제1 및/또는 제2 건조성 코팅 내에 또는 제1 및/또는 제2 건조성 코팅이 접착되는 접착제 내에 미생물 성장의 지시약(예를 들어, pH 지시약, 발색성 효소 기질, 산화환원 염료)을 혼입시키는 것이 바람직하다. 적합한 염료는, 성장 중인 미생물에 의해 대사되거나 아니면 그것과 반응하는 것들을 포함하고, 그렇게 함에 있어서, 더 용이한 시각화를 위하여 콜로니가 착색되게 하거나 형광을 나타내게 한다. 그러한 염료는 트라이페닐 테트라졸륨 클로라이드, p-톨릴 테트라졸륨 레드, 테트라졸륨 바이올렛, 베라트릴 테트라졸륨 블루 및 관련 염료, 및 5-브로모-4-클로로인돌릴 포스페이트 이나트륨 염을 포함한다. 다른 적합한 염료는 미생물의 성장 동안 pH 변화에 민감한 것들, 예컨대 뉴트럴 레드를 포함한다.

일부 용도에 있어서, 수성 액체를 사용하여 재구성될 때, 스트리킹(streaking)에 의한 접종을 가능하게 하기에 충분히 강성인 하이드로겔을 형성하는 건조성 코팅을 형성하는 것이 바람직하다. 스트리킹 가능한 배지를 형성하기 위하여, 유효량의 적합한 가교결합제가 겔화제를 포함하는 하나 이상의 건조성 코팅 내로 혼입될 수 있다. 적합한 가교결합제는 의도된 미생물의 성장에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 가교결합제의 적합한 유형 및 양은 당업자에 의해 용이하게 선택된다. 예를 들어, 구아 검의 경우, 사붕산칼륨, 알루미늄 염, 또는 칼슘 염과 같은 가교결합제가 적합하며, 유효량으로, 예를 들어 건조성 코팅의 약 1.0 중량% 미만으로 첨가될 수 있다.

적어도 하나의 건조성 코팅은 선택적으로 소정의 미생물학적 시험을 수행하는 데 필요한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항생제 감수성 시험을 수행하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다. 미생물 확인을 위하여, 특정 유형의 미생물의 존재 하에서 색 변화를 겪는 감별 시약이 포함될 수 있다.

임의의 실시 형태에서, 건조성 완충 시스템, 환원제, 이산화탄소-발생 시약 및/또는 지시 시약은 제1 또는 제2 접착제 층에 접착되지 않는 건조성 분말(예를 들어, 도 2 및 도 3의 건조성 분말(40))로서 성장 구획 내에 배치될 수 있다. 대안적으로, 건조성 완충 시스템, 환원제, 이산화탄소-발생 시약 및/또는 지시 시약은 본 명세서에 기재된 바와 같이 제1 및/또는 제2 코팅 내에 포함될 수 있다.

본 발명의 배양 장치는 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 장치는 수작업으로 제조되거나 또는 본 명세서에 그리고, 예를 들어 미국 특허 제4,565,783호; 제5,089,413호; 및 제5,232,838호에 기재된 바와 같은 일반적인 실험실 장비를 사용하여 제조될 수 있다.

제1 접착제 층 및/또는 제2 접착제 층에 사용될 수 있는 적합한 감압 접착제의 비제한적인 예는 90/10 몰비의 2-메틸부틸아크릴레이트/아크릴산의 공중합체이다. 사용될 수 있는 다른 바람직한 감압 접착제는 95/5 또는 94/6 몰비의 아이소옥틸아크릴레이트/아크릴산, 및 실리콘 고무를 포함한다. 물에 대한 노출 시에 유백색(예를 들어, 불투명)으로 변하는 접착제는 덜 바람직하지만, 이는 투명하지 않은 기저부와 함께 사용될 수 있거나 또는 콜로니 시각화가 필요하지 않는 상황에서 사용될 수 있다. 저융점 물질이 고융점 물질 상에 코팅된 열-활성화 접착제 및/또는 점질물(mucilage)과 같은 물-활성화 접착제가 또한 알려져 있으며, 본 발명에 사용될 수 있다. 콜로니의 시각화를 용이하게 하기 위하여 전술된 바와 같이 지시 시약을 혼입시킬 때, 분말 내라기보다는 접착제 또는 브로스 코팅 혼합물 내에 지시 시약을 혼입시키는 것이 일반적으로 바람직하다.

제1 접착제 층 또는 제2 접착제 층은, 바람직하게는 접착제에 접착되는 건조성 분말 또는 집괴화된 분말의 입자들의 평균 직경보다 작은 두께로 접착제 층을 형성하도록 기저부 또는 커버시트의 상부 표면 상에 (나이프 코터를 사용하여) 코팅된다. 일반적으로, 입자들을 기재(예를 들어, 본 명세서에 기재된 제1 또는 커버시트)에 접착하기 위하여 충분한 접착제가 코팅되지만, 입자들이 접착제 내에 완전히 매립될 정도로 많지는 않다. 일반적으로, 약 5 μm 내지 약 12 μm 두께의 접착제 층이 적합하다.

바람직하게는, 겔화제가 제1 건조성 코팅 및/또는 제2 건조성 코팅 내에 포함되는 경우, 그것은 성장 구획 내에 배치된 미리 정해진 양, 예를 들어 1 내지 3 ml의 물 또는 수성 샘플이, 적합한 점도, 예를 들어 60 rpm에서 브룩필드(Brookfield) 모델 L VF 점도계로 25℃에서 측정될 때 약 1500 cps 이상을 갖는 하이드로겔을 형성하도록 하는 양으로 포함된다. 이러한 점도의 하이드로겔은 인큐베이션 동안 배양 장치의 편리한 취급 및 적층을 가능하게 하고, 배지에서의 별개의 콜로니 형성을 제공한다. 예를 들어, 20.3 ㎠의 표면적 위에 실질적으로 균일하게 펴발라진 0.025 g 내지 0.050 g의 분말형 구아 검은, 1 내지 3 ml의 수성 샘플에 의해 재구성될 때, 충분히 점성인 배지를 제공할 것이다. 분말 입자들의 크기는 단위 면적당 코팅 중량을 제어하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 100 메시 구아 검이 약 0.05 g/20.3 ㎠의 중량으로 코팅되는 조건 하에서, 400 메시 구아 검은 약 0.025 g/20.3 ㎠의 중량으로 코팅된다.

임의의 실시 형태에서, 제1 건조성 코팅 또는 제2 건조성 코팅은 미생물의 성장을 촉진시키는 하나 이상의 영양소를 포함할 수 있다. 코팅이 분말 또는 분말 집괴로 본질적으로 이루어지는 경우, 접착된 분말 배지 내의 바람직한 겔화제 대 영양소 비는 장치 상에서 성장시키고자 하는 특정 미생물에 의해 결정된다. 그러나, 일반적인 목적을 위하여, 약 4 대 1 내지 약 5 대 1의 비(중량을 기준으로 총 겔화제 대 총 영양소)가 바람직하다. 접착된 분말 배지 내의 분말은, 실질적으로 균일한 층을 적용하기에 적합한 임의의 수단에 의해 접착제 층(예를 들어, 제1 접착제 층(12) 및/또는 제2 접착제 층(22))에 적용될 수 있다. 분말의 층을 적용하기에 적합한 방법의 예에는 진탕기-유형 장치의 사용, 또는 분말 코터의 사용을 포함된다.

본 발명의 장치에 사용하기에 적합한 영양소는 LAB를 성장시키고 검출하기 위한 배양 배지에서 발견되는 것들을 포함한다. 적합한 영양소의 비제한적인 예에는 펩톤의 공급원(예를 들어, 육류 추출물(meat extract), 육류 펩톤), 효모 추출물, 카세인의 효소 분해물, 및 탄수화물(예를 들어, 말토스, 글루코스, 트레할로스, 수크로스)이 포함된다. 바람직하게는, 탄수화물은 LAB의 성장(바이오매스 생성), 및 락트산 또는 LAB 콜로니를 검출하는 데 사용될 수 있는 다른 대사물(예를 들어, CO₂)로의 LAB에 의한 발효를 촉진시키기에 충분히 높은 양으로 장치 내에 존재한다.

