CN103290000B - 生防绿木霉的scar标记及其应用和定量检测方法 - Google Patents

Abstract

生防绿木霉的SCAR标记及其应用和定量检测方法，属于生物工程技术领域。该标记序列如SEQ ID NO：1所示。本发明是利用RAPD技术分析绿木霉菌株SS161及其同种、属的12个菌株，成功筛选到绿木霉菌株SS161的特异性片段并将其回收、测序后，克隆得到绿木霉菌株SS161的SCAR标记。基于该序列设计荧光定量PCR引物及TaqMan探针，通过不断的优化成功建立开发了生防绿木霉菌株SS161的实时定量PCR检测方法。本发明可用于生防绿木霉菌株SS161的鉴定、跟踪检测，为研究木霉土壤等自然环境的生态适应性和生产实际中判断是否适用木霉生防菌提供一种简便、高效的方法，具有重要的研究及应用价值。

Description

生防绿木霉的 SCAR 标记及其应用和定量检测方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及生防绿木霉的SCAR标记及其应用和定量检测方法。

背景技术

木霉菌（Trichoderma spp.）广泛分布于土壤中，是一类重要的生防真菌，在作物土传、种传病害防治上潜力巨大。木霉菌因其在酶、抗生素及生防等方面的重要的经济生产价值而得到世界广泛的研究和关注。自从1932年木霉菌的菌寄生现象被发现以来（Weindling等，1932），关于木霉菌生防特性的研究越来越多。据报道，该属真菌至少对18个属20余种病原真菌和多种病原细菌有拮抗作用，已在世界范围内被成功用于植物病害防治（陈捷等，2011）。迄今为止，已有百余种木霉制剂问世，年销售额高达2.5亿美元，施用区域已及五大洲60多个国家和地区（陈捷等，2011， Lorito et al., 2010）。木霉已经广泛用于蔬菜、花卉、草坪、运动草皮、中药材、果园等经济作物及花生、大豆、棉花等旱作大田作物的土传病害防治上（Ding等，2003；孙虎等，2011；Harman等，2010）。绿木霉SS161是从土壤中分离的一株生防菌株，该菌株对腐霉（Pythium）、绵霉（Achlya）、疫霉（Phytophthora）、镰刀菌（Fusarium）和丝核菌（Rhizoctonia）等常见土传、种传病害的多属病原菌都有较好的抑制效果，其在土传、种传病害防治上潜力巨大、前景广阔。

SCAR(Sequence—characterized Amplified Region，SCAR）分子标记是在RAPD技术基础上发展起来的一种分子标记技术。SCAR标记是将目标 RAPD 片段进行克隆并对其末端测序，根据 RAPD 片段两端序列设计特异引物，对基因 DNA 片段再进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。该标记具有方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高等优点,被广泛用于分子标记辅助选择、基因连锁定位、高密度遗传图谱构建、植物品种和菌种鉴别等方面。

生防菌株能否取得成功，其对施用环境的生态适应能力是关键因素之一。一些生防菌株室内试验防效显著，而应用到田间却效果不甚理想，往往就是因为生防菌株无法适应田间环境造成生防菌株无法定殖。木霉多施于土壤用以土传病害的防治，而土壤生态系统自我修复能力很强，人为引入的微生物往往会因为无法存活，而数量锐减直至最终消失（Cook和Baker , 1983）。作为一种活体微生物制剂，木霉必须要在土壤和根际环境中很好地定殖，才能起到防治土传病害的作用。因此，木霉对土壤环境和根际环境的生态适应性是评价其生防性能的重要指标(Harman等,2004)，而种群数量动态是木霉对该环境的生态适应性的直接体现。掌握土壤中木霉的种群动态规律，可作为把握施用木霉时机、剂量的依据，为木霉防治策略的制定提供指导，可以提高木霉的生防效率。

