CN108410825A - 一种噬菌体鸡尾酒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种噬菌体鸡尾酒及其应用，该噬菌体组合物包括以下(1)～(4)中的四株分离自不同地区的青枯菌专性裂解性噬菌体：(1)噬菌体NJ‑P3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018099；(2)噬菌体NB‑P21，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018100；(3)噬菌体NC‑P34，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018101；(4)噬菌体NN‑P42，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018102；上述的噬菌体均于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Podoviridae phage。四株分离自不同地区的青枯菌专性裂解性噬菌体进行组合对青枯病的防治具有显著的协同增效作用。

Description

一种噬菌体鸡尾酒及其应用
技术领域
本发明属于环境友好型生防制剂，涉及噬菌体鸡尾酒(即噬菌体组合物)及其应用，专用于防治土传青枯病问题。
背景技术
土传青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种细菌性病害，目前在我国大部分地区都有发生，南方地区病情较重。目前科学家已从自然环境中分离筛选出大量青枯菌专性噬菌体，并研究它们应用效果和作用机制。由于噬菌体疗法大多数只考察了单一噬菌体的效果，而且抑病效果往往不稳定，噬菌体疗法还未得到广泛的认可和大面积推广。综合分析发现单一噬菌体疗法存在以下局限性：噬菌体具有高度的特异性，宿主范围窄，所以噬菌体往往只对某一型或几型的宿主细菌有效，而对其他菌株裂解效果很弱或无治疗作用。2)青枯菌基因组中的大质粒携带了有助于提高青枯菌致病及适应能力的基因簇或遗传岛。对于单一噬菌体侵染胁迫，青枯菌很容易进化适应形成抗性，甚至会诱导青枯菌致病性增加。3)噬菌体具有“原位适应性”，即噬菌体更容易侵染来自同一块土壤的细菌，而对来自其他土壤中的细菌感染力相对较弱，这制约噬菌体疗法的广泛的应用。
为提高噬菌体疗法在土传青枯病防控中的应用效果，我们利用分离自不同地区的4株青枯菌专性裂解性噬菌体构建了不同丰富度的噬菌体鸡尾酒，探究了噬菌体鸡尾酒在盆栽条件下抑制青枯菌入侵番茄根际的能力。
发明内容
针对土传青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum)种间遗传复杂、变异性强，单一噬菌体制剂防治效果不稳定的问题，提出利用来自环境中具有高效裂解作用的噬菌体构建噬菌体鸡尾酒(即噬菌体组合物)的防控方案，探究病原菌响应噬菌体多样性胁迫的机制，为开发高效稳定的噬菌体制剂提供理论和技术支撑。
本发明的另一目的在于提供上述噬菌体组合物在防治土传青枯病中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种用于防治土传青枯病的噬菌体组合物，该噬菌体组合物包括以下(1)～(4)中的四株分离自不同地区的青枯菌专性裂解性噬菌体：
(1)噬菌体NJ-P3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018099，分离自江苏南京(118°57'E,32°03'N)；
(2)噬菌体NB-P21，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018100，分离自浙江宁波 (121°67'E,29°91'N)；
(3)噬菌体NC-P34，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018101，分离自江西南昌 (115°51′E,28°41′N)；
(4)噬菌体NN-P42，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018102，分离自广西南宁 (108°21′E,22°49′N)；
上述的噬菌体均于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大 学)，分类命名为Podoviridae phage。