본 발명의 배양 장치를 사용하는 경우, 존재하는 미생물의 콜로니의 정확한 카운트가 바람직할 수 있다. 따라서, 임의의 실시 형태에서, 본 발명의 배양 장치는 기저부 상에 또는, 대안적으로, 커버시트 상에 그리드 패턴을 포함할 수 있다. 그리드 패턴은 정사각형 그리드 패턴, 예컨대 미국 특허 제4,565,783호에 개시된 정사각형 그리드 패턴을 포함할 수 있다. 그리드 패턴은, 예를 들어 인쇄 방법과 같은 임의의 적합한 공정에 의해 제1 또는 커버시트 상에 생성될 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 자급식 혐기성 환경-생성 배양 장치를 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법은 냉수-가용성 겔화제를 기저부의 일부분 상에 접착시키는 단계를 포함한다. 겔화제는, 기저부에 접착될 때, 건조성(예를 들어, 실질적으로 수분이 없는 입자들의 형태)일 수 있거나, 겔화제는 액체 코팅(예를 들어, 수성 액체 코팅)으로서 기저부에 접착되고, 후속으로 실질적으로 수분이 없는 상태로 건조될 수 있다. 본 방법은 커버시트에 인접하게 기저부를 위치시키는 단계 및 이들 사이에 스페이서 부재를 배치시키는 단계를 추가로 포함하며, 스페이서 부재는 본 명세서에 기재된 바와 같은 성장 구획을 형성하는 개구를 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 스페이서 부재는 기저부 또는 커버시트에 (예를 들어, 접착제를 통해) 부착될 수 있다.

기저부는, 접착된 겔화제의 적어도 일부분이 기저부와 커버시트 사이에 배치된 성장 구획과 대면하도록 커버시트에 인접하게 위치된다. 선택적으로, 임의의 실시 형태에서, 제1 접착제 층이 (예를 들어, 당업계에 알려진 코팅 공정을 사용하여) 기저부에 적용될 수 있고, 냉수-가용성 겔화제가 제1 접착제 층에 접착될 수 있다.

대안적인 실시 형태에서, 냉수-가용성 겔화제는 겔화제를 기저부에 접착하는 것에 대해 기재된 임의의 공정에 의해 커버시트에 접착될 수 있다. 겔화제가 액체-코팅되는 경우, 접착된 겔화제의 건조는 당업계에 알려진 다수의 공정에 의해 수행될 수 있다. 코팅은, 예를 들어 미국 특허 제5,601,998호에 기재된 공정에 따라 오븐(예를 들어, 중력 오븐, 대류 오븐)에서 건조될 수 있으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 바람직하게는, 접착된 겔화제는 그것이 실질적으로 수분이 없는 상태로 될 때까지 건조된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "실질적으로 건조성인", "실질적으로 수분이 없는" 등은, 일단 주위 환경과 평형을 이룰 수 있게 되었다면, 수분 함량이 탈수된 코팅의 대략적인 수분 함량보다 크지 않은 코팅을 지칭한다.

본 방법은 산소-포착 시약, 완충 시스템, 및 이산화탄소-발생 시약을 배양 장치의 성장 구획 내로 침적하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 산소-포착 시약, 완충 시스템, 및 이산화탄소-발생 시약 중 어느 하나 또는 전부가 건조성 분말로서 성장 구획 내로 침적될 수 있다. 선택적으로, 산소-포착 시약, 완충 시스템, 및 이산화탄소-발생 시약 중 어느 하나 또는 전부는 성장 구획에서 접착제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 접착제 층 또는 제2 접착제 층)에 접착될 수 있다. 다른 선택적인 성분들(예를 들어, 지시 시약, 선택제, 영양소)이 또한, 선택적으로 접착제 층에 접착된 성장 구획 내로 침적될 수 있다.

접착된 겔화제가 기저부와 커버시트 사이에 배치된 성장 구획과 대면하도록 기저부를 커버시트에 인접하게 위치시키는 것은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 겔화제의 일부분이 성장 구획과 중첩되도록 기저부 및 커버시트를 서로 인접하게 위치시키는 것의 대표적인 예가 도 1 내지 도 3에 도시되어 있다. 이러한 중첩 구성은, 작업자가 기저부와 커버시트 사이에 수성 액체를 침적할 수 있게 하고, 그럼으로써 겔화제, 산소-포착 시약, 완충 시스템, 및 이산화탄소-발생 시약을 유체 연통 상태에 놓이게 할 수 있음을 알 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 미생물을 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 전술된 본 발명의 배양 장치의 임의의 실시 형태를 사용한다. 배양 장치는 기저부; 커버시트; 기저부 및 커버시트의 내부 표면들 사이에 배치되고, 성장 구획의 형상 및 깊이를 형성하는 개구를 포함하는 스페이서 부재; 성장 구획 내의 기저부 또는 커버시트에 접착된 건조성 냉수-가용성 겔화제; 및 본 명세서에 기재된 바와 같이 성장 구획 내에 각각 배치된, 유효량의 건조성 산소-포착 시약, 건조성 완충 시스템, 및 유효량의 건조성 이산화탄소-발생 시약을 포함한다.

임의의 실시 형태에서, 본 방법은 배양 장치를 개방하여 그 안의 성장 구획에 대한 접근을 제공하는 단계, 미리 정해진 부피의 수성 액체를 성장 구획 내로 넣는 단계, 샘플을 성장 구획 내로 넣는 단계, 배양 장치를 폐쇄하는 단계, 배양 배지 내에서의 미생물 콜로니의 형성을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 배양 장치를 인큐베이션하는 단계, 및 미생물 콜로니를 검출하는 단계를 포함하며, 수성 액체 및 샘플을 성장 구획 내로 넣는 단계 및 배양 장치를 폐쇄하는 단계는 배양 장치의 기저부, 커버시트, 및 스페이서에 의해 에워싸인 반고체 미생물 배양 배지를 형성하는 단계를 포함하고; 배양 배지는 pH가 4.0 내지 6.35이다.

임의의 실시 형태에서, 배양 장치를 수화 및/또는 접종시키는 데 사용되는 수성 액체의 미리 정해진 부피는 약 0.1 밀리리터 내지 약 10 밀리리터이다. 임의의 실시 형태에서, 배양 장치를 수화 및/또는 접종시키는 데 사용되는 수성 액체의 미리 정해진 부피는 약 1 밀리리터이다. 임의의 실시 형태에서, 배양 장치를 수화 및/또는 접종시키는 데 사용되는 수성 액체의 미리 정해진 부피는 약 2 밀리리터이다. 임의의 실시 형태에서, 배양 장치를 수화 및/또는 접종시키는 데 사용되는 수성 액체의 미리 정해진 부피는 약 3 밀리리터이다. 임의의 실시 형태에서, 배양 장치를 수화 및/또는 접종시키는 데 사용되는 수성 액체의 미리 정해진 부피는 약 4 밀리리터이다. 임의의 실시 형태에서, 배양 장치를 수화 및/또는 접종시키는 데 사용되는 수성 액체의 미리 정해진 부피는 약 5 밀리리터이다. 임의의 실시 형태에서, 배양 장치를 수화 및/또는 접종시키는 데 사용되는 수성 액체의 미리 정해진 부피는 약 10 밀리리터이다. 임의의 실시 형태에서, 배양 장치의 성장 영역을 수화하는 데 사용되는 수성 액체는 성장 영역 20.3 ㎠당 대략 1 밀리리터의 액체가 되는 면적에 걸쳐 분포된다.

본 방법의 임의의 실시 형태에서, 미리 정해진 부피를 성장 구획 내로 넣는 단계는 샘플을 성장 구획 내로 넣는 단계를 동시에 포함한다. 예를 들어, 샘플은 액체(예를 들어, 미생물 오염에 대해 시험하고자 하는 물 또는 음료 샘플)일 수 있거나, 샘플은 액체 담체 또는 희석제 중에 현탁된 고체 또는 반고체 샘플일 수 있다.

대안적으로, 임의의 실시 형태에서, 미리 정해진 부피를 성장 구획 내로 넣는 단계는 샘플을 성장 구획 내로 넣는 단계를 동시에 포함하지 않는다. 예를 들어, 샘플은, 미리 정해진 부피의 (바람직하게는, 멸균) 액체 담체 또는 희석제가 배양 장치의 성장 구획 내로 넣어지기 전이나 후에 성장 구획 내로 넣어지는 액체, 고체, 또는 반고체 물질을 포함할 수 있다.

