CN102399703A

CN102399703A - 一种具杀线虫活性的木霉属真菌及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102399703A
Application number: CN2011103766165A
Authority: CN
Inventors: 廖金铃; 卓侃; 唐照磊
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2011-11-08
Filing date: 2011-11-23
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2031-11-23
Also published as: CN102399703B

Abstract

本发明公开了一种具杀线虫活性的木霉属真菌及其制备方法与应用。所述具杀线虫活性的木霉属真菌为绿木霉(Hypocrea virens H22)，于2011年9月2日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2011303。本发明提供了所述食线虫真菌的制备方法，包括液体培养法或固体培养法。本发明菌株对线虫具有良好的杀线虫活性，可应用于制备植物寄生线虫生防制剂，具有较好的应用前景。

Description

一种具杀线虫活性的木霉属真菌及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种杀线虫真菌及其制备方法与应用。

背景技术

植物寄生线虫是一类重要的病原微生物，分布广、种类多，全世界已报道的植物线虫有200多属5000余种，给农林业生产造成严重为害(冯志新，2001)。据估计全球每年由植物寄生线虫所造成的作物损失达780亿美元(Barker et al，1998)。就现今危害最为严重的线虫种类——根结线虫而言，其有着广泛的寄主，且为世界性分布，每年可给全球作物总产量造成10％以上的损失(Whitehead，1998)。

植物线虫具有隐蔽性、多寄主性、顽固性、易传播的特点，其种群增长迅速，给防治上带来了诸多的困难。自从20世纪40年代化学技术的革命后，化学杀虫剂被广泛用于农林业生产，并在害虫防治中占居重要地位，与此同时，由于人们长期过分依赖化学农药，且缺乏生态意识，造成了严重的环境污染。杀线虫剂多为高毒力高残留化学农药，这些药物对人畜不安全，对环境污染严重，并易使线虫产生抗药性，对有益生物杀伤力强。

随着人们环保意识的增强，对健康食品要求的日益增高，以往用于植物线虫防治的高毒农药多以法律的形式给予了禁用，人们将研究重点转向了生物防治。生物防治具有对人畜安全，对环境友好等优点，因此，生物防治方法在植物线虫病害的防治地位尤显重要。

目前木霉是多种植物病害包括根结线虫病的重要生防菌，绿木霉是重要的生防木霉之一，研究开发绿木霉对防治植物寄生线虫具有重要意义。目前关于绿木霉的相关技术报道有限，市场上无来源于木霉菌尤其是绿木霉菌的用于防治线虫的商品生防制剂，尚属技术空白。

发明内容

本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一株新的具有杀线虫功能的绿木霉真菌。

本发明的另一个目的是提供所述绿木霉的分离方法。

本发明的另一个目的是提供所述绿木霉的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述绿木霉的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供一株具杀线虫活性的绿木霉，本申请人从广东省深圳湾红树林根际土样中分离得到一株对线虫具有很好毒杀作用的绿木霉(Hypocrea virens H22，缩写为H.virens H22)，菌株于2011年9月2日保存于中国湖北武汉市武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2011303。

所述绿木霉菌株的分离方法为：在CMA平板上撒1.0g土样，接入约1000条南方根结线虫二龄幼虫，25℃培养3天(d)后，镜检并用针挑取死虫体上及其周围单个的真菌分生孢子于含硫酸链霉素50ppm的CMA平板上，纯化获得真菌；所述CMA培养基为：20g玉米粉，15g琼脂粉，1000ml水。

所述绿木霉(H.virens H22)的菌株形态特征为：在PDA上初期为白色，中期颜色逐渐变为浅绿色，有发达的气生菌丝，后期产生大量的分数孢子梗及分生孢子，分生孢子梗对生或互生分枝，分枝上可再分枝，分枝顶端为小梗，瓶状，由小梗生出分生孢子，分生孢子近球形，多个分生孢子粘聚成球形的孢子头。

本发明进一步对绿木霉进行分子鉴定，扩增靶标序列为ITS区，ITS序列如表SEQ ID NO：1所示。

本发明同时提供了所述绿木霉(Hypocrea virens H22)的制备方法，包括固体培养基培养或液体培养基培养方法。

所述固体培养基配方为：马铃薯琼脂培养基(PDA)：200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂粉，1000ml水；培养方法为将绿木霉(H.virens H22)菌丝体接种到PDA培养基上，用封口膜封口后于25～28℃下培养2～3天。

