CN104928217B - 一株热噬地芽胞杆菌及其在压力蒸汽灭菌中的应用 - Google Patents

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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Abstract

本发明公开了一株热噬地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans）CICC 10853，该菌株2015年01月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.10391。该菌株在含1~5 mg/L Mn2+的R2A固体培养基上，经55~60℃培养6~10 d，可形成90%以上的芽胞，收集芽胞，得到浓度为107~108 CFU/mL芽胞悬液。使用压力蒸汽灭菌生物指示剂抗力检测器，采用LSKP方法测定0.1 mL、浓度为106~107 CFU/mL的芽胞悬液在121℃压力蒸汽灭菌条件下D值≥1.5 min。该菌株芽胞耐热性强，可作为消毒灭菌指标菌，提供灭菌参数、监测灭菌效果，在压力蒸汽灭菌的应用方面具有重要价值。

Description

一株热噬地芽胞杆菌及其在压力蒸汽灭菌中的应用
技术领域
本发明涉及一株热噬地芽胞杆菌CICC 10853，可作为消毒灭菌指标菌株，该菌株的芽胞耐热性强，应用于压力蒸汽灭菌生物指示剂中，可以有效监测压力蒸汽灭菌效果。该技术属于消毒灭菌生物指示剂领域。
背景技术
近年来食品、药品、医疗器械产品等的微生物污染问题日益严重，每年，世界各地都有因灭菌不彻底造成的感染事件的报道，极大地危害了人们的身体健康，严重影响食品、医药、卫生等行业的健康发展。因此，国内外对于灭菌监测都给予了极大地重视，并提出更高的灭菌要求。灭菌监测主要有物理监测、化学监测和生物监测三种形式，其中生物监测是通过使用的生物指示剂来考察微生物的杀灭情况，直接体现了整个灭菌过程是否达到需求，被认为是灭菌效果成功与否的最终判定。
生物指示剂是一种对特定的灭菌程序有确定和稳定的耐受性的特殊微生物制成品，通常采用细菌的芽胞制备而成。目前商品化的生物指示剂多为具有知识产权的国外产品，产品形式多样，如芽胞悬液、芽胞条、自含式生物指示剂等。
生物指示剂在中国药典、消毒技术规范和相关标准中都有明确规定，通常要求所用的微生物菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能污染微生物的耐受性。湿热灭菌法最常用的指标菌株为嗜热脂肪地芽胞杆菌（Geobacillus stearothermophilus）芽胞，推荐的菌株编号主要为美国ATCC 7953，或者ATCC 12980，要求在121℃饱和蒸汽条件下D值为1.3 ~1.9 min，D值越大则菌种的抗力或耐受性越强。
日益严重的微生物污染问题与某些热稳定性较低产品的灭菌要求相矛盾，迫切需要针对不同的产品使用不同耐受性的特殊微生物作为灭菌指标菌株，依据产品特性，进行新的灭菌工艺开发、灭菌工艺确认，最终确定该类产品的灭菌工艺，客观地反映微生物在该类产品的特定灭菌过程后的存活程度，即确保产品无菌又保证产品质量。
本发明筛选到一株热噬地芽胞杆菌CICC 10853，该菌株的芽胞耐热性强，可作为消毒灭菌指标菌株，不但可以应用于压力蒸汽灭菌监测，还能够应用于灭菌工艺开发中的关键参数设定、灭菌系统适应性实验、灭菌工艺变更控制环节等方面。本发明丰富了作为压力蒸汽灭菌生物指示剂的指标菌株，使得消毒灭菌监测手段更加完善，灭菌效果更加直观、有效，产品安全性更高。
发明内容
本发明目的是提供一株微生物菌株CICC 10853，分类学命名为热噬地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans），该菌株的芽胞耐热性更强，可作为压力蒸汽灭菌效果监测的指标菌株，提供灭菌参数、监测灭菌效果。本发明丰富了作为压力蒸汽灭菌生物指示剂的指标菌株，使得消毒灭菌监测手段更加完善，灭菌效果更加直观，有效提高产品安全性。
（1）本发明的目的之一是获得一株微生物菌株CICC 10853，该菌株的芽胞耐热性能强，该菌株已于2015年01月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10391。所述菌株为热噬地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans）。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
本发明的菌株是从斜面培养基中分离得到，具体筛选过程是将121℃灭菌20~40min的斜面培养基置于55~60℃培养1~3 d，挑取斜面培养基上长出的单菌落，分离划线至平板，在平板上连续划线3~5次进行筛选培养，直至获得单菌落纯培养物。
