CN107926987A - 一种防治松材线虫的生物农药及其制备方法 - Google Patents
一种防治松材线虫的生物农药及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107926987A CN107926987A CN201711262078.0A CN201711262078A CN107926987A CN 107926987 A CN107926987 A CN 107926987A CN 201711262078 A CN201711262078 A CN 201711262078A CN 107926987 A CN107926987 A CN 107926987A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- trichoderma
- butanol
- pulvis
- bursaphelenchus xylophilus
- liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000243771 Bursaphelenchus xylophilus Species 0.000 title claims abstract description 41
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 54
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims abstract description 41
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 30
- 241001149558 Trichoderma virens Species 0.000 claims abstract description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000002021 butanolic extract Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 35
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 25
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 16
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 16
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 14
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 8
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 8
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- SEGLCEQVOFDUPX-UHFFFAOYSA-N di-(2-ethylhexyl)phosphoric acid Chemical compound CCCCC(CC)COP(O)(=O)OCC(CC)CCCC SEGLCEQVOFDUPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 7
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 16
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 15
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 6
- 238000012549 training Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 3
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 3
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 3
- 241000935931 Diplodia sapinea Species 0.000 description 2
- 241000599030 Pythium debaryanum Species 0.000 description 2
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 2
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000001069 nematicidal effect Effects 0.000 description 2
- NFIYTPYOYDDLGO-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;sodium Chemical compound [Na].OP(O)(O)=O NFIYTPYOYDDLGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000223602 Alternaria alternata Species 0.000 description 1
