CN113142244B

CN113142244B - 球孢白僵菌sb063和乙基多杀菌素对普通大蓟马的协同防治

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Publication number: CN113142244B
Application number: CN202110008662.3A
Authority: CN
Inventors: 吴建辉; 田庆恒; 陈月银; 肖卡特·阿里; 王兴民; 邱宝利
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-01-05
Filing date: 2021-01-05
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2041-01-05
Also published as: CN113142244A

Abstract

本发明的杀虫剂中的球孢白僵菌SB063和乙基多杀菌素对普通大蓟马的毒杀作用产生了显著的协同增效作用。经长期的侵染生物学研究和室内生物测定，该球孢白僵菌与乙基多杀菌素的联合使用对普通大蓟马有很好的防治效果，在其生物防治中具有非常强的应用潜力，可减少化学农药使用量，兼具低毒、抗药性低的特点，对环境无污染、无残留，有利于延缓蓟马类害虫抗药性的发生和发展。

Description

球孢白僵菌SB063和乙基多杀菌素对普通大蓟马的协同防治

技术领域

本发明属于生物防治技术领域。具体涉及普通大蓟马防治的生物防治，更具体地，涉及一种球孢白僵菌和乙基多杀菌素对普通大蓟马的协同防治。

背景技术

化学农药在害虫防治中发挥着巨大作用，我国农药的使用量与产量长期位居世界首位。然而据统计，全球农药的有效利用率不足30％，我国每年化学农药使用面积在2.8亿hm²以上，施用量达50-60万吨，约80％的化学农药直接进入环境(李亮,张占英,孙慧英,等.农药危害与绿色植保技术探讨[J].湖北植保,2018,(4):63-64)。随着化学农药长期大量的使用，带来的“3R”问题即害虫抗药性(Resistance)、农药残留(Residue)和害虫再猖厥(Resurgence)以及环境污染问题越来越严重，还有许多害虫的天敌在防治过程中被误杀(孟素艳.虫害化学防治过程中保护害虫天敌的措施[J].河北农业,2012,(03):35-37.)。随着现代绿色食品生产的迅速发展，传统的病虫害防治模式需要改变，急需寻求可持续的绿色治理途径(Chen X,Li L,Hu Q,et al..Expression of dsRNA in recombinant Isariafumosorosea strain the TLR7gene in Bemisia tabaci[J].Bmc Biotechnology,2015,15(64).)。

普通大蓟马Megalurothrips usitatus(Bagrall)又称豆大蓟马、豆花蓟马，是缨翅目Thysanoptera蓟马亚族Thripina(Stephens)Priesner大蓟马属Megalurothrips昆虫(韩运发.中国经济昆虫志第五十五册：缨翅目[M].北京：科学出版社,1997:39-59.)。普通大蓟马属于杂食性昆虫，寄主植物包括28种，分属于9科，其中16种为豆科作物(Aliakbarpour H,Rawi C S M.The species composition of thrips(insecta:thysanoptera)inhabiting mango orchards in pulau pinang,malaysia.[J].TropicalLife Sciences Research,2012,23(1):45.)。普通大蓟马主要发生于10月至次年5月，隐蔽性强，仅在成花开放时刻观察到，其余大多数时间躲藏与花中取食，单花虫量高达35头，为害数量大，防治难度大(唐良德,韩云,吴建辉,等.豆大蓟马室内对不同颜色及光波的趋性反应[J].植物保护,2015(6):169-172.)。该蓟马隐蔽性强繁殖速度快的特点给防治带来了极大的难度，植株受害部位起初呈现白色，之后逐渐枯萎变成褐色，心叶被害时皱缩卷曲变形直至植株死亡，对幼苗期为害较轻，主要为害豇豆花和果，造成黑头，黑尾严重影响商品的外观品质和营养价值。目前，蓟马的防治还主要依赖化学防治手段。由于大量化学药剂的不合理使用，从而引发害虫抗药性、杀伤天敌、农药残留、环境污染等诸多问题，产品质量安全也受到威胁。所以，寻求环境友好型防治策略极为迫切的今天，生物防治在蓟马类害虫的防治工作中具有广阔的应用前景。

