CN102532247B - 一种来自绿木霉的杀线虫化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来自绿木霉具有毒杀线虫活性的化合物及其制备方法和应用。所述化合物viridiol具有式(I)所示结构。本发明所述化合物对大豆孢囊线虫、松材线虫、爪哇根结线虫和南方根结线虫等多种线虫具有较强的杀死作用，可应用于制备防治线虫的制剂，具有高效、低毒、较广谱等优点，工业应用前景良好。

Description

一种来自绿木霉的杀线虫化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种分离自绿木霉(Hypocrea virens H22)的化合物及其制备方法和应用。

背景技术

植物寄生线虫是一类重要的病原微生物，分布广、种类多，全世界已报道的植物线虫有200多属5000余种，给农林业生产造成严重为害(冯志新，2001)。据估计全球每年由植物寄生线虫所造成的作物损失达780亿美元(Barker et al，1998)。就现今危害最为严重的根结线虫而言，其有着广泛的寄主，且为世界性分布，每年可给全球作物总产量造成10％以上的损失(Whitehead，1998)。

植物线虫具有隐蔽性、多寄主性、顽固性、易传播的特点，其种群增长迅速，给防治上带来了诸多的困难。自从20世纪40年代化学技术的革命后，化学杀虫剂被广泛用于农林业生产，并在害虫防治中占居重要地位。与此同时，由于人们长期过分依赖化学农药，且缺乏生态意识，造成了严重的环境污染。杀线虫剂多为高毒力高残留化学农药，这些药物对人畜不安全，对环境污染严重，并易使线虫产生抗药性，对有益生物杀伤力强。同时，随着人们环保意识的增强，对健康食品要求的日益增高，以往用于植物线虫防治的高毒农药多以法律的形式给予了禁用。

生物防治具有对人畜安全、对环境友好等优点，因此，生物防治方法在植物线虫病害的防治地位尤显重要。鉴于此，人们将研究重点转向了生物防治。生物防治的一个很重要的方面是使用微生物代谢物对有害生物进行防治，目前已经从微生物菌株中分离到上百种对线虫有活性的化合物，包括醌类、萜类、肽类等，这些化合物对进一步研究新型线虫生防制剂具有很好的开发潜力，因此，研究利用菌物微生物代谢物防治植物寄生线虫具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是克服植物寄生线虫现有生防技术的不足，提供一种来自于真菌的微生物源杀线虫化合物。

本发明的另一个目的是提供所述化合物的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述化合物的应用，为研究开发生物杀线虫制剂和研究开发仿生生物农药奠定基础。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明人在前期研究中，筛选获得了具有较好杀植物线虫功能的真菌绿木霉菌株(Hypocrea virens H22)，该菌株于2011年9月2日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2011303。

申请人采用萃取、硅胶柱层析及葡聚糖凝胶柱层析的方法，从绿木霉(Hypocrea virens H22)的CMA粉培养液(20g玉米粉，15g琼脂粉，1000ml水)中分离纯化到一种对植物线虫有杀线虫活性的化合物，根据其核磁碳谱、氢谱及高分辨率质谱的特征，确定了其分子量为354.1099，分子式为C₂₀H₁₈O₆，鉴定为viridiol，化学结构为式(I)所示：

实验表明：所述化合物viridiol对多种线虫均有较好的致死作用，LC₅₀随着处理时间延长而减小，其中对大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)的致死效果最好。处理36h后，对大豆孢囊线虫、松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)、爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)、南方根结线虫(M.incognita)、秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)、全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)、相似穿孔线虫(Radopholus similis)和玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)等线虫的致死LC₅₀分别是6.67、28.02、26.59、34.90、60.44、71.13、88.29和164.19mg/l；处理24h后LC₅₀分别是16.22、47.59、46.89、66.04、82.56、92.18、111.27mg/l；处理12h后的LC₅₀分别是23.99、100.77、81.10、113.38、119.12、124.18、148.26和346.33mg/l。

本发明的有益效果是：

提供了一种新的化合物，确定了其结构，来源于微生物，具有显著的广谱杀线虫活性；本发明进一步提供了所述化合物的制备方法，简单易行，具有良好的工业推广应用前景，对进一步研究新型线虫生防制剂、利用菌物微生物代谢物防治植物寄生线虫具有重要意义。