- 241001085856 Cenangium ferruginosum Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 240000000950 Hippophae rhamnoides Species 0.000 description 1
- 235000003145 Hippophae rhamnoides Nutrition 0.000 description 1
- 235000005456 Pinus sylvestris var mongolica Nutrition 0.000 description 1
- 241000114025 Pinus sylvestris var. mongolica Species 0.000 description 1
- 241000813090 Rhizoctonia solani Species 0.000 description 1
- 241001345879 Valsa sordida Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001775 anti-pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000003090 pesticide formulation Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
- A01N25/12—Powders or granules
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种防治松材线虫的生物农药及其制备方法，以及其在防治松材线虫方面的应用。该农药的剂型为粉剂，该粉剂的活性成分为绿木霉（Trichoderma virens）T43发酵液正丁醇提取物，该粉剂是通过将发酵液过滤、离心，取上清液，加正丁醇混合萃取，弃水层，将正丁醇层蒸发浓缩得到的。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治松材线虫的生物农药，该农药提取于抑制松材线虫生防真菌—绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液中抑菌代谢产物，还涉及及其制备方法，尤其是涉及绿木霉(Trichoderma virens)T43液体发酵工艺流程和活性成分的分离提取方法，以及其在防治松材线虫方面的应用。
背景技术
松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)是松树的毁灭性病害，树木患病后死亡率极高，防治难度大，能造成相当严重的经济损失和非常重大的生态灾难，在林业经济和自然景观上有着很大的威胁，在世界各国有着头号植物检疫对象之称。对于防治松材线虫，历来以化学药剂为主，而化学药剂带来的负面影响，使得生物防治的研究成为热点。真菌农药具有毒性低，选择性强，高效低残留，对环境造成的危害低等特点。国内外研究表明绿木霉对多种病害具有抑制作用。说明绿木霉T43在液体发酵过程中，可以代谢出多种抑菌活性成分。但针对绿木霉(Trichoderma virens)T43进行生物防治的研究比较多的集中于拮抗作用、抑菌成分、抑菌机理等方面，对于绿木霉杀松材线虫活性成分防治松材线虫的生防菌剂的制备方法，经检索未发现与本发明相关的报道。
绿木霉(Trichoderma virens)在Ainsworth(1973)系统中属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetes)，丝孢菌目(Hyphoales)，丝孢菌科(Hyphoaceae)，木霉属(Trichoderma)。绿木霉(Trichoderma virens)T43是一株广谱高效拮抗木霉菌株，对多种林木病原菌包括樟子松枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)、杨树烂皮病菌(Cytospora chrysosperma)、杨树叶枯病菌(Alternaria alternata)、沙棘干缩病菌(Fusarium sporotrichoides)、苗木立枯病菌(Rhizoctonia solani、Fusariumoxysporum、Pythium debaryanum)、松烂皮病菌(Cenangium ferruginosum)均有较好的抑制效果，其发酵液及乙酸乙酯提取物对松球壳孢菌室内生长抑制率分别为92.94％和90.58％，易培养，功效高。将此菌株应用到松材线虫防治还是首次。因此有必要开发一种高效、低毒、无公害的、稳定、便于保存的防治松材线虫的绿木霉生物农药。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种防治松材线虫的生物农药及其制备方法，以及其在防治松材线虫方面的应用。
本发明的另一方面，提供了一种防治松材线虫的生物农药，其特征在于，该农药的剂型为粉剂，该粉剂的活性成分为绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液正丁醇提取物，该粉剂是通过将发酵液过滤、离心，取上清液，加正丁醇混合萃取，弃水层，将正丁醇层蒸发浓缩得到的。