作为一种优选技术方案，上述的噬菌体组合物中各噬菌体所占的比例相同。
进一步优选的，该噬菌体组合物中噬菌体的总含量≥105PFU/mL。更进一步优选的，该噬菌体组合物中噬菌体的总含量为105～107PFU/mL。
上述的噬菌体组合物在防治土传青枯病或制备用于防治土传青枯病的生防制剂中的应用。
一种用于防治土传青枯病的生防制剂，该生防制剂包含上述的噬菌体组合物。
一种防治作物土传青枯病的方法，将上述的噬菌体组合物，或上述的噬菌体制剂接种到作物的植株根际，所述噬菌体组合物或噬菌体制剂的添加量为≥106PFU/g干土。
本发明的技术方案做出了如下研究：1)对4株青枯菌裂解性噬菌体进行基础生物学特性及基因组分析；2)利用室内微孔板实验检测噬菌体鸡尾酒抵御青枯菌入侵的能力；3)利用温室盆栽试验评价噬菌体鸡尾酒防控青枯病的能力，并通过分离根际青枯菌，检测其噬菌体抗性，分析噬菌体多样性效应的机制。
本发明的有益效果：
本专利提供了一种高效抑制青枯病的噬菌体鸡尾酒，并检测了其防控的效果。同时对噬菌体鸡尾酒发挥作用可能的机制进行了探索：噬菌体胁迫通过影响病原菌抗性和致病力的权衡从而抑制病害的发生。实验结果显示，四株分离自不同地区的青枯菌专性裂解性噬菌体进行组合对青枯病的防治具有显著的协同增效作用。
附图说明
图1为4株噬菌体在双层琼脂平板上形成噬菌斑。
图2为4株噬菌体基因的系统发育树。
图3为4株噬菌体基因图谱。
图4为4株噬菌体抑制青枯菌的能力。
图5为噬菌体鸡尾酒抵御青枯菌入侵能力。
其中，室内的抑菌效果(A)，盆栽实验番茄青枯病的发病率(B)和根际病原菌的数量 (C)以及噬菌体的数量(D)。
图6为噬菌体诱导青枯菌抗性进化(A)及其与致病性的关系(B)。
具体实施方式
(一)4株噬菌体的基本特性
1)噬菌体的形态
宿主细菌：青枯菌，本实验室从南京市麒麟镇发病番茄植株中分离获得的具有强致病力的青枯菌QL-Rs1115(Wei et al.2011)，简称RS。青枯菌培养使用NA培养基(葡萄糖10g、蛋白胨5g、酵母浸膏3g、酵母膏0.5g、去离子水1000mL，调节pH 7.2-7.4，115℃高压灭菌30min)。
4株供试的噬菌体分别分离自南京(NJ-P3)、宁波(NB-P21)、南昌(NC-P34)、南宁(NN-P42)。取0.5mL对数生长期的R.solanacearum菌液与6mL冷却至50℃左右的NA半固体培养基(NA培养基加入1％(g/100ml)琼脂)混匀，立即倒入已凝固的NA固体培养基(NA 培养基加入2％琼脂)平板上制成双层平板，待上层培养基凝固后将平板分区，分别点接30 μL的梯度稀释的噬菌体原液(106，107，108，109)，30℃倒置培养24h～48h，观察有无噬菌斑。如图1所示，4株噬菌体均为裂解性噬菌体，形成的噬菌斑均为圆形、透明、清晰。
分离的噬菌体均于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Podoviridae phage。噬菌体NJ-P3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018099；噬菌体NB- P21，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018100；噬菌体NC-P34，保藏编号为：CCTCC NO： M 2018101；噬菌体NN-P42，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018102。
2)噬菌体的基因组
利用试剂盒(λ噬菌体DNA提取试剂盒，Abigen)按操作步骤提取噬菌体基因组DNA，利用NanoDrop 2000超微量分光光度计(美国NanoDrop公司)检测基因组DNA的纯度和浓度，送至上海美吉生物公司进行测序。
测序结果表明4株噬菌体基因组大小分别为42.528kb、41.194kb、41.943kb、42.278kb， GC含量分别为62.26％、62.22％、61.99％、62.10％(表1)。将噬菌体的基因组序列与选定的一些标准噬菌体进行BLAST分析并构建系统发育树。如图2所示，我们分离的4株噬菌体中NN-P42与NB-P21，NC-P34YU NJ-P3的同源性很高，且4株噬菌体均属于有尾噬菌体目 (Caudovirales)，短尾噬菌体科(Podoviridae)。如图3所示，从基因图谱我们可以发现4株噬菌体编码蛋白的基因区域存在差异，GC含量和分布均有一定的差异。