本发明的菌株的形态特征图片可见附图1、2、3、4，其描述为：在TSA培养基上菌落圆形、光滑、边缘整齐、黄色、不透明；菌体细胞杆状，单个或链状排列，革兰氏阳性，芽胞椭圆或柱状，端生或次端生，膨大明显。
本发明的菌株16S rDNA基因序列鉴SEQ ID №.1。
本发明的菌株16S rDNA基因序列比对的系统进化树构建结果见附图5。通过16SrDNA 基因序列比对，可以将该菌株确定为地芽胞杆菌属（Geobacillus）的菌株。
本发明的菌株recN基因序列见SEQ ID №.2。
本发明的菌株recN基因序列比对的系统进化树构建结果见附图6 。可以将该菌株确定为地芽胞杆菌属（Geobacillus）的菌株，且与火神地芽胞杆菌（Geobacillus vulcani）、立陶宛地芽胞杆菌（Geobacillus lituanicus）、热噬地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans）以及好热地芽胞杆菌（Geobacillus kaustophilus）聚为一支。
为了将本发明的菌株CICC 10853进一步与上述四株聚为一支的菌株进行鉴别，本发明采用《伯杰氏系统学分类手册》中生理生化实验，进行了温度梯度生长试验，NaCl浓度梯度生长试验，最终将菌株CICC 10853鉴定为热噬地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans）。
（2）本发明的菌株是从高温灭菌后的斜面培养基中分离得到，具有很强的耐热性能，作为灭菌指示用的生物指示剂通常采用细菌的芽胞制备而成，因此本发明还提供了菌株CICC 10853的芽胞悬液制备方法。具体步骤如下：
第一步：挑取一环斜面保藏的菌种CICC 10853，接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基中以活化菌种，于55~60℃，180~220 r/min，摇瓶培养24~48 h得到种子液。
第二步：将上述种子液均匀涂布于含有1~5mg/L Mn2+的R2A固体产芽胞培养基上，于55~60℃培养，培养3d后染色镜检观察，当芽胞生成率达90%以上时，停止培养收集芽胞，通常培养时间为6~10 d。
第三步：在无菌条件下，用无菌蒸馏水洗下菌苔，收集含有芽胞的菌液于离心管中，于3000 r/min离心30 min，弃上清收集芽胞，然后用无菌蒸馏水重新悬浮并离心，共处理3次，最后用少量无菌蒸馏水重新悬浮制成芽胞悬液。
第四步：芽胞悬液于95℃~100℃水浴处理15 min，然后迅速置0~4℃冰水浴冷却，经上述处理的芽胞悬液浓度可达107~108 CFU/mL芽胞悬液，于4℃保存备用。
第五步：芽胞悬液浓度测定。测定方法是取一定量芽胞悬液，使用无菌蒸馏水进行梯度稀释，采用平板倾注法进行菌落计数。具体步骤如下：
a. 将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加入9 mL无菌蒸馏水。各组由左向右，逐管标上10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、......等稀释度。
b. 将芽胞悬液样本用电动混匀器混合至少10 s，随即吸取 1 mL 加至 10-1 管内。
c. 将10-1管依前法用电动混匀器混合至少10 s，随即吸取出1 mL 加入 10-2 管内，如此类推，直至最后一管。
d. 选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为 30 CFU～300 CFU者为宜），用电动混匀器混合至少10 s，立即吸取1 mL加于无菌平皿内。每一稀释度接种2～3个平皿。一般需接种2～3个不同稀释度。
e. 将45℃～55℃熔化的TSA培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15 mL～20 mL。
f. 将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，待琼脂凝固后，翻转平皿使底向上，置55~60℃恒温培养箱内培养。
g. 培养24~48 h，计数每个平皿菌落数，同一稀释度取2~3个平皿的平均值（以生长菌落数每平皿为30 CFU～300 CFU者计），根据稀释度计算芽胞悬液浓度，以CFU/mL表示。
（3）本发明还提供了菌株CICC 10853芽胞悬液的D值测定方法，以评价菌株CICC10853耐热性能。不同介质、不同载体、不同仪器等条件下，D值测定结果会有偏差。本发明的D值测定是使用浓度为106~107 CFU/mL的芽胞悬液，将装有0.1 mL该浓度芽胞悬液的冻存管，放入压力蒸汽灭菌生物指示剂抗力检测器中，参照GB/T 19972-2005/ISO 14161:2000中LSKP方法进行测定，具体步骤如下：
