CN107926987B - 一种防治松材线虫的生物农药及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种防治松材线虫的生物农药及其制备方法，以及其在防治松材线虫方面的应用。该农药的剂型为粉剂，该粉剂的活性成分为绿木霉（Trichoderma virens）T43发酵液正丁醇提取物，该粉剂是通过将发酵液过滤、离心，取上清液，加正丁醇混合萃取，弃水层，将正丁醇层蒸发浓缩得到的。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治松材线虫的生物农药，该农药提取于抑制松材线虫生防真菌—绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液中抑菌代谢产物，还涉及及其制备方法，尤其是涉及绿木霉(Trichoderma virens)T43液体发酵工艺流程和活性成分的分离提取方法，以及其在防治松材线虫方面的应用。
背景技术
松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)是松树的毁灭性病害，树木患病后死亡率极高，防治难度大，能造成相当严重的经济损失和非常重大的生态灾难，在林业经济和自然景观上有着很大的威胁，在世界各国有着头号植物检疫对象之称。对于防治松材线虫，历来以化学药剂为主，而化学药剂带来的负面影响，使得生物防治的研究成为热点。真菌农药具有毒性低，选择性强，高效低残留，对环境造成的危害低等特点。国内外研究表明绿木霉对多种病害具有抑制作用。说明绿木霉T43在液体发酵过程中，可以代谢出多种抑菌活性成分。但针对绿木霉(Trichoderma virens)T43进行生物防治的研究比较多的集中于拮抗作用、抑菌成分、抑菌机理等方面，对于绿木霉杀松材线虫活性成分防治松材线虫的生防菌剂的制备方法，经检索未发现与本发明相关的报道。
绿木霉(Trichoderma virens)在Ainsworth(1973)系统中属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetes)，丝孢菌目(Hyphoales)，丝孢菌科(Hyphoaceae)，木霉属(Trichoderma)。绿木霉(Trichoderma virens)T43是一株广谱高效拮抗木霉菌株，对多种林木病原菌包括樟子松枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)、杨树烂皮病菌(Cytospora chrysosperma)、杨树叶枯病菌(Alternaria alternata)、沙棘干缩病菌(Fusarium sporotrichoides)、苗木立枯病菌(Rhizoctonia solani、Fusariumoxysporum、Pythium debaryanum)、松烂皮病菌(Cenangium ferruginosum)均有较好的抑制效果，其发酵液及乙酸乙酯提取物对松球壳孢菌室内生长抑制率分别为92.94％和90.58％，易培养，功效高。将此菌株应用到松材线虫防治还是首次。因此有必要开发一种高效、低毒、无公害的、稳定、便于保存的防治松材线虫的绿木霉生物农药。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种防治松材线虫的生物农药及其制备方法，以及其在防治松材线虫方面的应用。
本发明的另一方面，提供了一种防治松材线虫的生物农药，其特征在于，该农药的剂型为粉剂，该粉剂的活性成分为绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液正丁醇提取物，该粉剂是通过将发酵液过滤、离心，取上清液，加正丁醇混合萃取，弃水层，将正丁醇层蒸发浓缩得到的。
另一方面，具体的制备工艺如下：
1.制备PDA培养基
按照改良的PDA培养基制备方法。配方：马铃薯180-220g，葡萄糖18-22g，硫酸镁1-2g，磷酸二氢钠2-4g，琼脂18-22g，水1000mL，制作1L液体。分别装于500mL的锥形瓶中，每瓶大约装250mL。将装有培养基的锥形瓶放入高压灭菌器中(118-124℃)下灭菌18-22min。
2.接种