所述液体培养基配方为CMA培养液，配方为：玉米粉20g，蒸馏水1000mL。培养方法为在每个500mL三角瓶装200mL CMA培养液，121℃下湿热灭菌20min，冷却后每瓶接入5片活化后的绿木霉菌圆片，在180rmp27℃下暗培养8d后，在4℃条件下12000rmp离心10min得上清液。上清液可保存于4℃冰箱中待用。

本发明提供了所述绿木霉(H.virens H22)的应用，根据其对线虫的显著活性，提供其在杀灭植物寄生线虫方面的应用，并具体提供了杀线虫药剂试验结果。

根据所述应用，本发明进一步提供了所述绿木霉(H.virens H22)在制备植物寄生线虫生防制剂方面的应用。优选地，利用绿木霉(H.virensH22)的幼嫩孢子；优选的剂量范围是3×10⁷～3×10⁹个孢子/kg土壤。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一株新的绿木霉(H.virens H22)菌株，具有良好的杀线虫活性，可应用于制备杀线虫活性制剂，填补了本技术领域的技术不足，并进一步提供了所述绿木霉(H.virens H22)的分离和培养方法及应用，为生物防治线虫提供重要的技术基础。

附图说明

图1固体培养基培养绿木霉(H.virens H22)对全齿复活线虫的作用；

图2固体培养基培养绿木霉(H.virens H22)对松材线虫的作用；

图3固体培养基培养绿木霉(H.virens H22)对爪哇根结线虫的作用；

图4固体培养基培养绿木霉(H.virens H22)对南方根结线虫的作用；

图5绿木霉(H.virens H22)对南方根结线虫卵孵化的抑制率；

图6绿木霉(H.virens H22)液体培养液对南方根结线虫的作用；

图7绿木霉(H.virens H22)对南方根结线虫的效果的情况(防治效果)；

图8绿木霉(H.virens H22)不同的施菌量对番茄伸长生长的影响情况；

图9绿木霉(H.virens H22)不同的施菌量对番茄生物量的影响情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂原料均为常规市购产品。

实施例1绿木霉(H.virens H22)的分离和鉴定

培养基配方为CMA培养基：20g玉米粉，15g琼脂粉，1000ml水。

在培养基上撒1.0g土样(取自广东省深圳湾红树林根际)，接入约1000条南方根结线虫二龄幼虫(J2)，25℃培养3d后，镜检并用针挑取死虫体上及其周围单个的真菌分生孢子于含硫酸链霉素50ppm的CMA平板上，纯化获得真菌。

所述绿木霉(Hypocrea virens H22)的菌株形态特征为：在PDA上初期为白色，中期颜色逐渐变为浅绿色，有发达的气生菌丝，后期产生大量的分数孢子梗及分生孢子，分生孢子梗对生或互生分枝，分枝上可再分枝，分枝顶端为小梗，瓶状，由小梗生出分生孢子，分生孢子近球形，多个分生孢子粘聚成球形的孢子头。

本发明进一步对绿木霉进行了分子鉴定，扩增靶标序列为ITS区，通过以下实验步骤获得ITS序列如表SEQ ID NO：1所示。

(1)基因组DNA的提取

(a)用解剖刀刮取PDA平板上27℃培养3d的菌丝在液氮中研磨成粉状；将菌丝粉迅速放入1.5mL的液氮预冷离心管中，每管0.3g；

(b)用500μL DNA抽提缓冲液(100mM Tris-HCl，750mM NaCl，40Mm EDTA)悬浮步骤(a)离心管中的菌丝粉，并加入50μL 20％十二烷基硫酸钠(SDS)轻轻混合，37℃处理1hr；

(c)加入75μL的5M NaCl和65μL CTAB溶液(0.75M NaCl含10％CTAB)，65℃水浴20min；

(d)加入步骤(c)管中液体等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1，体积比)抽提，5000g离心10min，取上清；

(e)重复步骤d；

(f)加2μL RNase(10mg/mL)37℃处理30min；

(g)加入与步骤(f)管中液体等体积的异丙醇混匀，5000g，离心10min沉淀DNA；

(h)用0.5mL体积比浓度为70％的酒精洗涤沉淀，离心2min，倒掉酒精，风干；

(i)加入30μL TE(10mM Tris-HCl，1Mm EDTA，pH8.0)重新悬浮DNA；

(j)每个管中的样取2μL，Marker2000(Takara，日本)取5μL，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度。