第一步：参数设定，暴露条件为121℃蒸汽，每次暴露时间点的样品数为20个，每一暴露时间点的时间间隔固定为1 min~2 min。取7~10个暴露时间点。
第二步：将浓度为106~107 CFU/mL芽胞悬液充分振荡5~10 min，使成均匀的悬浮液，在无菌条件下打开盖，取0.1 mL加入到冻存管中，每支冻存管中含0.1mL芽胞悬液，芽胞数量为105~106 CFU/支，共20个冻存管样本。
第三步：将20个样本的冻存管盖旋松后置于样本容器中，按照压力蒸汽灭菌生物指示剂抗力检测器操作说明，进行121℃蒸汽灭菌处理，暴露时间为设置的第一个时间点。
第四步：暴露完毕，取出样本，向每个样本中加入0.9 mL溴甲酚紫蛋白胨水溶液，共20个，然后旋紧冻存管盖，置于55~60℃培养，该步骤应在2 h内完成。
第五步：完成上述第一个暴露时间点后，再按照第二步至第四步进行第二个时间点暴露。之后各个暴露时间点操作与此相同。
第六步：取一支含0.1 mL芽胞悬液和0.9 mL溴甲酚紫蛋白胨水溶液的冻存管，不经过暴露，直接置于55~60℃培养，作为阳性对照管。另取一支仅含1.0 mL溴甲酚紫蛋白胨水溶液的冻存管，不做任何处理，作为阴性对照管同时进行培养。
第七步：结果观察，上述7~10个暴露时间点的所有样品经过24~48 h培养后，培养基颜色由紫红色变为黄色，说明指示剂呈阳性，为培养后有菌样本数；培养基不变色仍为紫红色的，说明指示剂呈阴性，为培养后无菌样本数。记录阴性样本数量。
第八步：D值计算，LSKP法的计算公式如下：
a. 直至无菌的平均暴露（U sk）计算公式
U 1——无一个样品为阴性的最长暴露时间。
U k——显示全部样品无菌的最初的暴露时间。
i——暴露的时间。
d——暴露的时间间隔
n——每次暴露时的样品数目。
rk——每次暴露达到无菌样本数目
b. D值计算公式
N 0——通过全部活菌计数测得的每个生物指示剂上的平均活芽胞数
c. U sk的方差 （V）和标准差 （SD）
d. D值的上下可信区间计算公式：
本发明的菌株CICC 10853在121℃压力蒸汽灭菌条件下D值≥1.5 min。结果表明该菌株对于高温具有很强的耐受性，芽胞抗性强，可用于压力蒸汽灭菌监测，还能够应用于灭菌工艺开发中的关键参数设定、灭菌系统适应性实验、灭菌工艺变更控制环节等方面。
本发明的有益效果是，提供了一株微生物菌株CICC 10853，分类学命名为热噬地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans），该菌株的芽胞耐热性更强，可作为压力蒸汽灭菌效果监测的指标菌株，提供灭菌参数、监测灭菌效果。本发明丰富了作为压力蒸汽灭菌生物指示剂的指标菌株，使得消毒灭菌监测手段更加完善，灭菌效果更加直观，有效提高产品安全性。
附图说明
图1是本发明的菌株CICC 10853的菌落形态照片。
图2是本发明的菌株CICC 10853的芽胞染色照片。
图3是本发明的菌株CICC 10853的革兰氏染色照片。
图4是本发明的菌株CICC 10853的扫描电镜照片。
图5是本发明的菌株CICC 10853的16S rDNA基因序列系统进化树。
图6是本发明的菌株CICC 10853的recN基因序列系统进化树。
具体实施方式
下面通过具体实施例，结合附图对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
实施例一：菌株CICC 10853 的分离筛选与鉴定
（1）菌株CICC 10853 的分离筛选
将121℃灭菌40 min的斜面培养基置于56℃培养3 d，挑取斜面培养基上长出的单菌落，分离划线至平板，在平板上连续划线3次进行筛选培养，直至获得单菌落纯培养物。
（2）菌株CICC 10853 的鉴定
第一步：菌体富集。将新培养的斜面菌种CICC 10853用接种环接种至胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，培养基置于56℃摇床，220 r/min转速摇瓶培养24 h 。取1.5 mL培养之后的种子液，加入1.5 mL离心管中，用高速离心机以8000 r/min转速离心1min，弃上清液收集菌体。