전형적으로, 배양 장치는 대체로 평평한 표면 상에 놓여지고, 기저부와 커버시트는 성장 구획이 수화 및/또는 접종되고 있는 동안에 배양 장치의 성장 구획에 대한 접근을 제공하도록 분리된다(예를 들어, 커버시트는 들어 올려진다). 유리하게는, 배양 장치는 호기성 환경에서(즉, 공기 중에서) 수화 및/또는 접종될 수 있다. 전형적으로, 장치를 수화하기 위해 사용되는 수성 액체(이는 시험하고자 하는 샘플 물질을 포함할 수 있음)가 기저부와 커버시트 사이의 성장 구획 상으로 피펫팅된다. 미리 정해진 부피의 수성 액체가 성장 구획 내로 침적된 후에, 배양 장치는 (예를 들어, 커버시트가 스페이서 부재와 접촉할 때까지 그것을 내림으로써) 폐쇄된다. 선택적으로, 페트리필름(PETRIFILM) 배양 장치를 접종시키는 데 사용되는 것들과 유사한 편평하거나 오목한 스프레더가 배양 장치 내의 미리 정해진 영역에 걸쳐 수성 액체를 분포시키는 데 사용될 수 있다.

본 방법의 임의의 실시 형태에서, 미리 정해진 부피를 성장 구획 내로 넣는 단계는 샘플을 성장 구획 내로 넣는 단계를 동시에 포함할 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 샘플은 수성 액체를 포함할 수 있고/있거나, 샘플은 수성 액체 중으로 희석되거나 그 중에 현탁될 수 있다.

대안적으로, 임의의 실시 형태에서, 미리 정해진 부피를 성장 구획 내로 넣는 단계는 샘플을 성장 구획 내로 넣는 단계를 동시에 포함하지 않는다. 이러한 실시 형태에서는, 샘플을 성장 구획 내로 넣기 전이나 후에, 미리 정해진 부피의 수성 액체가 성장 구획 내로 넣어질(예를 들어, 피펫팅될) 수 있다. 예를 들어, 샘플은, 겔화제가 수성 액체로 수화되기 전이나 후에 성장 구획 내로 넣어진 막 필터 상에 포획될 수 있다.

본 방법의 임의의 실시 형태에서, 샘플을 성장 구획 내로 넣는 단계는 하나 이상의 첨가제를 성장 구획 내로 넣는 단계를 포함한다. 하나 이상의 첨가제는 샘플과 함께 또는 개별적으로 성장 구획 내로 넣어질 수 있다. 하나 이상의 첨가제는 본 방법에서 다양한 기능을 수행할 수 있다. 예를 들어, 임의의 실시 형태에서, 하나 이상의 첨가제는 장치에서 LAB의 성장을 촉진시키기 위하여 영양소(예를 들어, 건조성 영양소) 또는 영양 배지(예를 들어, 건조성 영양 배지)를 포함할 수 있다. 그러한 영양소 및 영양 배지는 당업계에 잘 알려져 있고, 배양하고자 하는 특정 미생물에 기초하여 선택될 수 있다. 영양소 및 영양 배지는 산소-포착 시약을 실질적으로 방해해서는 안 된다. 이것은, 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된 국제 특허 출원 공개 WO2015/061213호의 실시예 2 및 실시예 3에 기재된 바와 같이 산소 센서(예를 들어, 평면형 산소 센서, 5 mm 직경, 파트 번호 200000023; 독일 레겐스부르크 소재의 프레센스 프레시전 센싱 게엠베하(Presens Precision Sensing GmbH)로부터 입수됨)를 사용함으로써 용이하게 시험될 수 있다.

대안적으로 또는 추가적으로, 임의의 실시 형태에서, 첨가제는 하나의 미생물의 성장을 적어도 하나의 다른 미생물의 성장에 비하여 유리하게 하는 하나 이상의 선택제(예를 들어, 항생제, 염)를 포함한다. 실시 형태에서, 선택제는 비-LAB 미생물에 비하여 LAB의 성장을 유리하게 한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 임의의 실시 형태에서, 첨가제는 미생물의 존재를 검출하기 위한 지시 시약(예를 들어, pH 지시약, 산화환원 지시약, 발색성 효소 기질, 및 형광발생성 효소 기질)을 포함한다. 당업자는 LAB를 검출하는 데 유용한 선택제 및 지시 시약을 인식할 것이다. 선택제 및/또는 지시약은 산소-포착 시약을 실질적으로 방해해서는 안 된다. 이것은 전술된 바와 같이 산소 센서를 사용함으로써 용이하게 시험될 수 있다.

임의의 실시 형태에서, 유효량의 선택제는 배양 장치에서 락트산 세균의 성장개시(germination) 및 성장을 실질적으로 가능하게 하고, 유효량의 선택제는 E. 콜라이(E. coli), S. 아우레우스(S. aureus), C. 스포로게네스(C. sporogenes), C. 페르프린겐스(C. perfringens), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 프레보텔라 멜라니노겐시아(Prevotella melaninogencia), 및/또는 푸소박테리움(Fusobacterium) 종의 성장을 실질적으로 억제한다.

성장 구획에서 수성 액체에 의해 접촉될 때, 건조성 성분들(예를 들어, 산소-포착 시약, 완충 시스템, 이산화탄소-발생 시약, 영양소, 지시 시약, 환원제, 및/또는 선택제)과 수성 액체는 제1 농도의 용존 산소 및 제1 농도의 용존 이산화탄소를 포함하는 혼합물을 형성한다.

임의의 실시 형태에서, 성장 구획에서의 수성 혼합물 중의 제1 농도의 용존 산소는 절대-혐기성 미생물, 미호기성 미생물, 및/또는 미내기성 미생물의 성장을 실질적으로 억제하는 농도일 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 성분들을 수성 유체 연통 상태에 놓이게 하는 것은 산소-포착 반응을 개시하고, 그럼으로써 성장 구획에서의 수성 액체 중의 제1 농도의 용존 산소를 제1 농도보다 낮은(예를 들어, 제1 농도보다 적어도 약 25% 낮은, 적어도 약 50% 낮은, 적어도 약 60% 낮은, 적어도 약 70% 낮은, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 낮은, 또는 99%보다 크게 낮은) 제2 농도로 감소시킨다.

임의의 실시 형태에서, 제1 농도의 용존 산소를 제2 농도의 용존 산소로 감소시키는 것은 성장 구획에서의 수성 혼합물 중의 용존 산소를 LAB(예를 들어, 내기성 LAB 또는 절대-혐기성 LAB)의 성장을 지원하기에 충분히 낮은 제2 농도로 감소시키는 것을 포함할 수 있다.

임의의 실시 형태에서, 제1 농도의 용존 산소를 제2 농도의 용존 산소로 감소시키는 것은 혼합물이 형성된 후 약 120분 이내에 성장 구획에서의 수성 혼합물 중의 제2 농도로 용존 산소를 감소시키는 것을 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 제1 농도의 용존 산소를 제2 농도의 용존 산소로 감소시키는 것은 혼합물이 형성된 후 약 90분 이내에 성장 구획에서의 수성 혼합물 중의 제2 농도로 용존 산소를 감소시키는 것을 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 제1 농도의 용존 산소를 제2 농도의 용존 산소로 감소시키는 것은 혼합물이 형성된 후 약 60분 이내에 성장 구획에서의 수성 혼합물 중의 제2 농도로 용존 산소를 감소시키는 것을 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 제1 농도의 용존 산소를 제2 농도의 용존 산소로 감소시키는 것은 혼합물이 형성된 후 약 45분 이내에 성장 구획에서의 수성 혼합물 중의 제2 농도로 용존 산소를 감소시키는 것을 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 제1 농도의 용존 산소를 제2 농도의 용존 산소로 감소시키는 것은 혼합물이 형성된 후 약 30분 이내에 성장 구획에서의 수성 혼합물 중의 제2 농도로 용존 산소를 감소시키는 것을 포함한다.

임의의 실시 형태에서, 성장 구획에서의 수성 혼합물 중의 제1 농도의 용존 이산화탄소는 미생물의 성장을 지원하는 농도일 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 성분들을 수성 유체 연통 상태에 놓이게 하는 것은 이산화탄소-발생 반응을 개시하고, 그럼으로써 성장 구획에서의 수성 혼합물 중의 이용가능한 이산화탄소의 제1 농도를 (예를 들어, 90분 미만 이내, 60분 미만 이내, 또는 30분 미만 이내에) 제1 농도보다 높은(예를 들어, 제1 농도의 약 2배, 제1 농도의 약 4배, 제1 농도의 약 5배, 제1 농도의 약 9.4배인) 제2 농도로 증가시키는데, 이는 실시예에 나타낸 바와 같다. 추가의 이용가능한 이산화탄소는, 본 발명의 배양 장치가 접종되고 인큐베이션될 때, 성장 구획 내에 형성된 하이드로겔 내에서의 거시적인(즉, 1 mm 이상 직경의) 가스 버블의 형성을 야기하지 않는다.