(2)ITS区的PCR扩增

以菌株的基因组DNA为模板，用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增ITS区的片段。所述ITS1和ITS4的核苷酸序列如下：

ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；

反应体系：模板1μL；10×缓冲液2.5μL；4×dNTP 0.5μL；引物ITS11μL；引物ITS41μL；酶0.25μL；水18.75μL。以不加模板为阴性对照。

反应程序：94℃ 5min；94℃ 30sec→55℃ 30sec→72℃ 1min，35个循环；72℃ 2min；4℃∞。

PCR产物切胶回收，连接到pMD-18T载体，然后转化克隆，送交上海博尚生物技术有限公司测序。

(3)序列分析

序列分析的结果通过国际互联网进行序列同源性检索，检索主程序采用BLASTN，即核酸序列对核酸序列数据库的检索，序列分析采用DNAStar软件进行。

比对结果发现与该菌同源性最高的均为绿木霉(HQ608079，JF439516，GU111539，HQ229950和HQ229948)真菌，同源性均超过99％，进一步表明本发明所述菌为绿木霉菌。

实施例2绿木霉(H.virens H22)的固体培养

培养基配方为马铃薯琼脂培养基(PDA培养基)：200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂粉，1000mL水；

在每个90mm的培养皿中倒入约占培养皿高度1/3厚的PDA培养基，将绿木霉(H.virens H22)菌丝体接种到PDA培养基上，用封口膜封口后于25～28℃下培养2～3天。将菌种保存于4℃冰箱中待用，或直接配备孢子培养液使用。

实施例3绿木霉(H.virens H22)的液体培养

培养基配方为CMA培养液：玉米粉20g，蒸馏水1000mL。

每个500mL三角瓶装200mL CMA培养液，121℃下湿热灭菌20min，冷却后每瓶接入5片活化后的绿木霉菌圆片，在180rmp 27℃下暗培养8d后，在4℃条件下12000rmp离心10min得上清液，上清液保存于4℃冰箱中待用。

实施例4绿木霉(H.virens H22)杀线虫活性试验

1、制备试验用线虫

(1)制备全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)

将全齿复活线虫(来自中国科学院微生物研究所，也可以采用本领域实验室使用的同类线虫)接种于燕麦片培养基(组成：10g燕麦片，30ml水)上，25℃下培养6天左右，置于4℃冰箱备用。使用前将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml离心管内加入无菌水，瞬时离心，弃上清，重复3次得到洁净供试线虫。

(2)制备松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)

在倒入1/3厚PDA培养基的培养皿中接入拟盘多毛孢(Pestalotiopsissp.)(华南农业大学植物线虫研究室保存，也可以采用本领域实验室使用的同类线虫)，25℃培养4～7天。待菌丝铺满培养皿后，接种松材线虫，25℃培养5～8天。用无菌水将线虫冲洗，制成含量为2条/μl的线虫悬浮液。

(3)制备爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)卵及二龄幼虫

取爪哇根结线虫(本实施例采用的爪哇根结线虫采自云南昆明，单卵块纯化后保存于华南农业大学植物线虫研究室，也可以采用本领域实验室使用的同类线虫)的单卵块接种至预先在消毒土壤中培育2周的感病番茄或马铃薯植株上，约45d后，将根拔起用自来水洗净，于解剖镜下挑取根上卵块，其中1/2卵块放入带盖的10mL离心管中，加入5mL 0.5％NaClO，用力振荡3min，迅速通过双层筛，上层筛孔径为250μm，下层筛孔径为38μm，然后用无菌水收集冲洗下层筛中的卵粒；剩余1/2的卵块置于双层网筛(铁丝网和滤纸)上，网筛浸于加有灭菌水的灭菌培养皿内，25℃孵化3天收集已孵化的二龄幼虫。

(4)制备南方根结线虫(Meloidogyne incognita)卵及二龄幼虫

南方根结线虫采自广东广州，单卵块纯化后保存于华南农业大学植物线虫研究室，卵及二龄幼虫的获得方法同爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)卵及二龄幼虫的制备方法。