第二步：基因组DNA提取。用200 μL无菌超纯水悬浮菌体之后，加入10 μL溶菌酶处理40 min以上。使用CTAB法提取细菌基因组DNA，具体步骤如下：加入1.5 mL TE离心洗涤后，用567 μL TE溶解菌体，混匀。加入30 μL 10 % SDS和3 μL 20 mg/ml的蛋白酶K（100 μg/mL），混匀，于37℃温育1 h。加入100 μL 5 mol/L NaCl，充分混匀，再加入80 μL CTAB/NaCl，混匀，65℃温育10 min。加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）（0.8 mL），混匀，12000 r/min离心5 min，保留上清。上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）（0.8 mL），混匀，12000 r/min离心5 min，保留上清。加入0.6倍的异丙醇（0.48 mL），轻轻混合直到DNA沉淀下来（0.5 h），12000 r/min离心15 min，收集DNA沉淀，用75%乙醇（1 mL）12000 r/min离心5min洗涤DNA沉淀，真空干燥0.5 h。用50 μL双蒸水溶解DNA，加入终浓度为20 μg/mlRNaseA，4℃保存。用0.6%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA ，每孔点样6 μL（4 μL样品+ 2 μLloading buffer），80 V，电泳1.5 h。若条带清晰且片段均一致，则基因组DNA提取成功，否则，进一步提取基因组DNA。
第三步：16S rDNA基因序列的扩增与比对。16S rDNA基因序列扩增使用的引物为27F和1541R，其序列如下：正向引物27F（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）；反向引物1541R（5’-AAG GAG GTG ATC CAC CC-3’）。使用的扩增条件为（94℃ for 5 min；94℃ for1 min；55℃ for 1 min；72℃ for 1 min 30 s；35 cycle； 72℃ for 10 min； 4℃save）。扩增片段由测序公司进行测序，得到的基因片段使用Nucleotide BLAST进行比对，并用mega 5.0软件进行系统发育树的构建。系统进化树构建结果见附图5。通过16S rDNA基因序列比对，可以将该菌株确定为地芽胞杆菌属（Geobacillus）的菌株。
第四步：recN 基因序列的扩增与比对。recN 基因序列扩增使用的引物为：正向引物F1-2（5’-CGA TTT GCG GGC GAC GAT AC-3’）；反向引物R1（5’-TAC ACC ATG CAA AAACGG TTA C-3’）。使用的扩增条件为（94℃ for 5 min； 94℃ for 1 min； 50℃ for 1min； 72℃ for 1 min 30 s； 35cycle； 72℃ for 10 min； 4℃ save.）。扩增片段由测序公司进行测序，得到的基因片段使用Nucleotide BLAST进行比对，并用mega 5.0软件进行系统发育树的构建。系统进化树构建结果见附图6。可将该菌株确定为地芽胞杆菌属（Geobacillus）的菌株。
第五步：生长实验。主要设计两组，一组NaCl浓度梯度生长实验（1 %、2 %、3 %、4%、5 %五个浓度梯度），另一组是温度梯度生长实验（35℃、40℃、45℃、70℃、75℃五个温度梯度）。实验结果见下表：
表1 NaCl浓度梯度生长实验结果
注：表1中的“+”代表生长，“-”代表未生长。
表2 温度梯度生长实验结果
注：表2中的“+”代表生长，“-”代表未生长。
第六步：结论。通过分子生物学鉴定，结合生理生化的生长实验结果，依据《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》（第二版）中的描述，将菌株CICC 10853鉴定为热噬地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans）。
实施例二：菌株CICC 10853芽胞悬液的制备
（1）本实施例按照如下步骤制备芽胞悬液。
第一步：将斜面保藏菌种接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，56℃，220 r/min，摇瓶培养48 h，获得种子液。
第二步：将上述种子液均匀涂布于分别含有1 mg/L、3 mg/L、5 mg/L、10 mg/L Mn2+的R2A固体产芽胞培养基以及不含Mn2+的R2A固体产芽胞培养基中，于56℃培养6 d~10 d，芽胞染色显微镜观察芽胞形成率是否大于90%以上，若高于90%以上，则进行下步操作。
第三步：用无菌超纯水作为芽胞悬液的悬浮介质，使用无菌棉签洗下菌苔，制成悬液。
第四步：3000 r/min离心30 min收集芽胞，然后用无菌超纯水重新悬浮，共处理3次，最后用一定量无菌超纯水重新悬浮。
第五步：芽胞悬液于95℃~100℃水浴处理15 min，以杀灭残余菌体，然后迅速冷却，得到纯净的芽胞悬液。