表1 4株噬菌体的基因组大小
3)噬菌体的裂解能力
利用96微孔板检测供试的4株噬菌体的裂解活性。培养基：NA培养基；接种微生物：即接种活化的RS悬液(106CFU/mL)或噬菌体(105PFU/mL)；30℃，170r/min震荡培养；用酶标仪检测不同时期群落的OD600。结果如图4所示，不加噬菌体的处理病原菌能快速增长，而添加了噬菌体的处理在前期生长都受到了抑制，但这种抑制作用随时间的延长逐渐减弱。可能是在长期相互作用过程中，病原菌对噬菌体产生抗性突变，导致噬菌体的侵染能力下降。这也说明了单一噬菌体作用的时效性和不稳定性。
(二)噬菌体鸡尾酒抵御青枯菌入侵的室内研究
噬菌体鸡尾酒(即噬菌体组合物)的构建：首先是将上述研究背景相对清楚的4株噬菌体进行组合，形成不同噬菌体丰富度的群落，如表2所示，共16个处理。
首先我们利用室内微孔板实验检测不同丰富度的噬菌体鸡尾酒抵御青枯菌入侵的能力。培养基：1/2NA培养基，病原菌和噬菌体的接种量分别为106CFU/mL和105PFU/mL。对不同的组合的噬菌体接种时先将4种噬菌体稀释到同一浓度梯度：107PFU/mL，按表2进行等体积混合，获得15个不同噬菌体组成的群落，按1％(v/v)接种到96孔板中，则体系中所有噬菌体总和的终浓度为105PFU/mL。每个处理3个重复。30℃，170r/min震荡培养72h，每隔 12h测定OD600。利用R语言将测得的OD600绘制病原菌生长曲线，并求得线下积分面积，用来表征不同噬菌体组合对青枯菌生长的影响。
培养72h后，我们检测了不同处理中噬菌体的数量。将共培养菌液用0.22μm滤膜过滤后即为噬菌体原液。取0.5mL对数生长期的RS菌液与6mL冷却至50℃左右的NA半固体培养基混匀，立即倒入已凝固的NA固体培养基平板上制成双层平板，待上层培养基凝固后将平板分区，分别点接50μL的梯度稀释的噬菌体原液，30℃培养24～48h，统计噬菌斑的数量即可得到噬菌体的数量。
如图5-A所示，噬菌体丰富度与青枯菌的生长呈显著负相关，即随着噬菌体组合丰富度的增加，对青枯菌的抑制能力增强。但不同处理中噬菌体的数量没有显著差异(图5-D)，说明噬菌体鸡尾酒抑菌效果增强不是噬菌体数量的增加导致。不同噬菌体组合的协同效应可能有其他机制。
表2噬菌体组合群落构成
(三)噬菌体鸡尾酒防控青枯病的效果
噬菌体鸡尾酒在室内能够提高抑菌能力，我们进一步利用盆栽实验检测噬菌体组合防控青枯病的效果。
在宜兴有机固体废弃物资源化协同创新中心的温室大棚考察噬菌体组合物防治番茄土传青枯病的效果。
供试土壤为没有青枯菌的水稻土。
番茄品种：Mcrio-Tom矮化品种，美国泛美种子公司生产，对青枯菌低抗，具有生长周期短、植株矮小等特点。
Micro-Tom番茄种子经表面消毒后：用70％的酒精浸泡1min，无菌水洗涤1次，用3％的 NaClO溶液浸泡5min，无菌水漂洗6次。将消毒好的种子放入垫有无菌去离子水浸湿滤纸的无菌平板中，30℃催芽两天。发芽的种子移植到育苗盘中(装有基质)。3-4叶期番茄苗移栽到盆钵中，1周后接种青枯菌，青枯菌的接种量浓度5.0×108cfu/g干土。接种青枯菌5天后接种不同噬菌体组合的悬液，噬菌体的总浓度5.0×107PFU/g干土(多噬菌体组合处理中每个噬菌体所占比例相同)。噬菌体组合物同上述微孔板实验。每个处理3个重复，每个重复8棵苗。接种结束后，记录番茄植株的生长状况，土壤保持一定的湿度，在番茄植株生长过程中如出现叶片发黄等营养不足的现象，适当添加MS基础培养基溶液(MS培养基用于植物组织培养，由青岛高科园海博生物技术有限公司生产，4.74g该产品溶于1L蒸馏水)补充营养。每隔1周记录一次番茄植株的发病情况，同时每周移动一次推车位置，减少光照等空间条件不同而导致的误差。5周后，番茄植株的发病率已基本趋于稳定，收苗采样。随机从各处理健康植株中采取三株，保存根际土壤样品，一部分用来提取土壤DNA，定量青枯菌的数量；一部分土壤样品通过稀释检测根际噬菌体的数量；一部分土壤样品用于青枯菌的分离。
根际青枯菌数量的检测：根际土用MO BIO的强力土壤DNA提取试剂盒(DNA Isolation Kit)提取DNA，检测DNA浓度和纯度。病原菌数量的测定采用SYBR Green荧光定量PCR的方法，使用Premix Ex TaqTM(宝生物工程有限公司，Takara)试剂盒。所用引物为采用劳尔氏菌的特异性引物，fliC F:5’-GAACGCCAACGGTGCGAACT-3’，fliC R:5’-GAACGCCAACGGTGCGA ACT-3’(Schonfeld et al.2003)(由南京金斯瑞生物有限公司合成)。噬菌体数量的测定同上述微孔板实验，双层琼脂平板法统计噬菌斑的数量。