附图说明

图1化合物的HR-EI-MS图谱；

图2化合物的核磁氢谱；

图3化合物的核磁碳谱；

图4化合物的COSY图谱；

图5化合物的DEPT90图谱；

图6化合物的DEPT135图谱；

图7化合物的HSQC图谱；

图8化合物的HMBC图谱；

图9化合物的结构式。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。

实施例1 绿木霉(H.virens H22)的分离和鉴定

本申请人从广东省深圳湾红树林根际土样中分离得到一株对线虫具有很好毒杀作用的绿木霉(Hypocrea virens H22，缩写为H.virens H22)，菌株于2011年9月2日保存于中国湖北武汉市武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M 2011303。

在培养基上(培养基配方为CMA培养基：20g玉米粉，15g琼脂粉，1000ml水)撒1.0g土样，接入约1000条南方根结线虫二龄幼虫，25℃培养3d后，镜检并用针挑取死虫体上及其周围单个的真菌分生孢子于含硫酸链霉素50ppm的CMA平板上，纯化获得真菌。

所述绿木霉(H.virens H22)的菌株形态特征为：在PDA上初期为白色，中期颜色逐渐变为浅绿色，有发达的气生菌丝，后期产生大量的分数孢子梗及分生孢子，分生孢子梗对生或互生分枝，分枝上可再分枝，分枝顶端为小梗，瓶状，由小梗生出分生孢子，分生孢子近球形，多个分生孢子粘聚成球形的孢子头。

本发明进一步对绿木霉进行了分子鉴定，扩增靶标序列为ITS区，通过以下实验步骤获得ITS序列如表SEQ ID NO：1所示。

(1)基因组DNA的提取

(a)用解剖刀刮取PDA平板上27℃培养3d的菌丝在液氮中研磨成粉状；将菌丝粉迅速放入1.5mL的液氮预冷离心管中，每管0.3g；

(b)用500μL DNA抽提缓冲液(100mM Tris-HCl，750mM NaCl，40MmEDTA)悬浮步骤(a)离心管中的菌丝粉，并加入50μL 20％十二烷基硫酸钠(SDS)轻轻混合，37℃处理1hr；

(c)加入75μL的5M NaCl和65μL CTAB溶液(0.75M NaCl含10％CTAB)，65℃水浴20min；

(d)加入步骤(c)管中液体等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1，体积比)抽提，5000g离心10min，取上清；

(e)重复步骤d；

(f)加2μL RNase(10mg/mL)37℃处理30min；

(g)加入与步骤(f)管中液体等体积的异丙醇混匀，5000g，离心10min沉淀DNA；

(h)用0.5mL体积比浓度为70％的酒精洗涤沉淀，离心2min，倒掉酒精，风干；

(i)加入30μL TE(10mM Tris-HCl，1Mm EDTA，pH8.0)重新悬浮DNA；

(j)每个管中的样取2μL，Marker2000(Takara，日本)取5μL，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度。

(2)ITS区的PCR扩增

以菌株的基因组DNA为模板，用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增ITS区的片段。所述ITS1和ITS4的核苷酸序列如下：

ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；

反应体系：模板1μL；10×缓冲液2.5μL；4×dNTP 0.5μL；引物ITS11μL；引物ITS4 1μL；酶0.25μL；水18.75μL。以不加模板为阴性对照。

反应程序：94℃ 5min；94℃ 30sec→55℃ 30sec→72℃ 1min，35个循环；72℃ 2min；4℃ ∞。

PCR产物切胶回收，连接到常规的pMD-18T载体，然后转化克隆，送交上海博尚生物技术有限公司测序。

(3)序列分析

序列分析的结果通过国际互联网进行序列同源性检索，检索主程序采用BLASTN，即核酸序列对核酸序列数据库的检索，序列分析采用DNA Star软件进行。

比对结果发现与该菌同源性最高的均为绿木霉(HQ608079，JF439516，GU111539，HQ229950和HQ229948)真菌，同源性均超过99％，进一步表明本发明所述菌为绿木霉菌。

实施例2 绿木霉(H.virens H22)的培养

(1)固体培养法培养

培养基配方为马铃薯琼脂培养基(PDA培养基)：200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂粉，1000mL水；