第六步：使用梯度稀释、倾注平板的方法进行芽胞悬液的浓度测定，计数培养基使用TSA培养基，56℃培养48 h。
第七步：芽胞悬液密闭于4℃保存备用。
（2）本实施例的结果如下。
表3 CICC 10853芽胞悬液制备结果
从上述结果可以看出，该菌株在不含Mn2+、或10 mg/L Mn2+的R2A固体培养基上，芽胞形成率都低于90%，培养时间即使再延长，其芽胞形成率都不再增加，而在含1~5 mg/LMn2+的R2A固体培养基上，芽胞形成率都大于90%，且制备的芽胞悬液浓度可达到107~108 CFU/mL。
实施例三：菌株CICC 10853芽胞悬液的抗性评价
（1）本实施例通过梯度稀释和平板计数，使芽胞悬液浓度在106~107 CFU/mL范围内，然后按如下步骤进行抗力测定：
第一步：参数设定，暴露条件为121℃蒸汽，每次暴露时间点的样品数为20个，每个暴露时间间隔固定为2 min。取9个暴露时间点。
第二步：将浓度在106~107 CFU/mL芽胞悬液充分振荡7 min，使成均匀的悬浮液，在无菌条件下打开盖，取0.1 mL加入到冻存管中，每支冻存管中含0.1mL芽胞悬液，共20个冻存管样本。
第三步：将20个样本的冻存管盖旋松后置于样本容器中，按照压力蒸汽灭菌生物指示剂抗力检测器操作说明，进行121℃蒸汽灭菌处理，暴露时间为设置的第一个时间点。
第四步：暴露完毕，取出样本，向每个样本中加入0.9 mL溴甲酚紫蛋白胨水溶液，共20个，然后旋紧冻存管盖，置于56℃培养，该步骤1 h内完成。
第五步：完成上述第一个暴露时间点后，再按照第二步至第四步进行第二个时间点暴露。之后各个暴露时间点操作与此相同。
第六步：取一支含0.1 mL芽胞悬液和0.9 mL溴甲酚紫蛋白胨水溶液的冻存管，不经过暴露，直接置于56℃培养，作为阳性对照管。另取一支仅含1.0 mL溴甲酚紫蛋白胨水溶液的冻存管，不做任何处理，作为阴性对照管同时进行培养。
第七步：上述9个暴露时间点的所有样品经过48 h培养后，培养基颜色由紫红色变为黄色，说明指示剂呈阳性，为培养后有菌样本数；培养基不变色仍为紫红色的，说明指示剂呈阴性，记录阴性样本数量，即为培养后无菌样本数。
（2）本实施例结果如下。
表4 暴露时间点与阴性样本数量统计结果
表5 两次测定的D值计算结果
测定次数 芽胞数量（CFU/支） D值（min） D值上下可信区间
1 3.0×106 1.52 1.43~1.60
2 2.5×106 1.59 1.50~1.69
从两次测定的D值结果可以看出，菌株CICC 10853芽胞悬液在121℃压力蒸汽灭菌条件下D值≥1.5 min。表明其芽胞耐热性强，该菌株可作为消毒灭菌指标菌，用于提供灭菌参数、监测灭菌效果，在压力蒸汽灭菌的应用方面具有重要价值。
<110> 中国食品发酵工业研究院
<120> 一株热噬地芽胞杆菌及其在压力蒸汽灭菌中的应用
<130> 20150624
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 881
<212> DNA
<213> 热噬地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans）
<400> 1
tccttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga gggtcattgg aaactggggg 60
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ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatgggcg 660
gtacaaaggg ctgcgaaccc gcgaggggga gcgaatccca aaaagccgct ctcagttcgg 720
attgcaggct gcaactcgcc tgcatgaagc cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg 780
ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagcttgca 840
acacccgaag tcggtgaggc aacccgcaag ggagccagcc g 881
<210> 2
<211> 923
<212> DNA
<213> 热噬地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans）
<400> 2
gtccgaccag ctattgtcca tgctctagtc gagggccgga ccagcttccg ctctgcgttc 60
aaggacggaa cgacgggggc ggtcctcgct tgcgaattcg aacatatgtg ctataatcag 120