尽管专门针对土壤中木霉种群动态的研究还比较少，但人们早已认识到其重要性(Beagle-ristaino, 1985)，摸索出了多种研究方法。平板计数法是常用的经典方法，该方法一般配合TSM（Trichoderma selective medium）(Elad等，1981)等选择性培养基使用，Lo等（1997）、Rudresh等（2005）和赵阿娜等（2006）以及大多数早期的研究都是采用这种方法。但是这种方法有着易受杂菌污染、不稳定和对研究人员木霉分类水平要求较高等缺点。利用苯菌灵（Benomyl）抗性木霉菌株可避免杂菌污染的问题，Ahmed和Baker（1988）报道了该方法，并用该方法对研究了木霉在根际微生态的适应能力。KOK等（1995）也利用该方法研究不同载体对木霉种群动态的影响。但由于苯菌灵抗性的木霉突变菌株种群动态变化未必和野生型木霉一致，这种方法容易惹来争议。随着分子生物学技术的发展， Green和Jensen（1995)和Bae和Knudsen（2000)分别提出利用转入GUS(β-glucuronidase)和GFP（Green fluorescent protein )等报告基因的木霉菌株研究土壤环境中木霉种群的动态的方法。由于转基因菌株的生存力的原因，这种方法更适合各因素精确控制的实验条件，且作为一种转基因菌株也会有是否和野生型木霉表现一致的争议。因此，利用野生菌株特有SCAR（Sequence characterized amplified regions）分子标记更适合用于木霉在土壤中的生态学研究。SCAR标记和荧光定量PCR技术相结合，可排除土壤中野生木霉菌和杂菌的影响，准确对引入的木霉生防菌株进行有效的定位和定量，是研究生防木霉种群动态的有利工具。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供生防绿木霉的SCAR标记及其应用和定量检测方法的技术方案。

所述的一种生防绿木霉SS161的SCAR标记，其特征在于该标记序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的一种生防绿木霉SS161的SCAR标记在鉴定及跟踪检测生防绿木霉SS161中的应用。

所述的一种用于扩增如权利要求1所述的一种生防绿木霉SS161的SCAR标记的引物对，其特征在于该引物对的上游引物TV163F序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物TV163R序列如SEQ ID NO：3所示。

所述的一种利用生防绿木霉SS161的SCAR标记进行绿木霉SS161定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）荧光定量PCR引物和TaqMan探针

根据生防绿木霉SS161的SCAR标记序列，设计荧光定量PCR引物和TaqMan探针，所述的生防绿木霉SS161的SCAR标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的荧光定量PCR引物上游引物Qtv163F序列如SEQ ID NO：4所示，所述的荧光定量PCR引物下游引物Qtv163R序列如SEQ ID NO：5所示，所述的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：6所示；

2）PCR反应体系和程序

PCR反应总体系为25μL，其中RealMasterMix Probe（购自TIANGEN生物公司）系统10μL，荧光定量PCR上下游引物终浓度为200～600nM, TaqMan探针浓度为100～300nM，Probe Enhancer solution （购自TIANGEN生物公司） 1.25μL, 待测DNA模板0.5～5μL，超纯水补足25μL；

PCR反应程序：95℃ 5min；然后，95℃15S, 60℃30S 共40个循环；

3）结果分析

根据实时定量PCR结果计算采集样品中木霉SCAR标记的拷贝数，木霉SCAR标记的拷贝数反映木霉菌的数量，其拷贝数的变化反映样品中木霉菌数量的变化，根据木霉SCAR标记的拷贝数计算出样品中木霉菌的相对含量，通过监测样品中SCAR标记拷贝数的变化，监测样品中木霉菌的动态变化。

本发明涉及的一种生防真菌绿木霉（Hypocrea virens）SS161，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日：2013年1月28日，保藏号：CGMCC No.7224。

本发明是利用RAPD（Random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA标记）技术分析绿木霉菌株SS161及其同种、属的12株木霉，成功筛选到绿木霉菌株SS161的特异性片段并将其回收、测序后，克隆得到绿木霉菌株SS161的SCAR标记。基于该序列设计荧光定量PCR引物及TaqMan探针，通过不断的优化成功建立开发了生防绿木霉菌株SS161的实时定量PCR检测方法。本发明可用于生防绿木霉菌株SS161的鉴定、跟踪检测，为研究木霉土壤等自然环境的生态适应性和生产实际中判断是否适用木霉生防菌提供一种简便、高效的方法，具有重要的研究及应用价值。