2、试验方法

(1)固体培养基培养绿木霉(H.virens H22)对全齿复活线虫(Pnanagrellus redivivus)的生测试验

参照实施例2，将绿木霉(H.virens H22)用PDA平板活化生长3d后，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘打取生长一致的菌丝块，接种到直径为90mm含约20ml PDA培养基的培养皿中央，27.5℃下，12h光照-12h黑暗交替培养2d，在每皿菌落边缘加入无菌水配制的全齿复活线虫液10μl(约200条虫)，然后在27.5℃的恒温箱中培养，分别于接虫后24h、48h和72h在倒置显微镜下观察记录死亡线虫数和线虫总数。在PDA培养基平板上接入相当数量的线虫做为对照。每个处理3个重复。根据以下公式计算线虫的死亡率和校正死亡率，三个重复求平均：

虫液密度的确定：收集活跃的全齿复活线虫(P.redivivus)，用0.1％次氯酸钠溶液消毒3min，用无菌水漂洗3次(4000rpm/min离心3min，吸走上清液，再加入无菌水漂洗)，然后再4000rpm/min离心3min收集线虫于玻璃广口瓶中，吸取10ul显微镜下观察，计数三次。计算虫的实际数量密度后，测量实际总体积数，再用灭菌水进行稀释至20000条/mL。

(2)固体培养基培养绿木霉(H.virens H22)对松材线虫的生测试验

生测试验方法同固体培养基培养绿木霉(H.virens H22)对全齿复活线虫(Pnanagrellus redivivus)的生测试验。

(3)固体培养基培养绿木霉(H.virens H22)对爪哇根结线虫的生测试验

(4)固体培养基培养绿木霉(H.virens H22)对南方根结线虫的生测试验

(5)绿木霉(H.virens H22)对南方根结线虫卵孵化的抑制试验

参照实施例3，在直径为9cm的玉米粉培养基平板上接入1ml绿木霉(H.virens H22)液体培养上清液，均匀涂布于平板上，再接入约200粒南方根结线虫卵粒，放于25℃培养箱种培养5～7d后，检查卵的孵化率。对照平板中加入1ml无菌水和卵粒。每个处理3次重复。根据以下公式计算线虫卵孵化的抑制率和校正抑制率，三个重复求平均：

(6)绿木霉(H.virens H22)液体培养液对南方根结线虫的作用效果

参照实施例3，取290μl绿木霉(H.virens H22)液体培养上清液于24孔生化培养板小孔中，加入10μl线虫悬浮液(约200条线虫)，空白对照加入300μl的无菌水。分别于处理24h，48h和72h后观察记录南方根结线虫J2的存活数量和死亡数量，计算死亡率和校正死亡率。每个处理均设置3个重复。计算公式同固体培养基培养绿木霉(H.virens H22)对全齿复活线虫(Pnanagrellus redivivus)的生测试验所述的计算公式。

(7)对南方根结线虫的盆栽试验

绿木霉(H.virens H22)用PDA培养基平板扩大培养5d后刮取分生孢子，用无菌水分别把每个菌株的孢子液稀释成不同浓度梯度的孢子悬浮液(10¹⁰cfu/ml、10⁸cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁴cfu/ml和10²cfu/ml)。

孢子的计数方法为：每个菌株取三皿，各加入含有0.1％吐温80无菌水8mL，用玻璃棒轻轻推动，使孢子脱离菌丝。将孢子悬浮液悬浮均匀，取2μL用血球计数板在10×10x显微镜下计数，每个皿计数3次。三个皿计数的平均值乘以4000既为每个皿的实际孢子量。

番茄苗的培养：播种前，先将番茄种子用50～55℃水浴30min，以钝化种子携带的病毒，静置浸泡8hr；浸种后将种子略晾一下，用湿布包好，室温下催芽。催芽期间每天用清水淘洗1次，防止发霉。种子发芽后，先将育苗土浇足水，将土层上表面整平，将发芽的种子均匀散布于上，播后覆土1～1.5cm。育苗土为基质土(组成：菜园土∶有机肥∶碧糠灰的体积比＝5∶2∶3)经121℃灭菌2hr。

每个花盆放入灭菌混合土(机质土与沙土按照体积比3∶1混合)1kg，每盆种植3棵2片真叶的番茄苗，3d后，每盆接入30ml孢子悬浮液，浇少量无菌水保湿，在温室中培养7d后，在每株番茄苗根围接入约500条南方根结线虫J2。番茄苗在温室中生长45d后，拔出番茄苗，统计根结数及测量每株番茄株高，鲜重，根重。每个菌株设置5个孢子液施用浓度，每个浓度3个重复。对照用无菌水代替孢子液。根据以下公式计算相对防效：