在每个90mm的培养皿中倒入约占培养皿高度1/3厚的PDA培养基，将绿木霉(H.virens H22)菌丝体接种到PDA培养基上，用封口膜封口后于25～28℃下培养2～3天。将菌种保存于4℃冰箱中待用，或直接配备孢子培养液使用。

(2)液体培养法培养

培养基配方为CMA培养液：玉米粉20g，蒸馏水1000mL。

每个500mL三角瓶装200mL CMA培养液，121℃下湿热灭菌20min，冷却后每瓶接入5片活化后的绿木霉菌圆片，在180rmp 27℃下暗培养8d后，在4℃条件下12000rmp离心10min得上清液，上清液保存于4℃冰箱中待用。

实施例3 化合物viridiol的制备

取绿木霉(H.virens H22)的CMA培养液(20g玉米粉，1000ml水)在180rmp 27.5℃下暗培养7d后，过滤去除菌体得上清液后，用与上清液等体积的乙酸乙酯萃取3次，37℃旋转蒸发得到生防菌代谢物的粗提物。

用200～300目硅胶柱层析对粗提物进行馏分分段，先用极性低的氯仿洗脱，然后按照甲醇∶氯仿的体积比为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1和甲醇的顺序依次加大洗脱液的极性。每100ml收集一次馏分，通过TLC检测，合并比移值相同的馏分，旋转蒸发浓缩。当用氯仿∶甲醇＝7∶3的溶液为展开剂进行TLC检测时，若出现Rf值约为0.3的点(紫外光显色法检测)，则收集该馏分，进一步用葡聚糖凝胶柱层析(sephadex LH20)纯化，用甲醇洗脱，每5ml收集一次样，用氯仿∶甲醇的体积比为7∶3的溶液为展开剂进行TLC检测，收集只出现一个点且Rf值约为0.3的馏分，挥发掉有机溶剂后，即得到所述化合物viridiol。

实施例4 化合物viridiol的分子量、分子式及化学结构分析：

实施例3制备得到的化合物通过核磁共振波谱分析测定氢谱(¹HNMR)、碳谱(¹³CNMR)、DEPT90、DEPT135、COSY、HSQC和HMBC谱，样品用氘代丙酮溶解，以二甲基硅烷(TMS)为内参。通过高分辨率质谱(HR-MSEI源，MAT95XP)测定其分子量及分子式。测定结果如下：

见附图1所示，所述化合物viridiol在354.1099处出现一个分子/离子峰，通过软件优化后得出其分子式为C₂₀H₁₈O₆(分子量理论值为354.1099)，不饱和度为11。如附图2～附图8所示，由所述化合物的核磁氢谱(附图2)、核磁碳谱(附图3)、COSY谱(附图4)、DEPT90(附图5)、DEPT135(附图6)、HSQC(附图7)和HMBC谱(附图8)可知，所述化合物含有1个Me基团(δc32.14δH1.71)、1个O-Me基团(δc61.44δH3.69)、2个CH2基团(δc28.72δH3.55δH3.72，δc36.60δH2.66)、6个CH基团(δc73.24δH4.36，δc85.63δH3.83，δc63.10δH5.01，δc127.62δH8.51，δc126.92δH7.82，andδc146.31 δH7.92)基团和10个季碳，见表1所示。其化学结构为：

表1 化合物的核磁碳谱及核磁氢谱数据(600MHz，Acetone-d6)

实施例5 化合物viridiol对线虫的药效试验

1、制备试验用线虫

(1)制备全齿复活线虫：将全齿复活线虫(来自中国科学院微生物研究所，也可以采用本领域实验室使用的同类线虫)接种于燕麦片培养基(组成：10g燕麦片，30ml水)上，25℃下培养6天左右，置于4℃冰箱备用。使用前将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml离心管内加入无菌水，瞬时离心，弃上清，重复3次得到洁净供试线虫，稀释成约20000条/ml的线虫悬浮液备用。