另一方面，具体的制备工艺如下：
1.制备PDA培养基
按照改良的PDA培养基制备方法。配方：马铃薯180-220g，葡萄糖18-22g，硫酸镁1-2g，磷酸二氢钠2-4g，琼脂18-22g，水1000mL，制作1L液体。分别装于500mL的锥形瓶中，每瓶大约装250mL。将装有培养基的锥形瓶放入高压灭菌器中(118-124℃)下灭菌18-22min。
2.接种
在PDA培养基上接种绿木霉(Trichoderma virens)T43。首先将超净工作台紫外灭菌30min。在超净工作台中将液态的PDA倒于每个玻璃培养皿中。待冷却后，取出绿木霉(Trichoderma virens)T43，接种到PDA培养基中，放置于25℃恒温培养箱中数日。
3.制备PD培养基
按照改良的PD培养基制备方法制备PD液体培养基。配方：马铃薯180-220g，葡萄糖18-22g，硫酸镁1-2g，磷酸二氢钠2-4g，水1000mL。分别装于250mL液体培养基的锥形瓶中。
4.接种及培养
在超净工作台中用直径为5mm无菌打孔器，切取之前在培养皿中培养好的绿木霉(Trichoderma virens)T43接种于250mL液体培养基的锥形瓶中，每瓶接3-4片菌饼，之后放于摇床(25℃、150r·min-1)振荡培养10d。
5.萃取及旋转蒸发
将振荡培养10d的绿木霉(Trichoderma virens)T43液体培养基都取出，分别用四层纱布过滤装于1L容量的锥形瓶中，装入萃取剂，本研究萃取剂选择正丁醇。正丁醇的萃取比例为1:1，1:2，1:3，萃取时间为24h，48h，72h。使用分液漏斗分液，丢弃下层浑浊液体，取上层清澈液体，再使用旋转蒸发仪进行旋转蒸发。在常温下静止放置24h～48h，分液漏斗过滤，弃水层，将正丁醇层以45～50℃真空旋转蒸发浓缩，直至液体全部蒸发干，圆底烧瓶底部有黄褐色粉末挂壁；得到生物农药粉剂。将绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液正丁醇提取物用0.5％～2.0％(V/V)吐温80溶液溶解，恢复为原发酵液过滤液体积的1/10，制备成生物菌剂。
7.室内抑制松材线虫研究
(1)培养灰葡萄孢：首先制作PDA培养基(配方同上)。在超净工作台中将实验室保存好的灰葡萄孢接菌到PDA培养基上，在25℃恒温培养箱中培养数日，等待灰葡萄孢长满培养皿。
(2)接种松材线虫：在超净工作台中接种实验室保存好的松材线虫于灰葡萄孢中，放置于25℃恒温培养箱中数日，等待线虫吃完灰葡萄孢即可。
(3)收集线虫液：准备一个大漏斗放在铁架台上，漏斗下面接一段10cm长的橡皮管，橡皮管上装一个止水夹，取4层纱布放在大漏斗上面，倒入无菌水掩盖到漏斗边缘。将培养皿松材线虫固态PDA全都放入大漏斗中，放5-6片，静置24h。24h之后，用30mL离心管从止水夹处接大漏斗中的无菌水，接完以后使用离心机离心，在离心机(3500r/min，5min)中离心去掉杂质后，用PBST缓冲液稀释线虫液，重复2到3次，最后收集到线虫液。
(4)室内杀松材线虫毒力测定：使用移液枪取活性成分150μL，线虫液50μL，将其混合共同放置于96孔板中，每样重复3次，每次每个孔板里用移液枪抽取50μL，并使用光学显微镜进行测定并记录松材线虫死亡情况，时间间隔为24h。利用记录的24h，48h，72h数据分析并得出结论。
本发明的优点是：
本发明为绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液中抑菌代谢产物菌剂的制备方法，对松材线虫具有显著的抑制效果，本发明具有高效、低毒、无公害等特点，对松材线虫引起的松树枯萎病具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作进一步详细描述。
绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液中活性成分生物菌剂的制备工艺：
实施例1
1.制备PDA培养基
按照改良的PDA培养基制备方法。配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钠3g，琼脂20g，水1000mL，制作1L液体。分别装于500mL的锥形瓶中，每瓶大约装250mL。将装有培养基的锥形瓶放入高压灭菌器中(121℃)下灭菌20min。
2.接种
在PDA培养基上接种绿木霉(Trichoderma virens)T43。首先将超净工作台紫外灭菌30min。在超净工作台中将液态的PDA倒于每个玻璃培养皿中。待冷却后，取出绿木霉(Trichoderma virens)T43，接种到PDA培养基中，放置于25℃恒温培养箱中数日。
3.制备PD培养基
按照改良的PD培养基制备方法制备PD液体培养基。配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钠3g，水1000mL。分别装于250mL液体培养基的锥形瓶中。
4.接种及培养
在超净工作台中用直径为5mm无菌打孔器，切取之前在培养皿中培养好的绿木霉(Trichoderma virens)T43接种于250mL液体培养基的锥形瓶中，每瓶接3-4片菌饼，之后放于摇床(24℃、140r·min-1)振荡培养11d。
5.萃取及旋转蒸发