샘플 물질이 배양 장치 내로 넣어지기 전에, 배양 장치가 수화되는 경우, 배양 물질을 접종하기 위해 장치를 다시 개방하기 전에, 냉수-가용성 겔화제는 선택적으로 (예를 들어, 실온에서) 수분 내지 최대 약 30분 또는 그 이상 동안 수화되게 하여 겔을 형성되게 할 수 있다. 겔화제가 수화되게 하여 겔을 형성되게 하는 기간 동안, 산소-포착 시약은 수화된 겔화제 중의 용존 산소의 농도를 제1 농도로부터 미내기성 또는 절대-혐기성 LAB의 성장을 촉진시키는 제2 농도로 감소시키는데, 이는 본 명세서에 논의된 바와 같다.

배양 장치의 성장 구획이 수화되기 전이나 후에, 샘플 물질은 당업계에 알려진 다양한 방법으로 성장 구획과 접촉될 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 샘플 물질은, 샘플 물질을 성장 영역 내로 침적함으로써 성장 영역과 접촉된다. 이것은, 예를 들어 피펫팅함으로써, 성장 구획을 (예를 들어, 표면을 면봉으로 채취함으로써) 샘플 물질을 획득하기 위해 사용된 면봉과 접촉시킴으로써, 성장 구획을 (예를 들어, 스트리크-플레이트(streak-plate) 기법을 사용하여) 접종 루프 또는 니들과 접촉시킴으로써, 또는 샘플 포획 장치(예를 들어, 면봉, 스펀지, 또는 막 필터)를 성장 구획 내로 직접 넣고 배양 장치를 다시 폐쇄함으로써 행해질 수 있다. 샘플을 침적하고, (배양 장치에서 육안으로 보이는 공기 버블을 혼입시키지 않도록 주의하면서) 배양 장치를 다시 폐쇄한 후에, 산소-포착 시약은 성장 구획 내의 용존 산소의 고갈을 재개한다.

임의의 실시 형태에서, 배양 장치의 성장 구획 내의 건조성 성분들이 수화되고 겔화제가 겔을 형성한 후에, 배양 장치는 접촉 플레이트(예를 들어, 로닥(Rodac) 플레이트)로서 사용될 수 있다. 따라서, 겔이 형성된 후에, 배양 장치의 기저부 및 커버시트를 분리하여, 수화된 겔을 노출시킨다. 수화된 겔은 샘플링하고자 하는 표면과 접촉되고, 배양 장치에서 육안으로 보이는 공기 버블을 혼입시키지 않도록 주의하면서, 배양 장치를 다시 폐쇄한다. 장치를 다시 폐쇄함으로써, 수화된 겔은 배양 장치 내부의 성장 구획으로 복귀된다. 유리하게도, 접촉 플레이트 절차는 호기성 환경에서 수행될 수 있고, 배양 장치를 다시 폐쇄한 후에는, 산소-포착 시약에 의해 배양 장치에서 산소-감소된 환경이 재확립될 수 있다.

본 방법의 임의의 실시 형태에서, 샘플이 성장 구획 내로 넣어지고 폐쇄된 후에, 배양 장치는 일정 기간(예를 들어, 미리 정해진 기간) 동안 인큐베이션된다. 인큐베이션 조건(예를 들어, 인큐베이션 온도)은, 당업자에 의해 잘 알려진 바와 같이, LAB의 성장 속도에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 더 낮은 온도(예를 들어, 약 25℃)에서의 인큐베이션은 저온성(psychrotrophic) LAB의 검출을 가능하게 할 수 있다. 더 높은 온도(예를 들어, 약 30℃, 약 32℃, 약 35℃, 약 37℃)에서의 인큐베이션은 소정의 중온성(mesophilic) LAB의 더 빠른 성장을 촉진시킬 수 있다.

일부 실시 형태에서, 접종 후에, 배양 장치는 적어도 약 16시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 24시간, 또는 적어도 약 48시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 배양 장치는 약 24시간 이하, 약 48시간 이하, 또는 약 72시간 이하 인큐베이션될 수 있다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 배양 장치는 약 24시간 내지 약 48시간 인큐베이션된다. 임의의 실시 형태에서, 배양 장치는 인큐베이션되고, 성장 구획에서 성장하는 LAB 콜로니를 검출 또는 계수하기 전에 약 72시간 동안, 약 96시간 동안, 약 120시간 동안, 약 7일 동안, 또는 약 8일 동안 산소-감소된 환경을 내부에서 유지할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 미생물 콜로니의 형성을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 배양 장치를 인큐베이션하는 단계는 호기성 분위기에서(즉, 배양 장치는 인큐베이션 동안 산소-감소된 용기 또는 글로브 박스 내로 넣어지지 않음) 그 기간 동안 배양 장치를 인큐베이션하는 단계를 포함한다.

접종된 배양 장치가 인큐베이션된 후에, 본 방법은 미생물 콜로니를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 미생물 콜로니는 당업계에 알려진 다양한 기법에 의해 배양 장치에서 검출될 수 있다. 적합한 인큐베이션 기간 후에, 미생물의 부재는 관찰가능한 콜로니의 부재, 성장 지시약(예를 들어, pH 지시약, 발색성 효소 기질, 산화환원 지시약, 예컨대 TTC, 형광발생성 효소 기질)의 변화의 부재, 및 성장 배지 중 발효가능한 탄수화물의 대사와 관련된 가스 버블의 부재에 의해 배양 장치에서 검출될 수 있다.

미생물 콜로니와 관련된 산 구역이 시각적으로 그리고/또는 이미징 시스템의 사용에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 배양 배지가 pH 지시약으로서 브롬크레졸 퍼플을 포함하는 방법에서, 배양 배지는 대략 중성인 pH에서 자주색 또는 회색 외관을 가질 것이다. 미생물이 배양 배지 중에서 성장하여 탄수화물(예를 들어, 글루코스)을 발효시킴에 따라, 브롬크레졸 퍼플 지시약은 성장 중인 세균 콜로니에 인접하여 황색으로 나타날 것이다. 예를 들어, 배양 배지가 pH 지시약으로서 클로로페놀 레드를 포함하는 방법에서, 배양 배지는 대략 중성인 pH에서 적색 또는 보라색 외관을 가질 것이다. 미생물이 배양 배지 중에서 탄수화물(예를 들어, 글루코스)을 발효시킴에 따라, 클로로페놀 레드 지시약은 성장 중인 미생물 콜로니에 인접하여 황색으로 나타날 것이다.

미생물 콜로니와 관련하여(예를 들어, 콜로니와 닿거나 콜로니로부터 약 1 mm 이하의 거리 이내에서) 성장 구획 내에 존재하는 경우, 가스 버블은 시각적으로 그리고/또는 이미징 시스템의 사용에 의해 검출될 수 있다. 가스 버블은 미생물 콜로니에 인접한 영역에서의 pH 지시약의 변색에 의해 검출가능한 산 구역 및/또는 가시적 콜로니와 관련될 수 있다. 가스 버블은, 예를 들어 탄수화물의 혐기성 발효에 의해 생성된 이산화탄소를 포함할 수 있다.

임의의 상기 실시 형태에서, 본 방법은 배양 장치의 이미지를 획득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시 형태에서, LAB의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 배양 장치의 이미지를 디스플레이, 인쇄, 또는 분석하는 단계를 포함한다. 이미징 시스템은 이미징 장치를 포함하고, 프로세서를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이미징 장치는 라인-스캐너 또는 영역 스캐너(예를 들어, 카메라)를 포함할 수 있다. 이미징 장치는 단색(예를 들어, 흑백) 또는 다색(예를 들어, 컬러) 스캐너를 포함할 수 있다. 유리하게도, 단색 이미징 시스템은 더 높은 해상도 이미지를 제공할 수 있으며, 이러한 높은 해상도 이미지는 결과의 정확도를 개선하고/하거나 배양 장치 중 미생물의 존재를 검출하는 데 필요한 시간을 감소시킬 수 있다.