(2)制备松材线虫：在倒入1/3厚PDA培养基的培养皿中接入拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)(华南农业大学植物线虫研究室保存，也可以采用本领域实验室使用的同类线虫)，25℃培养4～7天。待菌丝铺满培养皿后，接种松材线虫，25℃培养5～8天。用无菌水将线虫冲洗，制成含量为20000条/ml的线虫悬浮液。

(3)制备爪哇根结线虫二龄幼虫：取爪哇根结线虫(采自云南昆明，单卵块纯化后保存于华南农业大学植物线虫研究室，也可以采用本领域实验室使用的同类线虫)的单卵块接种至预先在消毒土壤中培育2周的感病番茄或马铃薯植株上，约45d后，将根拔起用自来水洗净，于解剖镜下挑取根上卵块，其中1/2卵块放入带盖的10mL离心管中，加入5mL 0.5％ NaClO，用力振荡3min，迅速通过双层筛，上层筛孔径为250μm，下层筛孔径为38μm，然后用无菌水收集冲洗下层筛中的卵粒置于双层网筛(铁丝网和滤纸)上，网筛浸于加有灭菌水的灭菌培养皿内，25℃孵化3天收集已孵化的二龄幼虫，稀释成约20000条/ml的线虫悬浮液备用。

(4)制备南方根结线虫二龄幼虫：南方根结线虫(采自广东广州，单卵块纯化后保存于华南农业大学植物线虫研究室，也可以采用本领域实验室使用的同类线虫)二龄幼虫的获得方法同爪哇根结线虫二龄幼虫的制备方法。

(5)制备大豆孢囊线虫：将大豆孢囊线虫的孢囊(采自辽宁省沈阳，保存于华南农业大学植物线虫研究室，也可以采用本领域实验室使用的同类线虫)于30℃下孵化7d后，收集二龄幼虫，用0.1％次氯酸钠消毒5min后，室温下4000转/分钟离心3min，弃上清液，用无菌水漂洗三次后，稀释成约20000条/ml的线虫悬浮液备用。

(6)制备秀丽小杆线虫：在NGM培养基(NaCl 3g，蛋白胨2.5g，琼脂17g，1mol/l K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液(pH6.0)25mL，975mL蒸馏水，灭菌后加入经除菌的1mL胆固醇乙醇溶液(5mg/mL)，1mol/l MgSO₄和CaCl₂各1mL)上接入5ml的大肠杆菌，所述大肠杆菌提前24h用LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，灭菌水1L)培养好，再接入约500条线虫，于20℃下培养5～7d，用无菌水洗下线虫，用0.1％次氯酸钠消毒5min后，室温下4000转/分钟离心3min，弃上清液，用无菌水漂洗三次后，稀释成约20000条/ml的线虫悬浮液备用。

(7)制备相似穿孔线虫：在长出愈伤组织的胡萝卜培养基上接入约500条相似穿孔线虫(采自广东省广州市，保存于华南农业大学植物线虫研究室，也可以采用本领域实验室使用的同类线虫)，25℃培养7d后，用无菌水洗下线虫，制成含量为20000条/ml的线虫悬浮液。

(8)制备玉米短体线虫：线虫(采自广东省广州市，保存于华南农业大学植物线虫研究室)的获得方法同相似穿孔线虫的制备方法。

2、试验方法

将本发明化合物viridiol用少量二甲基亚砜(DMSO)溶解，加入无菌水配置成一定浓度的母液(DMSO浓度低于5％)，再分别稀释成不同的浓度(10，15，25，50，75，100，125，150，200和250mg/l)，每个浓度取200μl于24孔细胞培养板中，加入约200条供测定的线虫，置于25℃恒温培养箱中，分别于12h、24h和36h后再解剖镜下观察，记录各处理的死亡数。每个浓度设3个重复。对照用无菌水配置的5％DMSO溶液。按照以下公式计算线虫的死亡率(公式1)和校正死亡率(公式2)

线虫死活的鉴别采用体态法与针刺法结合的方法：即死的虫体多呈僵直状态，而活的体态是几度弯曲，一般盘卷和蠕动，若无法判断，则用针刺法，针刺不动则判断为死亡。

实施例6 化合物viridiol对线虫的毒杀作用

按前述试验方法进行药效试验，化合物viridiol对供试8种线虫的LC50见表2所示：

表2 本发明化合物对不同线虫的毒杀作用

实施例7 化合物viridiol对番茄和辣椒的毒性测定

将本发明化合物viridiol用少量二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成不同浓度的溶液(100mg/l、200mg/l、300mg/l、500mg/l和1000mg/l)，取5μl滴于生长了2周的番茄苗和辣椒苗的叶片上，定期观察并记录其发病情况。对照用无菌水配制等浓度的DMSO溶液。