将振荡培养10d的绿木霉(Trichoderma virens)T43液体培养基都取出，分别用四层纱布过滤装于1L容量的锥形瓶中，装入萃取剂，本研究萃取剂选择正丁醇。正丁醇的萃取比例为1:1，1:2，1:3，萃取时间为24h，48h，72h。使用分液漏斗分液，丢弃下层浑浊液体，取上层清澈液体，再使用旋转蒸发仪进行旋转蒸发。在常温下静止放置24h～48h，分液漏斗过滤，弃水层，将正丁醇层以45～50℃真空旋转蒸发浓缩，直至液体全部蒸发干，圆底烧瓶底部有黄褐色粉末挂壁；得到生物农药粉剂。将绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液正丁醇提取物用0.5％～2.0％(V/V)吐温80溶液溶解，恢复为原发酵液过滤液体积的1/10，制备成生物菌剂。
6.室内抑制松材线虫研究
(1)培养灰葡萄孢：首先制作PDA培养基(配方同上)。在超净工作台中将实验室保存好的灰葡萄孢接菌到PDA培养基上，在24℃恒温培养箱中培养数日，等待灰葡萄孢长满培养皿。
(2)接种松材线虫：在超净工作台中接种实验室保存好的松材线虫于灰葡萄孢中，放置于24℃恒温培养箱中数日，等待线虫吃完灰葡萄孢即可。
(3)收集线虫液：准备一个大漏斗放在铁架台上，漏斗下面接一段10cm长的橡皮管，橡皮管上装一个止水夹，取4层纱布放在大漏斗上面，倒入无菌水掩盖到漏斗边缘。将培养皿松材线虫固态PDA全都放入大漏斗中，放5-6片，静置24h。24h之后，用30mL离心管从止水夹处接大漏斗中的无菌水，接完以后使用离心机离心，在离心机(3500r/min，5min)中离心去掉杂质后，用PBST缓冲液稀释线虫液，重复2到3次，最后收集到线虫液。
(4)室内杀松材线虫毒力测定：使用移液枪取活性成分140μL，线虫液40μL，将其混合共同放置于96孔板中，每样重复3次，每次每个孔板里用移液枪抽取40μL，并使用光学显微镜进行测定并记录松材线虫死亡情况，时间间隔为24h。利用记录的24h，48h，72h数据分析并得出结论。
室内测定结果:正丁醇萃取的T43杀虫效果显著，正丁醇萃取比例1:1，1:2，1:3在24h，48h，72h校正死亡率都达到了100％，正丁醇作为萃取剂在对绿木霉T43萃取效果十分显著，能够将T43中的杀虫活性物质基本都萃取出来，达到高效的杀虫效果。
实施例2
1.制备PDA培养基
按照改良的PDA培养基制备方法。配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钠3g，琼脂20g，水1000mL，制作1L液体。分别装于500mL的锥形瓶中，每瓶大约装250mL。将装有培养基的锥形瓶放入高压灭菌器中(121℃)下灭菌20min。
2.接种
在PDA培养基上接种绿木霉(Trichoderma virens)T43。首先将超净工作台紫外灭菌30min。在超净工作台中将液态的PDA倒于每个玻璃培养皿中。待冷却后，取出绿木霉(Trichoderma virens)T43，接种到PDA培养基中，放置于25℃恒温培养箱中数日。
3.制备PD培养基
按照改良的PD培养基制备方法制备PD液体培养基。配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钠3g，水1000mL。分别装于250mL液体培养基的锥形瓶中。
4.接种及培养
在超净工作台中用直径为5mm无菌打孔器，切取之前在培养皿中培养好的绿木霉(Trichoderma virens)T43接种于250mL液体培养基的锥形瓶中，每瓶接3-4片菌饼，之后放于摇床(25℃、150r·min-1)振荡培养10d。
5.萃取及旋转蒸发
将振荡培养10d的绿木霉(Trichoderma virens)T43液体培养基都取出，分别用四层纱布过滤装于1L容量的锥形瓶中，装入萃取剂，本研究萃取剂选择正丁醇。正丁醇的萃取比例为1:1，1:2，1:3，萃取时间为24h，48h，72h。使用分液漏斗分液，丢弃下层浑浊液体，取上层清澈液体，再使用旋转蒸发仪进行旋转蒸发。在常温下静止放置24h～48h，分液漏斗过滤，弃水层，将正丁醇层以45～50℃真空旋转蒸发浓缩，直至液体全部蒸发干，圆底烧瓶底部有黄褐色粉末挂壁；得到生物农药粉剂。将绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液正丁醇提取物用0.5％～2.0％(V/V)吐温80溶液溶解，恢复为原发酵液过滤液体积的1/10，制备成生物菌剂。
6.室内抑制松材线虫研究
(1)培养灰葡萄孢：首先制作PDA培养基(配方同上)。在超净工作台中将实验室保存好的灰葡萄孢接菌到PDA培养基上，在25℃恒温培养箱中培养数日，等待灰葡萄孢长满培养皿。
(2)接种松材线虫：在超净工作台中接种实验室保存好的松材线虫于灰葡萄孢中，放置于25℃恒温培养箱中数日，等待线虫吃完灰葡萄孢即可。
(3)收集线虫液：准备一个大漏斗放在铁架台上，漏斗下面接一段10cm长的橡皮管，橡皮管上装一个止水夹，取4层纱布放在大漏斗上面，倒入无菌水掩盖到漏斗边缘。将培养皿松材线虫固态PDA全都放入大漏斗中，放5-6片，静置24h。24h之后，用30mL离心管从止水夹处接大漏斗中的无菌水，接完以后使用离心机离心，在离心机(3500r/min，5min)中离心去掉杂质后，用PBST缓冲液稀释线虫液，重复2到3次，最后收集到线虫液。
(4)室内杀松材线虫毒力测定：使用移液枪取活性成分150μL，线虫液50μL，将其混合共同放置于96孔板中，每样重复3次，每次每个孔板里用移液枪抽取50μL，并使用光学显微镜进行测定并记录松材线虫死亡情况，时间间隔为24h。利用记录的24h，48h，72h数据分析并得出结论。