일부 실시 형태에서, 이미징 시스템은 조명 시스템을 추가로 포함한다. 조명 시스템은 넓은 스펙트럼의 가시광(예를 들어, "백색" 광)의 적어도 하나의 공급원을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조명 시스템은 좁은 스펙트럼의 가시광의 적어도 하나의 공급원(예를 들어, 비교적 좁은 대역폭의 가시광, 예컨대 적색광, 녹색광, 또는 청색광을 방출하는 발광 다이오드)을 포함할 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 조명 시스템은 미리 선택된 파장(예를 들어, 약 525 nm)의 발광 피크를 갖는 좁은 스펙트럼의 가시광의 공급원(예를 들어, 발광 다이오드)을 포함할 수 있다.

이미지는 배양 장치의 성장 구획 내의 성분들(예를 들어, 미생물 콜로니, 성장 배지, 및 지시약)에 의해 반사되는 광으로부터 획득될 수 있거나, 이미지는 배양 장치의 성장 구획 내의 성분들을 통해 투과되는 광으로부터 획득될 수 있다. 적합한 이미징 시스템 및 상응하는 조명 시스템은, 예를 들어, 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 국제 특허 출원 공개 WO 2005/024047호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0101954호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0102903호에 기재되어 있다. 적합한 이미징 시스템의 비제한적인 예에는 쓰리엠 컴퍼니(3M Company)(미국 미네소타주 세인트 폴 소재)로부터 입수가능한 페트리필름 플레이트 리더(PETRIFILM Plate Reader)(PPR), 스파이럴 바이오테크(Spiral Biotech)(미국 매사추세츠주 노우드 소재)로부터 입수가능한 페트리스캔 콜로니 계수기(PETRISCAN Colony Counter), 및 신바이오시스(Synbiosis)(영국 케임브리지 소재)로부터 입수가능한 프로토콜(PROTOCOL) 및 아콜라이트(ACOLYTE) 플레이트 스캐너가 포함된다.

일부 실시 형태에서, 이미지 획득은 파장-바이어스된 이미지를 획득하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이미징 시스템은 이미징 장치에 의해 수집되는 광을 바이어스시키는 바이어스 필터를 포함할 수 있다. 필터 요소는 당업계에 공지되어 있으며, "컷오프(cut-off)" 필터(즉, 소정의 지정된 파장보다 큰 또는 그보다 작은 광 파장의 통과를 허용하는 필터) 및 "밴드-패스(band-pass)" 필터(즉, 소정의 지정된 상한치와 하한치 사이의 광 파장의 통과를 허용하는 필터) 둘 모두를 포함한다. 바이어스 필터는 조명원과 배양 장치 사이에 위치될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 바이어스 필터는 배양 장치와 이미징 장치 사이에 위치될 수 있다.

예시적인 실시 형태

실시 형태 A는, 표적 미생물의 콜로니를 계수하기 위한 배양 장치로서,

서로 반대편에 있는 내부 표면 및 외부 표면을 갖는 기저부;

서로 반대편에 있는 내부 표면 및 외부 표면을 갖는 커버시트;

상기 기저부와 상기 커버시트 사이에 배치되고, 상기 기저부 또는 상기 커버시트에 결합되고, 성장 구획의 형상 및 깊이를 형성하는 개구를 포함하는 비다공성 스페이서 부재 - 상기 스페이서 부재 및 상기 성장 구획은 상기 기저부의 내부 표면과 상기 커버시트의 내부 표면 사이에 배치됨 -;

상기 성장 구획 내에 배치되고, 직경이 106 마이크로미터 미만인 입자들로 본질적으로 이루어진 유효량의 건조성 산소-포착 시약;

상기 성장 구획 내에 배치되고, 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트에 접착되는 건조성 냉수-가용성 겔화제;

상기 성장 구획 내에 배치되고, 상기 성장 구획이 미리 정해진 부피의 탈이온수로 수화될 때, pH가 6.35 이하인 수성 혼합물을 형성하는 건조성 완충 시스템; 및

상기 성장 구획 내에 배치되고, 직경이 106 마이크로미터 미만인 입자들로 본질적으로 이루어진 유효량의 건조성 이산화탄소-발생 시약을 포함하는, 배양 장치이다.

실시 형태 B는, 실시 형태 A에 있어서, 상기 산소-포착 시약은 직경이 106 마이크로미터 미만인 입자들로 본질적으로 이루어지는, 배양 장치이다.

실시 형태 C는, 실시 형태 A 또는 실시 형태 B에 있어서, 상기 이산화탄소-발생 시약은 직경이 106 마이크로미터 미만인 입자들로 본질적으로 이루어지는, 배양 장치이다.

실시 형태 D는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 장치는 상기 성장 구획 내에 배치된 건조성 영양소를 추가로 포함하며, 상기 영양소는 상기 표적 미생물의 성장을 촉진시키도록 선택되는, 배양 장치이다.

실시 형태 E는, 실시 형태 D에 있어서, 상기 영양소는 발효가능한 탄수화물을 포함하는, 배양 장치이다.

실시 형태 F는, 실시 형태 E에 있어서, 상기 탄수화물은 글루코스, 말토스, 수크로스, 및 트레할로스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 배양 장치이다.

실시 형태 G는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 장치는 상기 성장 구획 내에 배치된 제1 지시 시약을 추가로 포함하며, 상기 제1 지시 시약은 상기 표적 미생물의 성장을 검출하도록 선택되는, 배양 장치이다.

실시 형태 H는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 장치는 상기 성장 구획 내에 배치된 유효량의 선택제를 추가로 포함하며, 상기 선택제는 비표적 미생물의 성장을 억제하도록 선택되는, 배양 장치이다.

실시 형태 I는, 실시 형태 H에 있어서, 상기 선택제는 사이클로헥시미드, 마크로라이드 폴리엔, 암포테리신 B, 나타마이신, 및 필리핀으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 배양 장치이다.

실시 형태 J는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 장치는 상기 성장 구획 내에 배치된 유효량의 환원제를 추가로 포함하는, 배양 장치이다.

실시 형태 K는, 실시 형태 J에 있어서, 상기 환원제는 소듐 티오글리콜레이트, 다이티오트레이톨, 및 다이티오에리트리톨로 이루어진 군으로부터 선택되는, 배양 장치이다.

실시 형태 L은, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 산소-포착 시약은 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트에 접착되는, 배양 장치이다.

실시 형태 M은, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 완충 시스템의 성분이 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트에 접착되는, 배양 장치이다.

실시 형태 N은, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 완충 시스템은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 및 소듐 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산, 및 석신산 및 소듐 석시네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분을 포함하는, 배양 장치이다.

실시 형태 O는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 이산화탄소-발생 시약은 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트에 접착되는, 배양 장치이다.

실시 형태 P는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 이산화탄소-발생 시약은 금속 탄산염을 포함하는, 배양 장치이다.

실시 형태 Q는, 실시 형태 P에 있어서, 상기 금속 탄산염은 중탄산나트륨 및 탄산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 배양 장치이다.

실시 형태 R은, 실시 형태 D 내지 실시 형태 K 중 어느 하나에 있어서, 상기 영양소는 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트에 접착되는, 배양 장치이다.

실시 형태 S는, 실시 형태 G 내지 실시 형태 R 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 지시 시약은 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트에 접착되는, 배양 장치이다.

실시 형태 T는, 실시 형태 H 내지 실시 형태 S 중 어느 하나에 있어서, 상기 선택제는 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트에 접착되는, 배양 장치이다.

실시 형태 U는, 실시 형태 I 내지 실시 형태 T 중 어느 하나에 있어서, 상기 환원제는 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트에 접착되는, 배양 장치이다.

실시 형태 V는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서,

상기 기저부의 내부 표면에는 제1 접착제가 접착되어 있고;

상기 성장 구획 내에 배치된 하나 이상의 제1 성분이 상기 제1 접착제에 접착되며;

상기 제1 성분은 상기 겔화제, 상기 산소-포착 시약, 상기 완충 시스템, 상기 영양소, 상기 지시 시약, 상기 선택제, 상기 환원제, 및 상기 제1 성분들 중 임의의 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 배양 장치이다.

실시 형태 W는, 실시 형태 V에 있어서,

제2 성분이 상기 제1 접착제에 배치되며;

상기 제2 성분은 상기 지시 시약, 상기 선택제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 배양 장치이다.

실시 형태 X는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서,

상기 커버시트의 내부 표면에는 제2 접착제가 접착되어 있고;

상기 성장 구획 내에 배치된 하나 이상의 제3 성분이 상기 제2 접착제에 접착되며;

상기 제3 성분은 상기 겔화제, 상기 산소-포착 시약, 상기 완충 시스템, 상기 영양소, 상기 지시 시약, 상기 선택제, 상기 환원제, 및 상기 제3 성분들 중 임의의 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 배양 장치이다.