球孢白僵菌隶属半知菌亚门(Deutero mycotina)，丛梗孢目(Moniliales)，丛孢梗科(moniliaceae)，白僵菌属(Beaveriaspp)，是重要的生防菌种。球孢白僵菌在墨西哥黑蝗(Melanopius mexicanus)上首次发现，70年代初期，首次作为生防菌应用于西方五月鳃金龟中，并取得成功，引起广泛关注。例如，袁盛勇等(2011和2013)从银纹夜蛾幼虫上分离获得对西花蓟马高毒力的球孢白僵菌MZ050724菌株，以及对榕母管蓟马高毒力的球孢白僵菌Bb080717菌株和MZ050724菌株(西南大学学报、环境昆虫学报、中国森林病虫)；王海鸿等从玉米螟上分离获得两株对西花蓟马具良好防治效果的球孢白僵菌(CN104212724A和CN104263655A)；涂雄兵等(2016)发现了一株对苜蓿蓟马具良好防治效果的球孢白僵菌(CN106135295A)，等等。其中可见，研究最多的是球孢白僵菌对蓟马的生防作用。

虫生真菌，对环境友好，可寄生多种害虫，是生物防治中的最佳选择。但是，虫生真菌杀虫效果慢(3天才见效)；防效差(<50％)；制剂货架寿命短(<6个月)；不易工业化大规模生产(菌种退化)等缺点明显，为了更好的对其防治，可采用农药复配技术或混合施用技术。在防治普通大蓟马时如何做到高效、无污染、无残留的防治，是当前解决实际问题的关键，也是研制农药复配剂的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有普通大蓟马防治技术的缺陷和不足，提供一种高效、无污染、无残留的具有协同增效作用的球孢白僵菌和乙基多杀菌素联用的杀虫药。本发明通过对球孢白僵菌和乙基多杀菌素复配效果进行研究发现，所述杀虫药复配后能够表现出显著的协同增效作用，提高防治效果，并可明显减低化学农药单剂的使用剂量、减少环境污染，有效解决现有农药易产生抗性、药效不明显等问题。

本发明基于多株球孢白僵菌对普通大蓟马具有一定生物防治效果的基础上，为了进一步寻求更好的防治效果，经过大量探究和探索实验发现，球孢白僵菌菌株SB063和乙基多杀菌素联用能够产生显著的协同增效作用，对蓟马类害虫具有显著的防治效果，最终完成本发明的。

因此，本发明首先提供一种球孢白僵菌和乙基多杀菌素联用的杀虫药，所述球孢白僵菌是球孢白僵菌菌株SB063，其保藏编号为GDMCC NO：61304；所述杀虫药用于防治普通大蓟马。该菌株SB063，最初在土壤中分离而来，为中国本土菌株，能很好地适应本地的自然环境。

优选地，上述杀虫药中，所述球孢白僵菌为球孢白僵菌孢子，可以是悬浮液，也可以是孢子粉。

更优选地，所述球孢白僵菌和乙基多杀菌素的用量比按照如下标准进行：球孢白僵菌的终浓度为1×10⁴～1×10⁷分生孢子/mL，优选为1×10⁵～1×10⁷分生孢子/mL，乙基多杀菌素的终浓度为0.625～10mg/L，优选为1.25～10mg/L；更优选为球孢白僵菌和乙基多杀菌素的比例为1×10⁵～1×10⁷分生孢子/mL：1.25～10mg/L，更优选为球孢白僵菌和乙基多杀菌素的比例为1×10⁵～1×10⁷分生孢子/mL：2.5～10mg/L，进一步优选为球孢白僵菌和乙基多杀菌素的比例为1×10⁵～1×10⁷分生孢子/mL：5～10mg/L。最优选，所述球孢白僵菌和乙基多杀菌素的比例为1×10⁶分生孢子/mL：5mg/L。