室内测定结果:正丁醇萃取的T43杀现虫效果显著，正丁醇萃取比例1:1，1:2，1:3在24h，48h，72h校正死亡率都达到了100％，正丁醇作为萃取剂在对绿木霉T43萃取效果显著，能够将T43中的杀线虫活性物质萃取出来，从而达到高效的杀线虫效果。
Claims (10)
1.一种防治松材线虫的生物农药，其特征在于，该农药的剂型为粉剂，该粉剂的活性成分为绿木霉（Trichoderma virens）T43发酵液正丁醇提取物。
2.如权利要求1所述的生物农药，其特征在于，该粉剂是通过将绿木霉T43发酵液过滤、离心，取上清液，加正丁醇混合萃取，弃水层，将正丁醇层蒸发浓缩得到的。
3.如权利要求1所述的生物农药，其特征在于，所述粉剂经浓度为0.5%~2.0%（V/V）吐温80溶液溶解后可用于防治松材线虫。
4.如权利要求3所述的生物农药，其特征在于，所述粉剂经吐温80溶解后的得到的体积为原发酵液过滤液体积的1/10。
5.绿木霉T43发酵液正丁醇提取物在防治松材线虫方面的应用。
6.一种防治松材线虫的生物农药的制备方法，其特征在于，该方法是将绿木霉T43发酵液过滤、离心，取上清液，加正丁醇混合萃取，弃水层，将正丁醇层蒸发浓缩得到生物农药粉剂。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述绿木霉T43接种到的改良PDA斜面上，改良PDA培养基按比例组成为：马铃薯180-220 g，葡萄糖18-22 g，硫酸镁1-2 g，磷酸二氢钠2-4 g，琼脂18-22 g，水1000 mL，制作1 L液体，分别装于500 mL的锥形瓶中，每瓶大约装250 mL，将装有培养基的锥形瓶放入高压灭菌器中（118-124℃）下灭菌18-22 min，待冷却后，取出绿木霉（Trichoderma virens）T43，接种到PDA培养基中，放置于25℃恒温培养箱中数日。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述绿木霉T43接种在改良的PD培养基，PD液体培养基配方为：马铃薯180-220 g，葡萄糖18-22 g，硫酸镁1-2 g，磷酸二氢钠2-4 g，水1000 mL，分别装于250 mL液体培养基的锥形瓶中，在超净工作台中用直径为5 mm无菌打孔器，切取之前在培养皿中培养好的绿木霉（Trichoderma virens）T43接种于250 mL液体培养基的锥形瓶中，每瓶接3-4片菌饼，之后放于摇床（25℃、150 r•min-1）振荡培养10 d 。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述绿木霉（Trichoderma virens）T43液体培养基取出后分别用四层纱布过滤装于1 L容量的锥形瓶中，装入萃取剂正丁醇，正丁醇的萃取比例为1:1，1:2，1:3，萃取时间为24 h，48 h，72 h，使用分液漏斗分液，丢弃下层浑浊液体，取上层清澈液体，再使用旋转蒸发仪进行旋转蒸发，在常温下静止放置24 h~48h，分液漏斗过滤，弃水层，将正丁醇层以45~50 ℃真空旋转蒸发浓缩，直至液体全部蒸发干，圆底烧瓶底部有黄褐色粉末挂壁，得到生物农药粉剂。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，将所述生物农药粉剂用0.5%~2.0%（V/V）吐温80溶液溶解，恢复为原发酵液过滤液体积的1/10，用于防治松材线虫。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711262078.0A CN107926987B (zh) | 2017-12-04 | 2017-12-04 | 一种防治松材线虫的生物农药及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711262078.0A CN107926987B (zh) | 2017-12-04 | 2017-12-04 | 一种防治松材线虫的生物农药及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107926987A true CN107926987A (zh) | 2018-04-20 |
| CN107926987B CN107926987B (zh) | 2020-08-18 |
Family
ID=61947558
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711262078.0A Expired - Fee Related CN107926987B (zh) | 2017-12-04 | 2017-12-04 | 一种防治松材线虫的生物农药及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107926987B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399703A (zh) * | 2011-11-08 | 2012-04-04 | 华南农业大学 | 一种具杀线虫活性的木霉属真菌及其制备方法与应用 |