aaaggagaat caatcggaca ggcaaggagt gatgaaatgc tcgccgagct gtcgattaaa 180
aatttcgcca ttatcgagtc gctctcgttg tcgttcgaca aagggctgac ggtgttaacc 240
ggcgaaacgg gagccggcaa atcgatcatc atcgacgcga ttcatttgtt gatcggcgga 300
cgcggctctg ctgaatttgt ccgcttcgga gcagaaaagg cggaaatcga agggctgttt 360
ttgcttgatg atgaccgcca tccgtgctgg caaaaatgcg cagacgttgg catcgacgcc 420
agcgacggca tgatcgtgtt gcgccgcgat attttcgcca acggcaaaag cgtctgccgc 480
attaacggca agctcgtcac gacggcggtg ctgcgcgaca tcggggcgac gcttgttgat 540
attcacggcc agcatgaaca tcaagaactg atggatccgt cccgccatct gccgctttta 600
gacgagttcg gcggcctaga ggcggcagag gcgcttgctc gctaccgcgc cgtctacgag 660
cggtatgagg agctcggaaa caaattgaaa aagctgagcg aaaatgaaca gcaaatggcg 720
catcggctcg atttgctgac gtttcagctg cgcgaaatcg agcagcggcg ctcgagccgg 780
gcgaggacga gcggctgatg gaggaaaaag ttcgcatcgt caattttcaa aaaatttata 840
ccgcgctgca gaaaagctat gaggccctct ccggagaggg acgcgggctt gattccatcg 900
gggaggcgat gcgccatctc gat 923

Claims (4)

1.一株热噬地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans）CICC 10853，2015年01月22日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.10391。
2.如权利 要求1所述的热噬地芽胞杆菌CICC 10853的应用，其特征在于：可作为消毒灭菌指标菌株，应用于压力蒸汽灭菌参数确定、灭菌效果监测方面。
3.如权利 要求2所述的热噬地芽胞杆菌CICC 10853的应用，其特征在于：该菌株在含1~5 mg/L Mn2+的R2A固体培养基上，经55~60℃培养6~10 d，可形成90%以上的芽胞，收集芽胞，可得到浓度为107~108 CFU/mL芽胞悬液。
4.如权利 要求1所述的热噬地芽胞杆菌CICC 10853的芽胞悬液，其特征在于：将0.1mL、浓度为106~107 CFU/mL的芽胞悬液加入样品管中，采用LSKP方法测定其在121℃压力蒸汽灭菌条件下D值≥1.5 min，该菌株芽胞耐热性能强。
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Cloning, expression and applicability of thermo-alkali-stable xylanase of Geobacillus thermoleovorans in generating xylooligosaccharides from agro-residues;Digvijay Verma等;《Bioresource Technology》;20111221;第107卷(第2期);第333-338页 *
Molecular cloning and characterization of thermostable esterase and lipase from Geobacillus thermoleovorans YN isolated from desert soil in Egypt;Nadia A. Soliman 等;《Process Biochemistry》;20071231;第42卷(第7期);第1090-1100页 *
三种DNA指纹图谱技术在菌株分型中的应用;刘毅等;《生物技术通报》;20150623;第31卷(第6期);第82页左栏第2-3段 *

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