本发明进一步提供上述杀虫药在防治普通大蓟马害虫中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的杀虫剂中的球孢白僵菌SB063和乙基多杀菌素对普通大蓟马的毒杀作用产生了显著的协同增效作用，经长期的侵染生物学研究和室内生物测定，该球孢白僵菌与乙基多杀菌素的联合使用对普通大蓟马有很好的防治效果，且乙基多杀菌素对球孢白僵菌SB063的生长影响不大，兼容性好，因此在蓟马类害虫的生物防治中具有非常强的应用潜力。由于本发明的杀虫药防治效果好，因而可减少化学农药使用量，兼具低毒、抗药性低的特点，适应了有机食品生产的需求，对环境无污染、无残留，有利于延缓蓟马类害虫抗药性的发生和发展。

其中，本发明的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)SB063，已于2020年11月20日在广东省微生物菌种保藏中心(地址：中国广东广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)进行了保藏，其保藏编号是GDMCC No：61304。

附图说明

图1SB063菌落形态图。其中，左图和右图为SB063菌落正面图和背面图。

图2SB063孢子形态图。

图3分子鉴定中PCR扩增产物电泳图。

图4分子系统树。

图5乙基多杀菌素对菌株SB063菌落生长的影响。

图6啶虫脒对菌株SB063菌落生长的影响。

图7乙基多杀菌素对菌株SB063孢子萌发率的影响。

图8啶虫脒对菌株SB063孢子萌发率的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。本发明实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1高毒力菌株的筛选

1.1供试昆虫

普通大蓟马于2017年采自广东省广州市增城区朱村豇豆田，采回后在RXZ-500C型智能人工气候箱(宁波江南仪器厂)内用豇豆豆荚饲养，饲养条件为温度(26±5)℃，光照周期12L:12D，相对湿度(70±5)％。

1.2供试菌株

列出供筛选的菌株均属于球孢白僵菌(Beauveriabassiana)菌，均保藏于华南农业大学生物防治教育部工程研究中心，具体如下：SP433、SB036、SB062、SB037、SB015、SB063、SB051、SB041、SB004、SB043、SP016、SB038、SB050、SB006。

其中，对于SB063和SB038还进行了用于专利程序的生物材料保藏。其中，涉及菌株SB038的发明内容将提出另外一个专利申请。

1.3实验方法

1.3.1孢子悬浮液的配制

在PDA平板上26±1℃培养7d后，充分产孢的虫生真菌分生孢子用0.05％吐温-80无菌水洗脱孢子，用磁力搅拌器搅拌，再置于摇床180rpm25℃振荡培养25min后用双层擦镜纸过滤，用血球计数板计数，测量母液的浓度，配制成1×10⁸孢子/mL的孢子悬浮液。

1.3.2虫生真菌对普通大蓟马的毒力测定

将配制好的孢子悬浮液置于15ml离心管中，挑取普通大蓟马雌成虫20头浸泡菌液10s，然后放至有1cm豆角(两端无孔)的35mm的培养皿中，保鲜膜封口，扎孔，置于人工气候箱中，以0.05％吐温-80无菌水为空白对照，每个处理重复4次，连续7d记录其死亡率。

将筛选出的高毒力菌株，用0.05％吐温-80无菌水配制为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴孢子/mL的孢子悬浮液，以同样的生测方法测定其死亡率。

1.3.3数据处理

利用SPSS19.0软件进行试验处理分析，采用单因素方差分析对各结果进行分析，并运用Tukey检验差异显著性。

1.2实验结果

实验结果显示，不同菌株孢子悬浮液对普通大蓟马的致病力差异显著，菌株SB038和菌株SB063显著高于其他菌株(表1)，普通大蓟马雌成虫的死亡率随着浓度和处理时间的增加而上升，当浓度为1×10⁸孢子/mL时SB038和SB063在第7d的累计死亡率分别为91.07％和83.33％，显著高于其他浓度。

结果表明，菌株SB038和SB063对普通大蓟马均有较好致死效果，属于潜在优良生防。对这两个菌株进行不同浓度、不同处理时间致病力的测试，其结果分别如表2和表3所示。