相对防效＝(对照根结数-处理每株根根结数)×100％/对照根结数菌量对番茄伸长生长的影响：

将处理的番茄植株，用毫米刻度尺测量株高。

株高：从番茄最上生侧根的点到心叶尖的距离；

对每个处理的株高和根长应用DPS中Duncan新复极差法进行数据分析。

菌量对番茄生物量的影响：

将处理的番茄植株，用电子天平称量地上重和地下重。

地上重：从番茄最上生侧根的点，将其切断，上面部分的重量；

地下重：从番茄最上生侧根的点，将其切断，下面部分的重量；

3、试验结果

(1)固体培养基培养绿木霉(H.virens H22)对全齿复活线虫的生测试验

在27.5℃条件下，接虫后24h、48h和72h，菌株对线虫均有致死作用，线虫校正死亡率分别为1.44％，55.71％和67.38％。结果见附图1，误差线为S.E；纵坐标为校正死亡率；横坐标为处理时间。结果表明固体培养48h后，菌株对全齿复活线虫有较好的杀死作用。

(2)固体培养基培养绿木霉(H.virens H22)对松材线虫的生测试验

在27.5℃条件下，接虫后24h、48h和72h，菌株对线虫均有致死作用，线虫校正死亡率分别为1.54％，83.48％和89.24％。结果见附图2，误差线为S.E；纵坐标为校正死亡率；横坐标为处理时间。

在27.5℃条件下，接虫后24h、48h和72h，菌株对线虫均有致死作用，线虫校正死亡率分别为2.44％，98.49％和100％。结果见附图3，误差线为S.E；纵坐标为校正死亡率；横坐标为处理时间。

在27.5℃条件下，接虫后24h、48h和72h，菌株对线虫均有致死作用，线虫校正死亡率分别为1.35％，92.15％和99.75％。结果见附图4，误差线为S.E；纵坐标为校正死亡率；横坐标为处理时间。

以上结果表明绿木霉(H.virens H22)在固体培养基上培养48小时后对各类线虫均有较好的杀死作用，杀线作用较广谱，其中对固着性内寄生线虫(爪哇根结线虫和南方根结线虫)效果最好；其次是对迁移性内寄生线虫(松材线虫)；虽然对自由生活线虫(全齿复活线虫)杀死作用较低，但24h后线虫相对死亡率也达到50％以上。

(5)绿木霉(H.virens H22)对南方根结线虫卵孵化的抑制试验

在25℃条件下，接卵后5d、6d和7d，卵孵化抑制率分别为95.82％，94.81％和92.95％。结果见附图5，误差线为S.E；纵坐标为校正抑制率；横坐标为处理时间。结果表明菌株对南方根结线虫卵孵化具有强的抑制作用。

(6)绿木霉(H.virens H22)液体培养液对南方根结线虫的作用效果

绿木霉(H.virens H22)液体培养液处理南方根结线虫24h，48h和72h后，线虫校正死亡率分别为83.77％，87.35％和94.29％。结果见附图6，误差线为S.E；纵坐标为校正死亡率；横坐标为处理时间。该结果表明绿木霉(H.virens H22)在液体培养基上培养24小时后对南方根结线虫既有较高的杀死效果。

(7)对南方根结线虫的盆栽试验

(a)绿木霉(H.virens H22)的不同施菌量对南方根结线虫的防效试验结果表明，施入土壤的菌量明显影响菌株对线虫的防治效果，在试验范围内，施菌量越多防效越好。当每kg土中施菌量分别为3×10³cfu、3×10⁵cfu、3×10⁷cfu、3×10⁹cfu和3×10¹¹cfu时，相对防效分别为55.14％、63.55％、77.57％、83.18％和85.98％，当施菌量为3×10⁹cfu和3×10¹¹cfu时，相对防效显著高于其他处理组，见附图7，A 3×10³cfu/kg；B 3×10⁵cfu/kg；C3×10⁷cfu/kg；D 3×10⁹cfu/kg；E 3×10¹¹cfu/kg；相同的字母表示在P＜0.05时，差异不显著，误差线为S.E；纵坐标为相对防效；横坐标为施菌量。

(b)对番茄伸长生长的影响：

不同的施菌量对番茄伸长生长的影响试验结果显示，加入不同菌量的各处理组株高与病土对照组相比均显著增高，明显好于病土对照组，而且随着施菌量的增多，株高也逐渐增高。在各处理组间，施菌量为3×10³cfu/kg时，其株高显著低于其他处理组，而在其他处理组间无显著差异，见附图8。附图8中CK为病土；A 3×10³cfu/kg；B 3×10⁵cfu/kg；C 3×10⁷cfu/kg；D 3×10⁹cfu/kg；E 3×10¹¹cfu/kg；相同的字母表示在P＜0.05时，差异不显著，误差线为S.E。纵坐标为株高；横坐标为施菌量。