| CN102532247B (zh) * | 2011-11-08 | 2013-11-13 | 华南农业大学 | 一种来自绿木霉的杀线虫化合物及其制备方法和应用 |
| US20170283337A1 (en) * | 2016-04-03 | 2017-10-05 | John Gaunt | Method for creating nutrient rich biologically active soils and horiculutre media with predetermined characteristics |
-
2017
- 2017-12-04 CN CN201711262078.0A patent/CN107926987B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399703A (zh) * | 2011-11-08 | 2012-04-04 | 华南农业大学 | 一种具杀线虫活性的木霉属真菌及其制备方法与应用 |
| CN102532247B (zh) * | 2011-11-08 | 2013-11-13 | 华南农业大学 | 一种来自绿木霉的杀线虫化合物及其制备方法和应用 |
| US20170283337A1 (en) * | 2016-04-03 | 2017-10-05 | John Gaunt | Method for creating nutrient rich biologically active soils and horiculutre media with predetermined characteristics |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 邓 勋 等: "高效木霉菌株对樟子松枯梢病的抑菌机理", 《中南林业科技大学学报》 * |
| 魏博涵 等: "15个生防菌株乙酸乙酯提取物对松材线虫的杀虫活性", 《林业科技》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107926987B (zh) | 2020-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101575574B (zh) | 一种哈茨木霉类复合菌培养物及其在植保方面的应用 | |
| CN104694397B (zh) | 一株球毛壳菌及其应用 | |
| CN104480046B (zh) | 一株侧孢短芽孢杆菌及其应用 | |
| CN104630071B (zh) | 一株多孢木霉及其应用 | |
| CN102363750B (zh) | 一种杀虫真菌及其应用 | |
| CN106591157B (zh) | 一株防病促生的塔宾曲霉及其代谢产物的制备和应用 | |
| CN101445785A (zh) | 一株毒杀植物寄生线虫的黑曲霉真菌及其制备方法和应用 | |
| CN103749441A (zh) | 一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂及其制备方法和应用 | |
| CN106942301B (zh) | 一种防控水稻稻瘟病的植物源农药制剂及其制备方法 | |
| CN113142244A (zh) | 球孢白僵菌sb063和乙基多杀菌素对普通大蓟马的协同防治 | |
| CN113142245A (zh) | 球孢白僵菌sb038和乙基多杀菌素对普通大蓟马的协同防治 | |
| CN101965848B (zh) | 一种高效防治油茶主要病害的生物源农药及其应用 | |
| CN105695346B (zh) | 一株毒杀植物寄生线虫的菌核青霉及其制备方法和应用 | |
| CN104342388A (zh) | 链霉菌菌株及其防治番茄枯萎病联合应用 | |
| Chakravarty et al. | Interaction between the ectomycorrhizal fungus Paxillus involutus, damping‐off fungi and Pinus resinosa seedlings | |
| CN104531543B (zh) | 灰毛豆内生真菌tpl25及其在防治植物病害中的应用 | |
| CN103749546B (zh) | 一种玫烟色棒束孢与高效氯氰菊酯油悬浮剂及其应用 | |
| CN108220211A (zh) | 一株嗜油不动杆菌nmb17及其在植物病害防治中的应用 | |
| CN101502275A (zh) | 一种植物源农药 | |
| CN106906171A (zh) | 一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法 | |
| CN106434360A (zh) | 一株辐毛小鬼伞及其在防治小麦禾谷孢囊线虫病中的应用 | |
| CN107926987A (zh) | 一种防治松材线虫的生物农药及其制备方法 | |
| CN109673672A (zh) | 一种杂色曲霉hy12菌株的应用 | |
| CN105010404B (zh) | 一种杀虫活性物质及其制备方法和应用 | |
| CN107841467A (zh) | 一种防治松材线虫的生物农药及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200818 |