表1不同菌株对普通大蓟马的校正死亡率(％)

注:经Tukey检验,同一列的不同小写字母表示不同菌株间致病力差异显著(P＜0.05)。

表2 SB063菌株不同浓度对普通大蓟马的校正死亡率(％)

表3 SB038菌株不同浓度对普通大蓟马的校正死亡率(％)

注:经Tukey检验,同一列的不同小写字母表示不同菌株间致病力差异显著(P＜0.05)

实施例2菌株SB063的鉴定

(1)菌株SB063的采集

菌株SB063最初于2010年在贺兰山脉中部哈拉乌树下土壤中分离而来，为中国本土菌株。

采集土壤样品，采样时取表土下10～15cm处土壤100g左右，用塑料袋封装后带回实验室处理。土壤样品过筛去掉石粒和杂物，然后取净土10g悬浮于90mL 0.1％的吐温-80溶液中，摇匀，静置15min，取其上清液2mL稀释于8mL 0.05％吐温-80中，配制为土壤悬浮液。将0.1mL土壤悬浮液接种于孟加拉红琼脂培养基平板上，用三角玻璃刮子将悬浮液推匀于平板表面下，25℃培养3～7d，然后用接种环切取单菌落，接种于PDA板上继续培养，得到球孢白僵菌菌株SB063。切取菌丝块移植于PDA斜面，继续培养，4℃下保藏于冰箱中。

(2)形态鉴定

菌株SB063在PDA平板上，25℃，10天，菌落直径为52.17mm，表面白色，菌落厚粉末状，多个同心圆，背面淡黄色(图1)；菌株SB063的孢子卵圆形和近球形，孢子直径1.9-2.3μm(图2)。

(3)分子生物学鉴定

采用CTAB法提取DNA，包括以下步骤：

(a)将菌株SB063在PDA平板上培养一周后，小心刮取菌丝体于研钵中，加入液氮迅速充分研碎；

(b)取适量研碎的菌丝体迅速转移到离心管中，加入300μL经65℃预热的DNA提取液裂解液，充分混匀，加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)混合液混匀，65℃下水浴1h，10min左右轻轻震荡一次，12000rpm常温条件下离心5min；

(c)缓慢吸取上清液于另一新离心管中，缓慢加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)混合液进行再次抽提，12000rpm常温条件下离心5min；

(d)缓慢吸取上清液于另一新离心管中，加入1/10体积的醋酸钠，等体积预冷的异丙醇，室温静止15min；

(e)加入70％乙醇洗涤沉淀2次；

(f)移液枪紧贴管壁缓慢吸出乙醇，置于超净工作台内吹干；

(g)所得沉淀溶于50μL的TE中；

(h)用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，其余提取物置于-20℃条件下保存。

真菌DNA的PCR所用引物是针对Bloc基因的通用引物：B5.1F：5’-cgacccggccaactactttga-3’和B3.1R：5’-gtcttccagtaccactacgcc-3’。扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。

50μL反应体系如下：

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(含EB)，缓冲液为1×TAE，电压150V、电流220mA，Marker DL2000作为分子量标准参照物，电泳结束后，在凝胶成像仪上检测并拍照记录。

特异性PCR产物委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。序列比对与发育树构建：测序结果用BLAST搜索同源性较高的相关序列，使用MEGA5.1软件中的ClusterW进行序列比对和多重序列比对。并在该软件中构建Neighbour-joining(NJ)系统发育树。

鉴定结果

(1)如图3所示，每个泳道的电泳条带比较清晰，可以根据PCR产物的迁移距离来准确判断该菌株的基因片段约为600bp，其中仅显示编号1至24的菌株，而编号22为SB063菌株。

(2)将得到的该菌株基因型的Bloc序列和从GenBank下载的3株白僵菌菌株相关序列组合，构建分子系统树，结果如图4所示，SB063菌株属于Beauveria bassiana，为球孢白僵菌。