在PDA培养基上接种绿木霉(Trichoderma virens)T43。首先将超净工作台紫外灭菌30min。在超净工作台中将液态的PDA倒于每个玻璃培养皿中。待冷却后，取出绿木霉(Trichoderma virens)T43，接种到PDA培养基中，放置于25℃恒温培养箱中数日。
3.制备PD培养基
按照改良的PD培养基制备方法制备PD液体培养基。配方：马铃薯180-220g，葡萄糖18-22g，硫酸镁1-2g，磷酸二氢钠2-4g，水1000mL。分别装于250mL液体培养基的锥形瓶中。
4.接种及培养
在超净工作台中用直径为5mm无菌打孔器，切取之前在培养皿中培养好的绿木霉(Trichoderma virens)T43接种于250mL液体培养基的锥形瓶中，每瓶接3-4片菌饼，之后放于摇床(25℃、150r·min-1)振荡培养10d。
5.萃取及旋转蒸发
将振荡培养10d的绿木霉(Trichoderma virens)T43液体培养基都取出，分别用四层纱布过滤装于1L容量的锥形瓶中，装入萃取剂，本研究萃取剂选择正丁醇。正丁醇的萃取比例为1:1，1:2，1:3，萃取时间为24h，48h，72h。使用分液漏斗分液，丢弃下层浑浊液体，取上层清澈液体，再使用旋转蒸发仪进行旋转蒸发。在常温下静止放置24h～48h，分液漏斗过滤，弃水层，将正丁醇层以45～50℃真空旋转蒸发浓缩，直至液体全部蒸发干，圆底烧瓶底部有黄褐色粉末挂壁；得到生物农药粉剂。将绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液正丁醇提取物用0.5％～2.0％(V/V)吐温80溶液溶解，恢复为原发酵液过滤液体积的1/10，制备成生物菌剂。
7.室内抑制松材线虫研究
(1)培养灰葡萄孢：首先制作PDA培养基(配方同上)。在超净工作台中将实验室保存好的灰葡萄孢接菌到PDA培养基上，在25℃恒温培养箱中培养数日，等待灰葡萄孢长满培养皿。
(2)接种松材线虫：在超净工作台中接种实验室保存好的松材线虫于灰葡萄孢中，放置于25℃恒温培养箱中数日，等待线虫吃完灰葡萄孢即可。
(3)收集线虫液：准备一个大漏斗放在铁架台上，漏斗下面接一段10cm长的橡皮管，橡皮管上装一个止水夹，取4层纱布放在大漏斗上面，倒入无菌水掩盖到漏斗边缘。将培养皿松材线虫固态PDA全都放入大漏斗中，放5-6片，静置24h。24h之后，用30mL离心管从止水夹处接大漏斗中的无菌水，接完以后使用离心机离心，在离心机(3500r/min，5min)中离心去掉杂质后，用PBST缓冲液稀释线虫液，重复2到3次，最后收集到线虫液。
(4)室内杀松材线虫毒力测定：使用移液枪取活性成分150μL，线虫液50μL，将其混合共同放置于96孔板中，每样重复3次，每次每个孔板里用移液枪抽取50μL，并使用光学显微镜进行测定并记录松材线虫死亡情况，时间间隔为24h。利用记录的24h，48h，72h数据分析并得出结论。
本发明的优点是：
本发明为绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液中抑菌代谢产物菌剂的制备方法，对松材线虫具有显著的抑制效果，本发明具有高效、低毒、无公害等特点，对松材线虫引起的松树枯萎病具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作进一步详细描述。
绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液中活性成分生物菌剂的制备工艺：
实施例1
1.制备PDA培养基
按照改良的PDA培养基制备方法。配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钠3g，琼脂20g，水1000mL，制作1L液体。分别装于500mL的锥形瓶中，每瓶大约装250mL。将装有培养基的锥形瓶放入高压灭菌器中(121℃)下灭菌20min。
2.接种
在PDA培养基上接种绿木霉(Trichoderma virens)T43。首先将超净工作台紫外灭菌30min。在超净工作台中将液态的PDA倒于每个玻璃培养皿中。待冷却后，取出绿木霉(Trichoderma virens)T43，接种到PDA培养基中，放置于25℃恒温培养箱中数日。
3.制备PD培养基