结果发现使用所设定的浓度下，化合物viridiol没有表现出对番茄苗和辣椒苗的叶片有毒性作用。

以上实验结果说明来源于绿木霉(H.virens H22)的化合物viridiol对多种不同的线虫均有较高的毒杀效果，表明具有较好的广谱性，且对作物没有明显的负面效果，表明本发明化合物viridiol具有开发为生物杀线虫制剂的潜力并为研究开发仿生生物农药奠定基础。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  一种来自绿木霉具有毒杀线虫活性的化合物及其制备方法和应用

 

<130> 

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  576

<212>  DNA

<213>  绿木霉（Hypocrea virens H22）ITS序列

 

<400>  1

ttaagtksak cgggtaytcc tacctgatcc gaggtcaaca tttcagaagt ttggggtgtt       60

 

taacggctgt ggacgcgccg cgctcccgat gcgagtgtgc aaactactgc gcaggagagg      120

 

ctgcggcgag accgccactg tatttcgggg ccggccccgt aaagggccga tccccaacgc      180

 

cgaccccccg gaggggttcg agggttgaaa tgacgctcgg acaggcatgc ccgccagaat      240

 

actggcgggc gcaatgtgcg ttcaaagatt cgatgattca ctgaattctg caattcacat      300

 

tacttatcgc atttcgctgc gttcttcatc gatgccagaa ccaagagatc cgttgttgaa      360

 

agttttgatt cattttcgaa acgcccacga ggggcgccga gatggctcag atagtaaaaa      420

 

acccgcgagg gggtatacaa taagagtttt ggttggtcct ccggcgggcg ccttggtccg      480

 

gggctgcgac gcacccgggg cagagatccc gccgaggcaa cagtttggta acgttcacat      540

 

tgggtttggg agttgtaaac tcgagymayg atccct                                576

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  引物ITS1

 

<400>  2

tccgtaggtg aacctgcgg                                                    19

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  引物ITS4

 

<400>  3

tcctccgctt attgatatgc                                                   20

Claims (4)

1.一种如式（Ⅰ）所示结构的来自绿木霉（Hyprcrea viride H22）具有毒杀线虫活性的化合物的制备方法，其特征在于按如下步骤制备得到：

     式（Ⅰ）

（1）取绿木霉（Hypocrea viride H22）真菌的培养液，过滤去除菌体后，用等体积的乙酸乙酯萃取，旋转蒸发得到粗提物；

（2）用硅胶柱层析对步骤（1）所得粗提物进行馏分分段，先用氯仿洗脱，然后按照甲醇：氯仿的体积比为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1和甲醇的顺序依次洗脱；每100ml收集1次馏分，通过TLC检测，合并比移值相同的馏分，旋转蒸发浓缩；

（3）收集采用氯仿：甲醇体积比为7:3的溶液为展开剂、进行TLC检测时出现Rf值约为0.3的点情况下的馏分，将所述馏分用葡聚糖凝胶柱层析纯化，甲醇洗脱，每5ml收集一次样；采用氯仿：甲醇体积比为7:3的溶液为展开剂进行TLC检测，收集只出现一个点且Rf值约为0.3的馏分，挥发掉有机溶剂，即得所述化合物。

2.一种按照权利要求1所述方法制得的具有毒杀线虫活性的化合物在制备防治植物线虫制剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于应用于制备防治大豆孢囊线虫（Heterodera glycines）、松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）、爪哇根结线虫（Meloidogyne javanica）、南方根结线虫（M.incognita）、秀丽小杆线虫（Caenorhabditis elegans）、全齿复活线虫（Panagrellusredivivus）、相似穿孔线虫（Radopholus similis）和/或玉米短体线虫（Pratylenchus zeae）的制剂。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于应用于防治大豆孢囊线虫、松材线虫、爪哇根结线虫或南方根结线虫。

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