综合形态学特征与生理生化特性鉴定结果显示，该菌株属于球孢白僵菌属，命名为SB063，保藏在广东省微生物菌种保藏中心。。

实施例3不同农药对普通大蓟马的毒力测定

采用药膜法，配制不同浓度梯度的农药，将5cm的离心管(扎孔)在药液中浸泡2h，1cm豆角(两端无孔)在药液中浸泡10s，自然晾干，然后挑取普通大蓟马雌成虫20头至放有豆角的离心管中，每个浓度设4个重复在培养箱中饲养，观察2天，记录其死亡率。

利用SPSS19.0软件进行实验数据处理分析，采用单因素方差分析生物/化学农药对蓟马毒力结果分析，并运用Tukey检验差异显著性，筛选高毒力农药。

结果表明：不同浓度的5种生物化学农药处理普通大蓟马后，其校正死亡率随着浓度的增加而增加，其中乙基多杀菌素浓度为20mg/L时，其死亡率高达91.25％，远超其他4种药剂的死亡率。高效氯氟氰菊酯浓度为500mg/L时，其死亡率仅为31.25％，5种生物化学农药对普通大蓟马的毒力差异显著，从其对普通大蓟马的致死中浓度来看(表)，乙基多杀菌素的LC₅₀值较低，为4.2935mg/L，具有较高的毒力，啶虫脒其次。因此后续选择乙基多杀菌素、啶虫脒与白僵菌复配。

不同药剂对普通大蓟马的致死中浓度(LC₅₀)

实施例4农药和白僵菌SB063相容性研究

1材料与方法

1.1供试菌株

白僵菌SB063。

1.2供试药剂

乙基多杀菌素、啶虫脒。

1.3供试培养基

沙式培养基(Sabouraud dextrose agar,SDA)：蛋白胨10g、琼脂20g、葡萄糖40g，加入蒸馏水定容至1000mL，121℃，30min高压蒸汽灭菌。

1.4不同浓度孢子悬浮液的配制

将白僵菌SB063菌株接种于PDA培养基上，置于生化培养箱内26℃下活化10d，挑选活性强的分生孢子再次接种于PDA平板并在生化培养箱内扩繁培养7d，待大量产孢后，用0.05％吐温-80无菌水洗脱孢子，磁力搅拌器搅拌，灭菌后的双层脱脂纱布过滤，在生物显微镜下镜检，血球计数板计数，配制浓度为1×10⁸孢子/mL的母液孢子悬浮液，再依次稀释成1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴孢子/mL的悬浮液备用。

1.5农药对白僵菌SB063菌株菌落生长的影响

将配制好的PDA培养基中加入乙基多杀菌素或啶虫脒，倒完平板后置于超净工作台紫外照射2h，配制成合适浓度梯度的含药PDA培养基平板。取活化后菌丝生长均匀的高毒力菌株一皿，打孔器打制成5mm的菌饼并置于含药PDA培养基平板中间进行接种，在生化培养箱内26℃条件下培养，每天用十字交叉法测定菌落直径，共测定7天。每个处理设置10个重复，以添加无菌水的培养基作为空白对照。

1.6农药对白僵菌SB063菌株孢子萌发率的影响

将配制好的SDA液体培养基中加入乙基多杀菌素或啶虫脒并置于超净工作台紫外照射2h，配制成合适浓度梯度的含药SDA液体培养基。将活化后的高毒力菌株配制成1.0×10⁶孢子/mL的孢子悬浮液，并加入2mL于50mL不同浓度的含药SDA液体培养基中，置于摇床180rpm 25℃振荡培养3d，每天于超净工作台内取样，在血球计数板上镜检菌株孢子萌发情况，计算其孢子萌发率。每个处理设置3个重复，以添加无菌水的培养基作为空白对照。