附图说明

图1为生防绿木霉SS161的鉴定图；

图2为SCAR标记序列拷贝数和Ct值的标准曲线；

图3为土壤中绿木霉种群动态变化；

图1中：M：100bp Ladder Marker；a-c：SS161 DNA不稀释，稀释100倍，稀释200倍；1-12：各对照菌株DNA模板。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：生防绿木霉（Hypocrea virens）SS161的分离鉴定

取0.5-1克育秧盘中腐烂稻草，加入200ml无菌水，120转每分钟，28摄氏度震荡30min，静置10min后，取100微升上清液涂改良型马丁培养基平板（配方：KH₂PO₄ 1克，葡萄糖10克，MgSO₄·7H₂O 0.5克，蛋白胨5.0克，1/3000孟加拉红水溶液100ml，加1000ml水，自然pH值，临用时加链霉素溶液至终浓度0.003% ，添加18克琼脂，灭菌），28℃黑暗培养至菌落长出，单胞分离纯化后，利用对峙培养法测试各菌株对多种病原真菌的拮抗作用，其中菌株SS161的拮抗作用最强，进行下一步研究。

该菌株具有以下生物学特性：

在PDA平板上生长迅速，24小时菌落直径可增长3cm，在PDA平板上的最适生长温度为30℃，气生菌丝卷毛装，白色至灰白色。菌落初无色，后由于分生孢子的产生逐渐变为绿色至墨绿色。菌落反面初无色，后逐渐变为暗黄色乃至黄褐色。菌丝透明，壁光滑，低龄培养物中即可见大量的厚垣孢子，大小为6.5-10.0×6.0-9.5μm。分生孢子梗半透明，多分枝，分枝多与孢子梗主轴呈直角。产孢细胞瓶形，内壁芽生瓶梗式产孢方式，瓶梗大小为6.5-9.5×3.0-4.5（最宽处）μm。分生孢子大量产生，墨绿色，呈椭球形，近圆形，大小为4.5-5.5×3.0-4.0μm。

该菌株rRNA基因序列如SEQ ID NO：7所示。该菌株转录延长因子的部分编码序列如SEQ ID NO：8所示。

综合菌株SS161培养特征、形态特征及rRNA基因和转录延长因子序列，该菌株被鉴定为绿木霉（Trichoderma virens），有性型为绿肉座菌（Hypocrea virens）。

实施例2：生防绿木霉SS161的SCAR标记筛选

本发明利用128条RAPD随机引物对SS161和12个对照菌株进行扩增。对照菌株，如下表所示。

PCR 扩增体系为20 μL，其中2.0 μL buffer （ 10 × ），1.5 μL 25 mmol/L MgCI₂，2.0 μL 1.0 mmol/L dNTP，2.4 μL 5 μmol/L 引物，0.4 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶，2.0 μL DNA （6 ng）。本试验采用RAPD引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR扩增条件为94℃预变性2 min后进入循环，94℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸2 min，40个循环后72℃延伸10 min。扩增反应完毕后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统上观察并拍照。

其中随机引物OST-06（5’ GTCTACGGCA 3’）在菌株SS161上扩增出1条400bp左右的条带，而其它各对照均不能扩增出该条带，该条带即为菌株SS161的特异条带。

紫外灯下切下该条带，利用琼脂糖DNA提取试剂盒，回收该片段，和pMD-18T载体连接后，转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取取阳性克隆送交上海生工生物测序，根据测序结果设计特异性引物对：

上游引物TV163F：5’GCTTTCGTTGCGTTTTGACC 3’，该序列如SEQ ID NO：2所示；

下游引物TV163R：5’CCAGTACCGTTCTGGCGC 3’， 该序列如SEQ ID NO：3所示；

并利用该引物对成功在菌株SS161上扩增到长度约为360bp的片段，经DNA测序后，该序列即为本发明所述SCAR标记序列，序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例3：生防绿木霉SS161的鉴定