실시 형태 Y는, 실시 형태 X에 있어서,

제4 성분이 상기 제2 접착제에 배치되며;

상기 제4 성분은 상기 지시 시약, 상기 선택제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 배양 장치이다.

실시 형태 Z는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 이산화탄소-발생 시약은 탄산의 염을 포함하는, 배양 장치이다.

실시 형태 AA는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 산소-포착 시약은 제1철 또는 이의 염 또는 아스코르브산 또는 이의 염을 포함하는, 배양 장치이다.

실시 형태 AB는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 장치는 상기 성장 구획과 유체 연통하여 배치된 제2 지시 시약을 추가로 포함하며, 상기 제2 지시 시약은 비표적 미생물 및 상기 표적 미생물의 존재를 지시하는, 배양 장치이다.

실시 형태 AC는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 산소-포착 시약은 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트의 표면적 10 ㎠당 약 1.5 마이크로몰 내지 약 15 마이크로몰의 양으로 상기 성장 구획 내에 배치되는, 배양 장치이다.

실시 형태 AD는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나에 있어서, 상기 이산화탄소-발생 시약은 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트의 표면적 10 ㎠당 약 1 마이크로몰 내지 약 15 마이크로몰의 양으로 상기 성장 구획 내에 배치되는, 배양 장치이다.

실시 형태 AE는, 샘플에서 미생물을 검출하는 방법으로서,

선행하는 청구항들 중 어느 하나의 배양 장치를 개방하여 그 안의 상기 성장 구획에 대한 접근을 제공하는 단계;

미리 정해진 부피의 수성 액체를 상기 성장 구획 내로 넣는 단계;

샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계;

상기 배양 장치를 폐쇄하는 단계 -

상기 수성 액체 및 상기 샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계 및 상기 배양 장치를 폐쇄하는 단계는 상기 배양 장치의 기저부, 커버시트, 및 스페이서에 의해 에워싸인 반고체 미생물 배양 배지를 형성하는 단계를 포함하고; 상기 배양 배지는 pH가 4.0 내지 6.35임 -;

상기 배양 배지 내에서의 미생물 콜로니의 형성을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 상기 배양 장치를 인큐베이션하는 단계; 및

상기 미생물 콜로니를 검출하는 단계를 포함하는, 방법이다.

실시 형태 AF는, 실시 형태 AE에 있어서, 상기 미리 정해진 부피를 상기 성장 구획 내로 넣는 단계는 상기 샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계를 동시에 포함하는, 방법이다.

실시 형태 AG는, 실시 형태 AE에 있어서, 상기 미리 정해진 부피를 상기 성장 구획 내로 넣는 단계는 상기 샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계를 동시에 포함하지 않는, 방법이다.

실시 형태 AH는, 실시 형태 AG에 있어서, 상기 샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계는 상기 미리 정해진 부피를 상기 성장 구획 내로 넣는 단계 후에 일어나는, 방법이다.

실시 형태 AI는, 실시 형태 AG에 있어서, 상기 샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계는 상기 미리 정해진 부피를 상기 성장 구획 내로 넣는 단계 전에 일어나는, 방법이다.

실시 형태 AJ는, 실시 형태 AE 내지 실시 형태 AI 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계는 첨가제를 상기 성장 구획 내로 넣는 단계를 포함하는, 방법이다.

실시 형태 AK는, 실시 형태 AE 내지 실시 형태 AJ 중 어느 하나에 있어서, 상기 첨가제를 상기 성장 구획 내로 넣는 단계는 유효량의 선택제 또는 지시약을 넣는 단계를 포함하는, 방법이다.

실시 형태 AL은, 실시 형태 AK에 있어서, 상기 유효량의 선택제는 상기 배양 장치에서 락트산 세균의 성장을 실질적으로 가능하게 하고, 상기 유효량의 선택제는 E. 콜라이, S. 아우레우스, C. 스포로게네스, C. 페르프린겐스, 박테로이데스 프라길리스, 프레보텔라 멜라니노겐시아, 및/또는 푸소박테리움 종의 성장을 실질적으로 억제하는, 방법이다.

실시 형태 AM은, 실시 형태 AE 내지 실시 형태 AL 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 장치를 일정 기간 동안 인큐베이션하는 단계는 상기 배양 장치를 호기성 분위기에서 상기 일정 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법이다.

실시 형태 AN은, 실시 형태 AE 내지 실시 형태 AM 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 장치를 인큐베이션한 후에, 상기 미생물 콜로니를 검출하는 단계는 상기 배양 장치에서 하나 이상의 광학적으로 검출가능한 콜로니를 계수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법이다.

실시 형태 AO는, 실시 형태 AE 내지 실시 형태 AN 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 장치는 상기 성장 구획 내에 배치된 상기 지시 시약을 포함하며, 상기 미생물 콜로니를 검출하는 단계는 상기 지시 시약과 관련된 광학적 변화를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 광학적 변화는 상기 미생물 콜로니 부근에서 검출되는, 방법이다.

실시 형태 AP는, 실시 형태 AO에 있어서, 상기 광학적 변화는 변색을 포함하는, 방법이다.

실시 형태 AQ는, 실시 형태 AE 내지 실시 형태 AP 중 어느 하나에 있어서, 상기 미생물 콜로니를 검출하는 단계는 상기 성장 구획 내의 상기 콜로니 부근의 가스 버블을 광학적으로 검출하는 단계를 포함하는, 방법이다.

실시 형태 AR은, 실시 형태 AN 내지 실시 형태 AQ 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 미생물 콜로니를 계수하는 단계는 이산화탄소-생성 콜로니를 이산화탄소-무생성 콜로니와 구별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법이다.

본 발명의 목적 및 이점이 하기의 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 이들 실시예에 언급된 특정 재료 및 이의 양뿐만 아니라 다른 조건 및 세부 사항은 본 발명을 부당하게 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예

실시예 1. 자급식 혐기성 환경-생성 배양 장치의 제조.

도 1에서의 배양 장치에 따라 자급식 혐기성 환경-생성 배양 장치를 제조하였다. 기저부는 5 밀(mil)(0.127 mm) 두께의 폴리에스테르 필름(미국 버지니아주 체스처 소재의 듀폰 테이진(DuPont Teijin)으로부터 입수된 멜리넥스(MELINEX) 등급 377 이축 배향된 폴리에스테르(PET) 필름)으로 이루어졌다. 영양소 분말 제형(표 1에 열거됨) 및 구아 검(16 g/L)을 탈이온수 중에서 교반하여 실질적으로 균일한 혼합물을 달성하였다. 혼합물의 pH를 5.8 +/- 0.5가 되도록 목표 설정하고, 필요하다면 산 또는 염기로 조정하여 목표값을 충족시켰다. 혼합물을 미국 특허 제4,565,783호에 기재된 바와 같이 기저부 상에 나이프-코팅하고, 대류 오븐 내에서 210℉(98.9℃)에서 8분 동안 건조시켰다. 영양소 층은 (건조 후의) 목표 코팅 중량이 0.56 g/24 in²(3.6 mg/㎠)가 되는 두께로 코팅하였다. 건조 후에, 두께가 대략 20 밀(0.508 mm)인 폴리에틸렌 필름 스페이서(미국 위스콘신주 블루머 소재의 옵티멈 플라스틱스(Optimum Plastics))를 얇은 감압 접착제 층(2 중량%의 아크릴산과 공중합된 98 중량%의 아이소옥틸 아크릴레이트)을 통해 기저부 상의 건조된 코팅에 접착하였다. 스페이서는 도 1에 예시된 스페이서 내에 구멍을 형성하는 2 3/8 인치(6.03 cm) 직경의 원형 개구부를 포함하였다. 원형 개구부는 본 장치의 성장 구획의 주연부를 형성하였다.