1.7数据统计与分析

利用SPSS 19.0软件进行试验数据分析，并运用Tukey检验差异显著性。用GraphPad Prism6和Excel绘制图表。

2结果与分析

2.1农药对白僵菌SB063菌株菌落生长的影响

结果显示，不同浓度乙基多杀菌素处理白僵菌SB063后，菌株直径随着浓度的增加而减小，且差异显著(图5)。在处理3d后，高浓度药剂处理后菌株菌落直径小于空白对照(17.0mm)，0.625、1.25、2.5、5和10mg/L浓度的乙基多杀菌素处理的白僵菌SB063，菌落直径分别为17、16、16、15.5、16mm。在处理7d后，0.625、1.25、2.5、5和10mg/L浓度的乙基多杀菌素处理的白僵菌SB063，菌落直径分别为32.5、32、32、30、30mm，低浓度处理与空白对照无显著差异(32.5mm)。

而不同浓度啶虫脒处理白僵菌SB063后，菌株直径随着浓度的增加而减小，且差异显著(图6)。在处理3d后，不同浓度药剂处理后菌株菌落直径均小于空白对照(18mm)，12.5、25、50、100和200mg/L浓度的啶虫脒处理的白僵菌SB063，菌落直径分别为17、17.5、17、16.5、16mm。在处理7d后，12.5、25、50、100和200mg/L浓度的啶虫脒处理的白僵菌SB063，菌落直径分别为28、26、26、27、21mm，低于空白对照(30mm)。

2.2乙基多杀菌素对白僵菌SB063菌株孢子萌发率的影响

试验结果表明，乙基多杀菌素处理白僵菌SB063后对菌株孢子萌发率的较小，与空白对照无显著差异(图7)。处理3天后，0.625、1.25、2.5、5和10mg/L浓度的乙基多杀菌素处理的白僵菌SB063，菌株孢子萌发率分别为92.19％、92.50％、92.52％、92.22％、90.48％，与空白对照无显著差异(93.51％)。

而啶虫脒处理白僵菌SB063后对菌株孢子萌发率的较小，与空白对照无显著差异(图8)。处理3天后，12.5、25、50、100和200mg/L浓度的啶虫脒处理的白僵菌SB063，菌株孢子萌发率分别为94.83％、92.23％、93.78％、94.91％、85.21％，低浓度处理与空白对照无显著差异(95.83％)，高浓度200mg/L与空白对照差异显著。

综上所述：乙基多杀菌素相比啶虫脒对菌株的影响较小。在本试验中，处理3d后，各浓度(0.625、1.25、2.5、5和10mg/L)乙基多杀菌素对白僵菌SB063的孢子萌发与空白对照相比没有显著差异；而啶虫脒高浓度200mg/L处理与空白对照差异显著。菌落生长处理7d后，低浓度(0.625、1.25、2.5mg/L)乙基多杀菌素对白僵菌SB063的菌落生长与空白对照相比无显著差异；而各浓度(12.5、25、50、100和200mg/L)啶虫脒对白僵菌SB063的菌落生长与空白对照相比差异显著。因此，乙基多杀菌素相容性好，可用于后续试验。

实施例5球孢白僵菌SB063和乙基多杀菌素对普通大蓟马防治的协同作用

3.1材料与方法

3.1.1供试虫源

普通大蓟马同1.1。

3.1.2供试菌株

SB063。

3.1.3杀虫剂对普通大蓟马的毒力测定

采用药膜法，配制不同浓度梯度的农药，将5cm的离心管(扎孔)在药液中浸泡2h,1cm豆角(两端无孔)在药液中浸泡10s,自然晾干，然后挑取普通大蓟马雌成虫20头至放有豆角的离心管中，每个浓度设4个重复在培养箱中饲养，观察2天，记录其死亡率。

3.1.4高毒力菌株与乙基多杀菌素两者复配剂对普通大蓟马的毒力测定方法

分别配制0.625、1.25、2.5、5、10mg/L的乙基多杀菌素与1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷孢子/mL的高毒力菌株孢子悬浮液备用，在把配制的各浓度乙基多杀菌素分别与各浓度菌株两两组合，进行毒力测定。毒力测定方法同1.3.2。

3.1.5数据统计与分析

利用SPSS19.0软件进行试验数据处理分析，采用单因素方差分析对普通大蓟马死亡率进行结果分析，并运用Tukey检验差异显著性。数据计算公式参照Huangetal.(2013)，具体公式如下：