（1）该实例所选用的对照木霉菌株：

选择对照菌株共12个，其中T.virens 菌株4个，T.viride菌株3个，T.harzianum菌株2个，T. atroviride菌株2个，T.hamatum菌株1个，如实施例2表中所示。

（2）合成生防绿木霉SS161 SCAR标记鉴定引物对

上游引物TV163F：5’GCTTTCGTTGCGTTTTGACC 3’，该序列如SEQ ID NO：2所示；

下游引物TV163R：5’CCAGTACCGTTCTGGCGC 3’， 该序列如SEQ ID NO：3所示；

引物由上海博尚生物合成。

（3）PCR扩增反应

反应体系为：

DNA模板 1μL

上游引物（12.5μM） 0.5μL

下游引物（12.5μM） 0.5μL

dNTP mixture（2.5mM each） 2μL

Taq DNA 聚合酶 0.5μL

Reaction Buffer（10X） 2μL

ddH2O 13.5μL

总体积 20μL

PCR扩增程序为：

94℃预变性5min；然后进行以下循环：94℃变性20s；60℃退火30s；72℃延伸45s，进行30个循环；最后72℃延伸10min，10℃保温。

PCR产物鉴定：

通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测有无适当大小的目的条带并利用凝胶成像系统拍摄电泳图片。

（4）实施结果分析

提取各菌株DNA，以之为模板，利用引物对TV163F/TV163R进行PCR反应。菌株SS161都检测出长度约为380bp的PCR产物，与SCAR标记片段的理论长度相符，且模板稀释100,200倍仍然能扩增出该长度PCR产物，其它各菌株均没有扩增出该长度的PCR产物（如图1）。由此说明利用SCAR标记鉴定菌株SS161灵敏度和准确度都很高。

实施例4：绿木霉菌株SS161在土壤中的动态检测

1.标准曲线的建立

利用实施例3所述PCR反应体系扩增绿木霉标记，将目标片段和PMD-18T连接，转化大肠杆菌，经测序验证无误后。提取重组质粒，利用分光光度计检测质粒浓度，并根据下列公式计算质粒拷贝数：

注：阿伏伽德罗常数为6.02×10²³

碱基平均分子量为660

根据计算得出的拷贝数将此质粒溶液分别按倍比依次稀释成10²到10⁷拷贝共6个浓度的标准溶液，用于绘制标准曲线。

根据定量PCR体系分别测定各标准溶液的Ct值，根据各浓度标准溶液的SCAR标记拷贝数和Ct值完成标准曲线的绘制（图2）。所述的定量PCR体系为：PCR反应总体系为25μL，其中RealMasterMix系统10μL，上下游引物终浓度为200～600nM, 探针浓度为100～300nM，Probe Enhancer solution 1.25μL, 待测DNA模板0.5～5μL，超纯水补足25μL；PCR反应程序：95℃ 5min；然后，95℃15S, 60℃30S 共40个循环；

拷贝数计数公式为y=38.17-3.347x，相关系数R²值可达到0.993,表明该方法在此检测范围内表现出较好的线性关系，定量结果有较高的准确性和可重复性。

2.绿木霉SS161孢子的准备

将绿木霉菌株SS161接种PDA平板培养7-10天，用无菌水洗下分生孢子，经过滤后调整浓度至孢子浓度为2×10⁸ /ml备用。

3.土壤样品的采集

取菜园土，晒干后过2mm筛，121^oC高压灭菌4小时后，烘干冷却后，按比例加入绿木霉SS161孢子悬浮液至分生孢子浓度为5×10⁷/g干土并混匀，不加孢子悬浮液的土壤用作对照。放置在温室培养，期间加水保持土壤湿润。分别于培养3,10,17,24,31,38，45天后采集土壤样品。