소듐 아스코르베이트(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코포레이션(Sigma-Aldrich Corporation)) 및 중탄산나트륨(시그마-알드리치 코포레이션)을 개별적으로 밀링하고, 이어서 140 메시 체에 통과시켰다(그 결과, 입자 크기가 106 마이크로미터 미만이 됨). 구아 검(89.75 중량%, 덴마크 코펜하겐 소재의 듀폰 다니스코(DuPont Danisco)로부터 입수가능함), 체분리된 소듐 아스코르베이트(10 중량%), 및 체분리된 중탄산나트륨(0.25 중량%)의 균질 혼합물을 제조하였다. 커버시트는, 코팅 중량이 0.2 g/24 in²(1.3 mg/㎠)가 되도록 한쪽 면 상에 제2 감압 접착제(4%의 아크릴아미드와 공중합된 96 중량%의 아이소옥틸 아크릴레이트)로 코팅된 투명 폴리에스테르(PET) 필름(0.073 mm 두께)으로 이루어졌다. 이어서, 구아 검, 체분리된 소듐 아스코르베이트, 및 체분리된 중탄산나트륨의 균질 혼합물을 커버시트의 접착제 상에 분말 코팅하였다. 커버시트를 양면 접착 테이프를 사용하여 한쪽 에지를 따라 기저부에 부착하고, 장치를 도 1에 도시된 것과 유사하게 대략 3"(7.6 cm) x 4"(10.1 cm) 직사각형으로 잘라내었다. 커버시트의 코팅된 면을 스페이서 및 성장 구획과 대면하도록 배향하였다.

[표 1]

실시예 2

실시예 1의 분말 혼합물로 코팅하는 것 대신에, 커버시트의 접착제를 구아 검(89.7 중량%), 소듐 아스코르베이트(10 중량%), 및 중탄산나트륨(0.3 중량%)의 분말 혼합물로 코팅한 것을 제외하고는, 실시예 1의 설명에 따라 자급식 혐기성 환경-생성 배양 장치를 제조하였다.

실시예 3

실시예 1의 분말 혼합물로 코팅하는 것 대신에, 커버시트의 접착제를 구아 검(89.5 중량%), 소듐 아스코르베이트(10 중량%), 및 중탄산나트륨(0.5 중량%)의 분말 혼합물로 코팅한 것을 제외하고는, 실시예 1의 설명에 따라 자급식 혐기성 환경-생성 배양 장치를 제조하였다.

실시예 4

실시예 1의 분말 혼합물로 코팅하는 것 대신에, 커버시트의 접착제를 구아 검(89.0 중량%), 소듐 아스코르베이트(10 중량%), 및 중탄산나트륨(1.0 중량%)의 분말 혼합물로 코팅한 것을 제외하고는, 실시예 1의 설명에 따라 자급식 혐기성 환경-생성 배양 장치를 제조하였다.

실시예 5

실시예 1의 분말 혼합물로 코팅하는 것 대신에, 커버시트의 접착제를 구아 검(88.0 중량%), 소듐 아스코르베이트(10 중량%), 및 중탄산나트륨(2.0 중량%)의 분말 혼합물로 코팅한 것을 제외하고는, 실시예 1의 설명에 따라 자급식 혐기성 환경-생성 배양 장치를 제조하였다.

실시예 6. 실시예 1 내지 실시예 5의 장치에서의 CO ₂ 농도 측정

실시예 1 내지 실시예 5의 자급식 혐기성 환경-생성 배양 장치를 pCO₂ 미니 v2 섬유 광송신기(독일 레겐스부르크 소재의 프레센스 프레시전 센싱 게엠베하, cat# 200001207)를 CO₂ 장력 측정을 위한 벤더 공급 소프트웨어와 함께 사용하여 CO₂ 발생에 대해 모니터링하였다. 커버시트를 들어 올림으로써 각각의 장치를 개방하여 성장 구획의 성장 영역을 노출시켰다. 멸균 버터필드(Butterfield) 완충액 1 밀리리터를 각각의 플레이트의 성장 구획 내로 침적하였다. 박형 CO₂ 센서(5 mm 직경 및 200 마이크로미터 두께)(평면형 pCO₂ 미니센서 스폿(Minisensor Spot), 프레센스 프레시전 센싱 게엠베하, cat# 200001178)를 수화된 성장 구획 내로 즉시 넣고, 커버시트가 수화된 성장 영역 및 스페이서와 접촉할 때까지 그것을 조심스럽게 내렸다. 편평한 플라스틱 스프레더를 폐쇄된 장치에 대고 눌러서 성장 구획 전체에 걸쳐 액체가 펼쳐지게 하였다. 장치를 폐쇄한 후에, 송신기로의 중합체 광섬유 케이블을 사용하여 센서로부터의 형광을 모니터링하였다. 수화된 성장 구획에서의 CO₂ 농도의 측정을, 장치를 폐쇄한 직후에 그리고 90분 후에 기록하였다. 표 2에는, 90분 후에 측정된 CO₂ 농도의 평균 배수 증가가 기록되어 있다(n=5).

[표 2]

실시예 7. 자급식 혐기성 환경-생성 배양 장치의 제조 및 사용.

도 1에서의 배양 장치에 따라 자급식 혐기성 환경-생성 배양 장치를 제조하였다. 구아 검(14 g/L)을 표 1에서의 제형 대신에 표 3의 영양소 제형과 배합한 것만을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 절차에 따라 기저부를 코팅하고 제조하였다.

소듐 아스코르베이트(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코포레이션) 및 중탄산나트륨(시그마-알드리치 코포레이션)을 개별적으로 밀링하고, 이어서 140 메시 체에 통과시켰다(그 결과, 입자 크기가 106 마이크로미터 미만이 됨). 구아 검(89.7 중량%, 덴마크 코펜하겐 소재의 듀폰 다니스코로부터 입수가능함), 체분리된 소듐 아스코르베이트(10 중량%), 및 체분리된 중탄산나트륨(0.3 중량%)의 균질 혼합물을 제조하였다. 커버시트는, 코팅 중량이 0.2 g/24 in²(1.3 mg/㎠)가 되도록 한쪽 면 상에 제2 감압 접착제(4%의 아크릴아미드와 공중합된 96 중량%의 아이소옥틸 아크릴레이트)로 코팅된 투명 폴리에스테르(PET) 필름(0.073 mm 두께)으로 이루어졌다. 미량의 트라이페닐 테트라졸륨 클로라이드(약 0.48 mg/24 in²(0.003 mg/㎠))를 접착제 내에 혼입시켰다. 이어서, 구아 검, 체분리된 소듐 아스코르베이트, 및 체분리된 중탄산나트륨의 균질 혼합물을 커버시트의 접착제 상에 분말 코팅하였다. 커버시트를 양면 접착 테이프를 사용하여 한쪽 에지를 따라 기저부에 부착하고, 장치를 도 1에 도시된 것과 유사하게 대략 3"(7.6 cm) x 4"(10.1 cm) 직사각형으로 잘라내었다. 커버시트의 코팅된 면을 스페이서 및 성장 구획과 대면하도록 배향하였다.

세균 균주 락토바실루스 종(Lactobacillus species), 레우코노스톡 메센테로이데스 spp 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides), 레우코노스톡 메센테로이데스 spp 덱스트라니쿰(Leuconostoc mesenteroides ssp dextranicum), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실루스 델브루에키이(Lactobacillus delbruekii), 스트렙토콕쿠스 알락톨리티쿠스(Streptococcus alactolyticus), 락토콕쿠스 가르비에아이(Lactococcus garvieae), 및 페디오콕쿠스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici)의 개별 샘플을 식품 및 음료 샘플로부터 천연 단리물로서 획득하였다. 개별 현탁액을 버터필드 완충액 중에서 제조하고 연속 희석시켜, (개별 유기체의) 약 100의 CFU 카운트를 제공하는 농도를 갖는 최종 현탁액을 얻었다. 각각의 현탁액 1 밀리리터를 사용하여, 실시예에 따라 제조된 개별 배양 장치를 접종시켰다. 커버시트를 들어 올려 성장 구획의 성장 영역을 노출시키고, 1 밀리리터의 현탁액을 성장 구획 내로 피펫팅하고, 커버시트가 현탁액 및 스페이서와 접촉할 때까지 그것을 조심스럽게 내리고, 편평한 플라스틱 스프레더를 폐쇄된 장치에 대고 조심스럽게 눌러서 성장 구획 전체에 걸쳐 액체 현탁액이 펼쳐지게 함으로써 배양 장치를 접종시켰다.

접종 후, 배양 장치를 호기성 인큐베이터 내에서 32℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각각의 배양 장치 내의 적색 콜로니를 시각적 검사에 의해 계수하였다. 각각의 유기체에 대해 평균 콜로니 카운트(n=2)를 결정하였다.