如图5所示，盆栽防控效果与室内试验结果趋势一致，随着噬菌体丰富度的增加，番茄青枯病的发病率显著降低(图5-B)。与只接种青枯菌的处理相比，接种噬菌体能显著降低根际病原菌的数量，但不同噬菌体丰富度之间差异不显著(图5-C)。不同处理之间根际噬菌体的数量也没有显著差异(图5-D)。综合这些结果我们发现噬菌体鸡尾酒能够提高青枯病的防控效率，但这种多样性效应并不是病原菌数量降低或噬菌体数量增加导致的。
为了进一步研究噬菌体鸡尾酒抑菌的机制，我们检测了根际青枯菌对对噬菌体的抗性。首先从保存的根际土壤样品中分离青枯菌，制备土壤悬液，梯度稀释涂布在SMSA青枯菌选择性培养基(1L的NA培养基中依次加入1％TTC 50mg、结晶紫50mg、多粘菌素100mg、杆菌肽20mg、氯霉素5mg、放线菌酮50mg、青霉素0.5mg)上，30℃培养48h，每个处理每个重复随机挑取8个青枯菌的单菌落，加入到含200μL NA培养基的96孔板中培养，30℃，170rpm，培养24h后加入30％(v/v)甘油保存。
青枯菌抗性的检测：活化上述保存的青枯菌(108CFU/mL)，以1％接种到96孔板中(培养体系中青枯菌的浓度为106CFU/mL)，同时分别接种4株原始噬菌体(如上述噬菌体鸡尾酒抵御青枯菌入侵的室内研究所述，调整各处理中噬菌体的总浓度达到105PFU/mL)，以只接种病原菌的处理为对照。30℃，170rpm，培养24h，测得OD600。计算青枯菌对噬菌体的抗性：抗性＝1-(OD600a–OD600p)/OD600a，其中OD600a表示只接种病原菌的OD600， OD600p表示同时接种病原菌和噬菌体的OD600。每个青枯菌对4株原始噬菌体抗性的均值即为交互抗性(Cross-resistance)。如图6-A所示，随着噬菌体丰富度的增加，青枯菌的交互抗性增强，说明噬菌体会诱导病原菌产生抗性。但这种抗性并不是免费的，抗性的获得使病原菌的致病能力下降(图6-B)。这种抗性与致病能力之间的权衡可能是噬菌体鸡尾酒发挥作用的关键。
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Claims (7)

1.一种用于防治土传青枯病的噬菌体组合物，其特征在于，该噬菌体组合物包括以下(1)～(4)中的四株分离自不同地区的青枯菌专性裂解性噬菌体：
(1)噬菌体NJ-P3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018099；
(2)噬菌体NB-P21，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018100；
(3)噬菌体NC-P34，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018101；
(4)噬菌体NN-P42，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018102；
上述的噬菌体均于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Podoviridae phage。
2.根据权利要求1所述的用于防治土传青枯病的噬菌体组合物，其特征在于，所述的噬菌体组合物中各噬菌体所占的比例相同。
3.根据权利要求1或2所述的用于防治土传青枯病的噬菌体组合物，其特征在于，该噬菌体组合物中噬菌体的总含量≥105PFU/mL。
4.根据权利要求3所述的用于防治土传青枯病的噬菌体组合物，其特征在于，该噬菌体组合物中噬菌体的总含量为105～107PFU/mL。
5.权利要求1～4中任一所述的噬菌体组合物在防治土传青枯病或制备用于防治土传青枯病的生防制剂中的应用。
6.一种用于防治土传青枯病的生防制剂，其特征在于，该生防制剂包含权利要求1～4中任一所述的噬菌体组合物。
7.一种防治作物土传青枯病的方法，其特征在于将1～4中任一所述的噬菌体组合物，或权利要求6所述的噬菌体制剂接种到作物的植株根际，所述噬菌体组合物或噬菌体制剂的添加量为≥106PFU/g干土。
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