4.土壤样品DNA的提取

利用FastDNA™ Spin Kit for Soil（MP bio公司, www.mpbio.com）提取土壤样品DNA，具体方法参照试剂盒说明书。

5.土壤样品中木霉定量检测

分别采用两种方法，一种是经典的基于木霉选择性培养基的稀释平板计数法，一种是本发明所述基于实时定量PCR的定量检测方法，检测采集土壤样品木霉的含量。

稀释平板计数法：去1g土壤样品，放入100ml加入含0.01%吐温80的无菌水，震荡混匀20分钟后，稀释成不同浓度后，涂布木霉选择性培养基平板（杨合同，2005），培养至木霉菌落长出，菌落计数。

本发明所述基于实时定量PCR的定量检测方法：

提取的土壤DNA稀释十倍用作PCR模板。所用荧光定量引物和探针组合为：

上游引物：Qtv163F: 5’ AGCCGGGTAGAGTGGTTAGACAA 3’，该序列如SEQ ID NO：4所示；

下游引物：Qtv163R：5’ CCCTACCCCCTCCAGCCTTT 3’， 该序列如SEQ ID NO：5所示；

探针：Qtv163P：FAM- AATCACTTACACCGCAGCGAGACCGAG-TAMRA，该序列如SEQ ID NO：6所示；

6. PCR反应体系和程序

PCR反应总体系为25μL，其中RealMasterMix Probe（购自TIANGEN公司）10μL，上下游引物终浓度为200～600nM, 探针浓度为100～300nM，Probe Enhancer solution （购自TIANGEN公司）1.25μL, DNA模板0.5～5μL，超纯水补足25μL。

PCR反应程序：95^oC 5min；然后，95 ^oC 15S, 60 ^oC 30S 共40个循环。

根据实时定量PCR结果计算采集样品中SCAR标记的拷贝数。

7.土壤中绿木霉种群的动态分析

以第三天采集样品中木霉的含量为100%，分别用两种方法检测各土壤样品中绿木霉相对含量，得到的不同时期绿木霉的种群变化，如图3所示。空白对照采用两种方法都不能检出绿木霉。

8.实施结果分析

由绿木霉种群动态变化监测结果可知，本发明所述基于实时定量PCR的定量检测方法可以测得绿木霉的动态，且动态变化趋势和经典的稀释平板法大致相同。然而，跟经典的稀释平板法相比，本发明所述定量检测方法有着简便、快速、对操作人员技能要求更低的优势，可以预见该方法将会取代稀释平板法成为木霉种群监测的重要手段。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水稻研究所

<120> 生防绿木霉的SCAR标记及其应用和定量检测方法

<130> 11

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 383

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gctttcgttg cgttttgacc cgaccaggat cgaacggcgc cgggactggg ataaggcccg 60

tatttaaaaa aatcactcag atgatctgag acacaaccta cttaatctag gacgtattta 120

gagttagtgt acgtactagt gccgttgttg gtgggtttgc tggattccga gacagccggg 180

tagagtggtt agacaataat cacttacacc gcagcgagac cgagctaaag gctggagggg 240

gtagggaggg gcgcgaagct ctccccaagc cgcattggtt gctgagggcc ggacccgatg 300

tgcgcggccg cgcgggggct atatggactt tcgaagactc gatatcaaac agatcaccaa 360

gtcttgcgcc agaacggtac tgg 383

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gctttcgttg cgttttgacc 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ccagtaccgt tctggcgc 18

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

agccgggtag agtggttaga caa 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ccctaccccc tccagccttt 20

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

aatcacttac accgcagcga gaccgag 27

<210> 7

<211> 614

<212> DNA

<213> 生防绿木霉SS161

<400> 7

tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta ccgagtttac aactcccaaa cccaatgtga 60