(c)各个处理番茄生物量的影响

不同的施菌量对番茄生物量的影响试验结果显示，加入不同菌量的各处理组之间在生物量上显示出一定的差异。从地上重看，加入不同菌量的各处理组与病土对照组相比均显著提高，明显好于病土对照组，而且随着施菌量的增多，地上重也逐渐增加。在各处理组间，3×10⁹cfu/kg和3×10¹¹cfu/kg地上重显著高于其他处理组。从地下重看，当施菌量为3×10³cfu/kg时，地下重略轻于对照，其他处理组均略重于对照，但均无显著差异，且各处理组间也均无显著差异，见附图9。附图9中白色柱状图为地上重，黑色柱状图为地下重，CK为病土；A 3×10³cfu/kg；B 3×10⁵cfu/kg；C3×10⁷cfu/kg；D 3×10⁹cfu/kg；E 3×10¹¹cfu/kg；相同的字母表示在P＜0.05时，差异不显著，误差线为S.E。

以上实验结果说明绿木霉(H.virens H22)菌株对线虫的作用主要是通过分泌对线虫具有毒杀作用的代谢产物而实现的，且对多种不同的线虫均有较高的毒杀效果，表明具有较好的广谱性；盆栽试验表明该菌株对南方根结线虫侵染具有较好的抑制作用，增加菌量可以明显降低根结线虫南方根结线虫在寄主上的发病指数，且对作物没有明显的负面效果，表明绿木霉(H.virens H22)作为生防物的可应用和开发潜力巨大。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种具杀线虫活性的木霉属真菌及其制备方法与应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 576

<212> DNA

<213> 绿木霉（Hypocrea virens H22）ITS序列

<400> 1

ttaagtksak cgggtaytcc tacctgatcc gaggtcaaca tttcagaagt ttggggtgtt 60

taacggctgt ggacgcgccg cgctcccgat gcgagtgtgc aaactactgc gcaggagagg 120

ctgcggcgag accgccactg tatttcgggg ccggccccgt aaagggccga tccccaacgc 180

cgaccccccg gaggggttcg agggttgaaa tgacgctcgg acaggcatgc ccgccagaat 240

actggcgggc gcaatgtgcg ttcaaagatt cgatgattca ctgaattctg caattcacat 300

tacttatcgc atttcgctgc gttcttcatc gatgccagaa ccaagagatc cgttgttgaa 360

agttttgatt cattttcgaa acgcccacga ggggcgccga gatggctcag atagtaaaaa 420

acccgcgagg gggtatacaa taagagtttt ggttggtcct ccggcgggcg ccttggtccg 480

gggctgcgac gcacccgggg cagagatccc gccgaggcaa cagtttggta acgttcacat 540

tgggtttggg agttgtaaac tcgagymayg atccct 576

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物ITS1

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物ITS4

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一种具杀线虫活性的木霉属真菌绿木霉(Hypocrea virens H22)，于2011年9月2日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M 2011303。

2.根据权利要求1所述具杀线虫活性的木霉属真菌绿木霉H22菌株，其特征在于具有如表SEQ ID NO：1所示ITS序列。

3.一种权利要求1具杀线虫活性的木霉属真菌绿木霉的制备方法，其特征在于是将所述真菌的菌丝体接种到PDA培养基斜面上培养得到；所述PDA培养基组成为：200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂粉和1000ml水。

4.一种权利要求1所述具杀线虫活性的木霉属真菌绿木霉的制备方法，其特征是在于将所述真菌的圆片接种于液体培养液培养暗培养后离心得上清液；所述液体培养液为CMA培养液组成为玉米粉20g，蒸馏水1000mL。

5.一种权利要求1所述具杀线虫活性的木霉属真菌绿木霉的应用，其特征在于应用于防治植物寄生线虫。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于应用于杀灭固着性内寄生线虫或迁移性内寄生线虫。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于采用所述真菌的幼嫩孢子制备植物寄生线虫生防制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于是所述植物寄生线虫生防制剂的剂量范围是3×10⁷～3×10⁹个孢子/kg土壤。