비교 참조로서, 이 실시예의 배양 장치에 대해 상기에 사용된 것과 동일한 희석률 및 부피의 개별 현탁액을 한천 플레이트에도 접종하였다. 한천 플레이트는 유산균 MRS 한천(Lactobacilli MRS Agar)(미국 뉴저지주 뉴 프랭클린 소재의 벡톤 딕킨슨 코포레이션(Becton Dickinson Corporation))을 사용하여 제조하였다. 한천(70 g)을 1 L의 정제수 중에 연속 현탁시키고, 1분 동안 비등하여 분말을 용해시키고, 121℃에서 15분 동안 오토클레이빙하고, 45 내지 50℃로 냉각시켰다. 이어서, 냉각된 배지(접시당 15 내지 20 mL)를, 1 mL의 개별 샘플 현탁액이 담긴 멸균 페트리 접시 내로 부었다. 플레이트를 한 방향으로 회전시키고 나서 반대 방향으로 회전시킴으로써 접종물을 배지 전체에 걸쳐 분포시켰다. 이어서, 접종된 접시를 인큐베이션 기간 동안 혐기성 분위기를 제공하는 가스-발생 샤세(가스팩 EZ 혐기성 생물 샤세(GASPAK EZ Anaerobe Sachet), 벡톤 딕킨슨 코포레이션)와 함께 혐기성 챔버 내에 넣었다. 한천 플레이트를 32℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트 상의 콜로니를 시각적 검사에 의해 계수하였다. 각각의 유기체에 대해 평균 콜로니 카운트(n=2)를 결정하였다.

표 4에는, 참조 한천 플레이트를 사용하여 결정된 평균 콜로니 카운트에 대한 실시예의 배양 장치를 사용하여 결정된 평균 콜로니 카운트의 비가 시험된 각각의 유기체에 대하여 나타나 있다[즉, 비 = (실시예의 배양 장치를 사용한 평균 콜로니 카운트) / (참조 한천 플레이트를 사용한 평균 콜로니)].

[표 3]

[표 4]

본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물, 그리고 전자적으로 입수가능한 자료의 완전한 개시 내용이 참고로 포함된다. 본 출원의 개시 내용과 본 명세서에 참고로 포함된 임의의 문헌의 개시 내용(들) 사이에 임의의 모순이 존재하는 경우, 본 출원의 개시 내용이 좌우할 것이다. 전술한 상세한 설명 및 예는 단지 명확한 이해를 위해 제시되었다. 이로부터의 어떠한 불필요한 제한도 없음이 이해되어야 한다. 당업자에게 명백한 변형이 청구범위에 의해 한정되는 본 발명 내에 포함될 것이므로, 본 발명은 제시되고 기술된 정확한 상세 사항으로 제한되지 않는다.

모든 표제는 독자의 편의를 위한 것이며, 명시되지 않는 한 표제 이후에 나오는 본문의 의미를 제한하기 위해 사용되어서는 안 된다.

본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어남이 없이 다양한 변경이 이루어질 수 있다. 이들 및 다른 실시 형태는 하기 청구범위의 범주 내에 있다.

Claims (20)

1. 표적 미생물의 콜로니를 계수하기 위한 배양 장치로서,
   서로 반대편에 있는 내부 표면 및 외부 표면을 갖는 기저부(base);
   서로 반대편에 있는 내부 표면 및 외부 표면을 갖는 커버시트(coversheet);
   상기 기저부와 상기 커버시트 사이에 배치되고, 상기 기저부 또는 상기 커버시트에 결합되고, 성장 구획의 형상 및 깊이를 형성하는 개구(aperture)를 포함하는 비다공성 스페이서 부재 - 상기 스페이서 부재 및 상기 성장 구획은 상기 기저부의 내부 표면과 상기 커버시트의 내부 표면 사이에 배치됨 -;
   상기 성장 구획 내에 배치된 유효량의 건조성(dry) 산소-포착 시약;
   상기 성장 구획 내에 배치되고, 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트에 접착되는 건조성 냉수-가용성 겔화제;
   상기 성장 구획 내에 배치되고, 상기 성장 구획이 미리 정해진 부피의 탈이온수로 수화될 때, pH가 6.35 이하인 수성 혼합물을 형성하는 건조성 완충 시스템; 및
   상기 성장 구획 내에 배치된 유효량의 건조성 이산화탄소-발생 시약을 포함하는, 배양 장치.
2. 제1항에 있어서, 상기 산소-포착 시약은 직경이 106 마이크로미터 미만인 입자들로 본질적으로 이루어지는, 배양 장치.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이산화탄소-발생 시약은 직경이 106 마이크로미터 미만인 입자들로 본질적으로 이루어지는, 배양 장치.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 장치는 상기 성장 구획 내에 배치된 건조성 영양소를 추가로 포함하며, 상기 영양소는 상기 표적 미생물의 성장을 촉진시키도록 선택되는, 배양 장치.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 장치는 상기 성장 구획 내에 배치된 제1 지시 시약을 추가로 포함하며, 상기 제1 지시 시약은 상기 표적 미생물의 성장을 검출하도록 선택되는, 배양 장치.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 장치는 상기 성장 구획 내에 배치된 유효량의 선택제(selective agent)를 추가로 포함하며, 상기 선택제는 비표적 미생물의 성장을 억제하도록 선택되는, 배양 장치.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 장치는 상기 성장 구획 내에 배치된 유효량의 환원제를 추가로 포함하는, 배양 장치.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이산화탄소-발생 시약은 금속 탄산염을 포함하는, 배양 장치.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 기저부의 내부 표면에는 제1 접착제가 접착되어 있고;
   상기 성장 구획 내에 배치된 하나 이상의 제1 성분이 상기 제1 접착제에 접착되며;
   상기 제1 성분은 상기 겔화제, 상기 산소-포착 시약, 상기 완충 시스템, 상기 영양소, 상기 지시 시약, 상기 선택제, 상기 환원제, 및 상기 제1 성분들 중 임의의 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 배양 장치.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 커버시트의 내부 표면에는 제2 접착제가 접착되어 있고;
    상기 성장 구획 내에 배치된 하나 이상의 제3 성분이 상기 제2 접착제에 접착되며;
    상기 제3 성분은 상기 겔화제, 상기 산소-포착 시약, 상기 완충 시스템, 상기 영양소, 상기 지시 시약, 상기 선택제, 상기 환원제, 및 상기 제3 성분들 중 임의의 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 배양 장치.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이산화탄소-발생 시약은 탄산의 염을 포함하는, 배양 장치.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산소-포착 시약은 제1철 또는 이의 염 또는 아스코르브산 또는 이의 염을 포함하는, 배양 장치.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산소-포착 시약은 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트의 표면적 10 ㎠당 약 1.5 마이크로몰 내지 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트의 표면적 10 ㎠당 약 15 마이크로몰의 양으로 상기 성장 구획 내에 배치되는, 배양 장치.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이산화탄소-발생 시약은 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트의 표면적 10 ㎠당 약 1 마이크로몰 내지 상기 성장 구획 내의 상기 기저부 또는 상기 커버시트의 표면적 10 ㎠당 약 15 마이크로몰의 양으로 상기 성장 구획 내에 배치되는, 배양 장치.
15. 샘플에서 미생물을 검출하는 방법으로서,
    제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 배양 장치를 개방하여 그 안의 상기 성장 구획에 대한 접근을 제공하는 단계;
    미리 정해진 부피의 수성 액체를 상기 성장 구획 내로 넣는 단계;
    샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계;
    상기 배양 장치를 폐쇄하는 단계 -
    상기 수성 액체 및 상기 샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계 및 상기 배양 장치를 폐쇄하는 단계는 상기 배양 장치의 기저부, 커버시트, 및 스페이서에 의해 에워싸인 반고체 미생물 배양 배지를 형성하는 단계를 포함하고; 상기 배양 배지는 pH가 4.0 내지 6.35임 -;
    상기 배양 배지 내에서의 미생물 콜로니의 형성을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 상기 배양 장치를 인큐베이션하는 단계; 및
    상기 미생물 콜로니를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 미리 정해진 부피를 상기 성장 구획 내로 넣는 단계는 상기 샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계를 동시에 포함하는, 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 미리 정해진 부피를 상기 성장 구획 내로 넣는 단계는 상기 샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계를 동시에 포함하지 않는, 방법.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플을 상기 성장 구획 내로 넣는 단계는 첨가제를 상기 성장 구획 내로 넣는 단계를 포함하며, 상기 첨가제는 미생물 성장을 검출하기 위한 유효량의 선택제 또는 지시약을 포함하는, 방법.
19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 장치를 일정 기간 동안 인큐베이션하는 단계는 상기 배양 장치를 호기성 분위기에서 상기 일정 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법.
20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물 콜로니를 검출하는 단계는 상기 성장 구획 내의 상기 콜로니 부근의 가스 버블을 광학적으로 검출하는 단계를 포함하는, 방법.

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