acgttaccaa actgttgcct cggcgggatc tctgccccgg gtgcgtcgca gccccggacc 120

aaggcgcccg ccggaggacc aaccaaaact cttattgtat accccctcgc gggtttttta 180

ctatctgagc catctcggcg cccctcgtgg gcgtttcgaa aatgaatcaa aactttcaac 240

aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga 300

attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccgc cagtattctg 360

gcgggcatgc ctgtccgagc gtcatttcaa ccctcgaacc cctccggggg gtcggcgttg 420

gggatcggcc ctttacgggg ccggccccga aatacagtgg cggtctcgcc gcagcctctc 480

ctgcgcagta gtttgcacac tcgcatcggg agcgcggcgc gtccacagcc gttaaacacc 540

ccaaacttct gaaatgttga cctcggatca ggtaggaata cccgctgaac ttaagcatat 600

caataagcgg agga 614

<210> 8

<211> 916

<212> DNA

<213> 生防绿木霉SS161

<400> 8

atgggtaagg aggacaagac tcacatcaac gtggtcgtca tcgtacgtat tatcccacca 60

ctttcgtcgg catcgtccgc cgctctgact ctggaacatt tgtgctaacc accgtcctct 120

aggggtgcgt attccgtcca tcatcatgaa tgagatcgat cgaacacaat actgacttgc 180

gacaacagcc acgtcgactc cggcaagtcg accaccgtga gttacaccct ctgcctctcg 240

cctccgcatc aaacgttgcc gtttgatgcg gggagtctac gcttttgaat acacagctaa 300

ccattcgcca tacagactgg tcacttgatc taccagtgcg gtggtatcga caagcgtacc 360

atcgagaagt tcgagaaggt gagctcaatc aactgctttc gcatcaattt ccccttcaca 420

ttcaattgtg ctcgacaatt ctgttcagaa tcatcgaggc aacaattttt tcgtcacccc 480

gctttcgttc cattacccct cctttgcagc gacgcaaaat tttttgctgc ctctggtttt 540

tagtgggggt gcaccagcaa ccccaccact acctcgctgc tctttgccat cgtctaccac 600

ttcccagtcc tcattcaacg atctgtgtct cgttatttgc agcgatgcta accaccgttc 660

cctcaacagg aagccgccga actcggcaag ggttccttca agtacgcttg ggttcttgac 720

aagctcaagg ccgagcgtga gcgtggtatc accatcgaca ttgccctgtg gaagttcgag 780

actcccaagt actatgtcac cgtcattggt atgtctcgtc ccattcatcc agcccccgca 840

aaccagtgct aaccaggacc tcacagacgc ccccggccac cgtgatttca tcaagaacat 900

gatcactggt acctcc 916

Claims (4)

1.一种生防绿木霉SS161的SCAR标记，其特征在于该标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的一种生防绿木霉SS161的SCAR标记在鉴定及跟踪检测生防绿木霉SS161中的应用，所述的生防绿木霉SS161的保藏号为：CGMCC No.7224。

3.一种用于扩增如权利要求1所述的一种生防绿木霉SS161的SCAR标记的引物对，其特征在于该引物对的上游引物TV163F序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物TV163R序列如SEQ ID NO：3所示。

4.一种利用生防绿木霉SS161的SCAR标记进行绿木霉SS161定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）荧光定量PCR引物和TaqMan探针

根据生防绿木霉SS161的SCAR标记序列，设计荧光定量PCR引物和TaqMan探针，所述的生防绿木霉SS161的SCAR标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的荧光定量PCR引物上游引物Qtv163F序列如SEQ ID NO：4所示，所述的荧光定量PCR引物下游引物Qtv163R序列如SEQ ID NO：5所示，所述的TaqMan探针序列如SEQ ID NO：6所示；

2）PCR反应体系和程序

PCR反应总体系为25μL，其中RealMasterMix 10μL，荧光定量PCR上下游引物终浓度为200～600nM, TaqMan探针浓度为100～300nM，Probe Enhancer solution 1.25μL, 待测DNA模板0.5～5μL，超纯水补足25μL；

PCR反应程序：95℃ 5min；然后，95℃15S, 60℃30S 共40个循环；

3）结果分析

根据实时定量PCR结果计算采集样品中木霉SCAR标记的拷贝数，木霉SCAR标记的拷贝数反映木霉菌的数量，其拷贝数的变化反映样品中木霉菌数量的变化，根据木霉SCAR标记的拷贝数计算出样品中木霉菌的相对含量，通过监测样品中SCAR标记拷贝数的变化，监测样品中木霉菌的动态变化；

所述的生防绿木霉SS161的保藏号为：CGMCC No.7224。