按照改良的PD培养基制备方法制备PD液体培养基。配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钠3g，水1000mL。分别装于250mL液体培养基的锥形瓶中。
4.接种及培养
在超净工作台中用直径为5mm无菌打孔器，切取之前在培养皿中培养好的绿木霉(Trichoderma virens)T43接种于250mL液体培养基的锥形瓶中，每瓶接3-4片菌饼，之后放于摇床(24℃、140r·min-1)振荡培养11d。
5.萃取及旋转蒸发
将振荡培养10d的绿木霉(Trichoderma virens)T43液体培养基都取出，分别用四层纱布过滤装于1L容量的锥形瓶中，装入萃取剂，本研究萃取剂选择正丁醇。正丁醇的萃取比例为1:1，1:2，1:3，萃取时间为24h，48h，72h。使用分液漏斗分液，丢弃下层浑浊液体，取上层清澈液体，再使用旋转蒸发仪进行旋转蒸发。在常温下静止放置24h～48h，分液漏斗过滤，弃水层，将正丁醇层以45～50℃真空旋转蒸发浓缩，直至液体全部蒸发干，圆底烧瓶底部有黄褐色粉末挂壁；得到生物农药粉剂。将绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液正丁醇提取物用0.5％～2.0％(V/V)吐温80溶液溶解，恢复为原发酵液过滤液体积的1/10，制备成生物菌剂。
6.室内抑制松材线虫研究
(1)培养灰葡萄孢：首先制作PDA培养基(配方同上)。在超净工作台中将实验室保存好的灰葡萄孢接菌到PDA培养基上，在24℃恒温培养箱中培养数日，等待灰葡萄孢长满培养皿。
(2)接种松材线虫：在超净工作台中接种实验室保存好的松材线虫于灰葡萄孢中，放置于24℃恒温培养箱中数日，等待线虫吃完灰葡萄孢即可。
(3)收集线虫液：准备一个大漏斗放在铁架台上，漏斗下面接一段10cm长的橡皮管，橡皮管上装一个止水夹，取4层纱布放在大漏斗上面，倒入无菌水掩盖到漏斗边缘。将培养皿松材线虫固态PDA全都放入大漏斗中，放5-6片，静置24h。24h之后，用30mL离心管从止水夹处接大漏斗中的无菌水，接完以后使用离心机离心，在离心机(3500r/min，5min)中离心去掉杂质后，用PBST缓冲液稀释线虫液，重复2到3次，最后收集到线虫液。
(4)室内杀松材线虫毒力测定：使用移液枪取活性成分140μL，线虫液40μL，将其混合共同放置于96孔板中，每样重复3次，每次每个孔板里用移液枪抽取40μL，并使用光学显微镜进行测定并记录松材线虫死亡情况，时间间隔为24h。利用记录的24h，48h，72h数据分析并得出结论。
室内测定结果:正丁醇萃取的T43杀虫效果显著，正丁醇萃取比例1:1，1:2，1:3在24h，48h，72h校正死亡率都达到了100％，正丁醇作为萃取剂在对绿木霉T43萃取效果十分显著，能够将T43中的杀虫活性物质基本都萃取出来，达到高效的杀虫效果。
实施例2
1.制备PDA培养基
按照改良的PDA培养基制备方法。配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钠3g，琼脂20g，水1000mL，制作1L液体。分别装于500mL的锥形瓶中，每瓶大约装250mL。将装有培养基的锥形瓶放入高压灭菌器中(121℃)下灭菌20min。
2.接种
在PDA培养基上接种绿木霉(Trichoderma virens)T43。首先将超净工作台紫外灭菌30min。在超净工作台中将液态的PDA倒于每个玻璃培养皿中。待冷却后，取出绿木霉(Trichoderma virens)T43，接种到PDA培养基中，放置于25℃恒温培养箱中数日。
3.制备PD培养基
按照改良的PD培养基制备方法制备PD液体培养基。配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钠3g，水1000mL。分别装于250mL液体培养基的锥形瓶中。
4.接种及培养
在超净工作台中用直径为5mm无菌打孔器，切取之前在培养皿中培养好的绿木霉(Trichoderma virens)T43接种于250mL液体培养基的锥形瓶中，每瓶接3-4片菌饼，之后放于摇床(25℃、150r·min-1)振荡培养10d。
5.萃取及旋转蒸发