Me＝Ma+Mb×(1-Ma)

公式中，各项含义如下：

Ma：乙基多杀菌素单独对普通大蓟马的实际校正死亡率；

Mb：高毒力菌株单独对普通大蓟马的实际校正死亡率；

Mab：菌药复配剂对普通大蓟马的实际校正死亡率；

Me：菌药复配剂对普通大蓟马的期望死亡率；

根据公式，分别计算出菌药复配剂的χ2值，在χ2表格中查找df＝1对应的P值为3.841。

当计算得的χ2＜3.841，则表示菌株和乙基多杀菌素复配表现出拮抗作用；

当计算得的χ2＞3.841，则表示菌株和乙基多杀菌素复配表现出协同增效作用。

3.2实验结果

白僵菌SB063与乙基多杀菌素协同作用对普通大蓟马的毒力结果：单独使用不同浓度的乙基多杀菌素(0.625、1.25、2.5、5、10mg/L)处理普通大蓟马，第2d的校正死亡率分别为11.25％、28.75％、37.5％、45％、66.25％；单独使用不同浓度的球孢白僵菌(1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷孢子/mL)处理普通大蓟马，第7d的校正死亡率分别为23.67％、26.67％、38.33％、65％。

而不同浓度乙基多杀菌素与不同浓度球孢白僵菌复配对普通大蓟马的致死率显著高于各单剂(表3)。在乙基多杀菌素和球孢白僵菌SB063联合作用对普通大蓟马的毒力测定中，各浓度乙基多杀菌素与1×10⁵孢子/mL球孢白僵菌SB063以及5mg/L与1×10⁶孢子/mL球孢白僵菌复配剂表现出协同增效作用。在处理7d后，在增效组合中，死亡率最高的复配剂为10mg/L的乙基多杀菌素与1×10⁵孢子/mL白僵菌SB063，为92.37％。综合用药剂量以及实验数据，推荐使用5mg/L的乙基多杀菌素与1×10⁶孢子/mL白僵菌SB063，死亡率为83.33％。

表3白僵菌SB063与乙基多杀菌素协同作用对普通大蓟马的毒力

注：表中数据为平均值±标准误，经Tukey检验，不同小写字母表示同一时间不同组合浓度间差异显著(P＜0.05)，括号内的数值表示计算得到卡方值χ²，*表示具有协同增效作用的组合。

Claims

1.一种含有乙基多杀菌素和球孢白僵菌作为有效成分联用的杀虫药，所述球孢白僵菌是球孢白僵菌菌株SB063，其保藏编号为GDMCC NO：61304；所述杀虫药用于防治普通大蓟马；所述球孢白僵菌和乙基多杀菌素的用量比按照如下标准进行：球孢白僵菌的终浓度为1×10⁴~1×10⁷分生孢子/mL，乙基多杀菌素的终浓度为0.625~5 mg/ L。

2.如权利要求1所述的杀虫药，其特征在于，所述球孢白僵菌为球孢白僵菌孢子的悬浮液或孢子粉形式。

3.如权利要求2所述的杀虫药，其特征在于，所述球孢白僵菌和乙基多杀菌素的用量比按照如下标准进行：球孢白僵菌的终浓度为1×10⁵~1×10⁷分生孢子/mL，乙基多杀菌素的终浓度为1.25~5 mg/ L。

4.如权利要求3所述的杀虫药，其特征在于，所述为球孢白僵菌和乙基多杀菌素的比例为1×10⁵~1×10⁷分生孢子/mL：2.5~5 mg/ L。

5.如权利要求4所述的杀虫药，其特征在于，所述球孢白僵菌和乙基多杀菌素的比例为1×10⁵~1×10⁷分生孢子/mL：5 mg/ L。

6.如权利要求5所述的杀虫药，其特征在于，所述球孢白僵菌和乙基多杀菌素的比例为1×10⁶分生孢子/ mL：5 mg/ L。

7.如权利要求1至6任一项所述的杀虫药在防治普通大蓟马害虫中的应用。