将振荡培养10d的绿木霉(Trichoderma virens)T43液体培养基都取出，分别用四层纱布过滤装于1L容量的锥形瓶中，装入萃取剂，本研究萃取剂选择正丁醇。正丁醇的萃取比例为1:1，1:2，1:3，萃取时间为24h，48h，72h。使用分液漏斗分液，丢弃下层浑浊液体，取上层清澈液体，再使用旋转蒸发仪进行旋转蒸发。在常温下静止放置24h～48h，分液漏斗过滤，弃水层，将正丁醇层以45～50℃真空旋转蒸发浓缩，直至液体全部蒸发干，圆底烧瓶底部有黄褐色粉末挂壁；得到生物农药粉剂。将绿木霉(Trichoderma virens)T43发酵液正丁醇提取物用0.5％～2.0％(V/V)吐温80溶液溶解，恢复为原发酵液过滤液体积的1/10，制备成生物菌剂。
6.室内抑制松材线虫研究
(1)培养灰葡萄孢：首先制作PDA培养基(配方同上)。在超净工作台中将实验室保存好的灰葡萄孢接菌到PDA培养基上，在25℃恒温培养箱中培养数日，等待灰葡萄孢长满培养皿。
(2)接种松材线虫：在超净工作台中接种实验室保存好的松材线虫于灰葡萄孢中，放置于25℃恒温培养箱中数日，等待线虫吃完灰葡萄孢即可。
(3)收集线虫液：准备一个大漏斗放在铁架台上，漏斗下面接一段10cm长的橡皮管，橡皮管上装一个止水夹，取4层纱布放在大漏斗上面，倒入无菌水掩盖到漏斗边缘。将培养皿松材线虫固态PDA全都放入大漏斗中，放5-6片，静置24h。24h之后，用30mL离心管从止水夹处接大漏斗中的无菌水，接完以后使用离心机离心，在离心机(3500r/min，5min)中离心去掉杂质后，用PBST缓冲液稀释线虫液，重复2到3次，最后收集到线虫液。
(4)室内杀松材线虫毒力测定：使用移液枪取活性成分150μL，线虫液50μL，将其混合共同放置于96孔板中，每样重复3次，每次每个孔板里用移液枪抽取50μL，并使用光学显微镜进行测定并记录松材线虫死亡情况，时间间隔为24h。利用记录的24h，48h，72h数据分析并得出结论。
室内测定结果:正丁醇萃取的T43杀现虫效果显著，正丁醇萃取比例1:1，1:2，1:3在24h，48h，72h校正死亡率都达到了100％，正丁醇作为萃取剂在对绿木霉T43萃取效果显著，能够将T43中的杀线虫活性物质萃取出来，从而达到高效的杀线虫效果。
Claims (4)
1.一种防治松材线虫的生物农药，其特征在于，该农药的剂型为粉剂，该粉剂的活性成分为绿木霉（Trichoderma virens）T43发酵液正丁醇提取物；所述绿木霉（Trichoderma virens）T43的保藏编号为：CGMCC No: 14622；
该粉剂是通过将绿木霉T43发酵液过滤、离心，取上清液，加正丁醇混合萃取，弃水层，将正丁醇层蒸发浓缩得到的；
所述粉剂经浓度为0.5%~2.0%（V/V）吐温80溶液溶解后可用于防治松材线虫；
所述粉剂经吐温80溶解后得到的体积为原发酵液过滤液体积的1/10。
2.根据权利要求1所述的一种防治松材线虫的生物农药的制备方法，其特征在于，该方法是将绿木霉T43发酵液过滤、离心，取上清液，加正丁醇混合萃取，弃水层，将正丁醇层蒸发浓缩得到生物农药粉剂。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述绿木霉T43接种到改良PDA培养基上，改良PDA培养基按比例组成为：马铃薯180-220 g，葡萄糖18-22 g，硫酸镁1-2 g，磷酸二氢钠2-4 g，琼脂18-22 g，水1000 mL，制作1 L液体，分别装于500 mL的锥形瓶中，每瓶大约装250 mL，将装有培养基的锥形瓶放入高压灭菌器中，于118-124℃下灭菌18-22 min，待冷却后，取出绿木霉（Trichoderma virens）T43，接种到PDA培养基中，放置于25℃恒温培养箱中数日。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述绿木霉T43接种在改良的PD液体培养基，PD液体培养基配方为：马铃薯180-220 g，葡萄糖18-22 g，硫酸镁1-2 g，磷酸二氢钠2-4 g，水1000 mL，分别装于250 mL液体培养基的锥形瓶中，在超净工作台中用直径为5 mm无菌打孔器，打孔之后将在培养皿中培养好的绿木霉（Trichoderma virens）T43接种于250mL液体培养基的锥形瓶中，每瓶接3-4片菌饼，之后放于摇床，于25℃、150 r/min条件下振荡培养10 d 。
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