CN104846064A - 一种早期检测杨梅是否发生凋萎病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种早期检测杨梅是否发生凋萎病的方法，其特征在于，该方法包括：对杨梅组织的DNA进行定量扩增，如果每100ng的植物组织DNA中可以检测的异色拟盘多毛孢或/和小孢拟盘多毛孢的拷贝数大于1X10⁶，则表示该杨梅树在将来一定会发生凋萎病，如果每100ng的植物组织DNA中可以检测的异色拟盘多毛孢或/和小孢拟盘多毛孢的拷贝数小1X10⁵，则表示该杨梅树在将来不会发生凋萎病。使用本发明的方法，可以早起鉴定杨梅树是否具有发生凋萎病的风险，通过DNA的拷贝数的多少预测杨梅树凋萎病的发生风险，可以提前预测凋萎病的发生，采取及时有效的防治措施。

Description

一种早期检测杨梅是否发生凋萎病的方法

技术领域

本发明属于植物疾病诊断领域，特别的属于一种早期检测杨梅是否发生凋萎病的方法。

背景技术

杨梅（Myrica rubra Sieb.Et Zucc.）是我国南方特有的珍稀水果，果实甜酸适口，风味独特，在国内外享有盛誉，因其显著的经济与生态效益，已成为浙江省主要水果种类，其产值已稳居各类水果首位。杨梅凋萎病是近年来新发现的一种病害，发病初期杨梅部分嫩梢干枯，随病情加重，嫩梢干枯数量逐渐增多并蔓延至全树，发病后3-5年整株死亡。杨梅凋萎病在浙江省杨梅主产区呈迅速蔓延趋势，严重影响杨梅产业的可持续发展（求盈盈等2011）。杨梅凋萎病病原菌为异色拟盘多毛孢（Pestalotiopsis versicolor）和小孢拟盘多毛孢（P.microspora），病菌主要定殖于杨梅枝干以及枝的韧皮部。

一般，在杨梅出现枯枝或者出现大量枯枝的时候，在杨梅发病的组织中已经存在大量的病原菌。这个时候，如果采取施加药剂进行防治，已经起不到很好的效果。这就需要早期进行杨梅凋萎病菌的检测，提早进行凋萎病的有效进行防治，减少损失。

发明内容

本发明提供一种早期检测杨梅是否发生凋萎病的方法，该方法包括：对杨梅的组织的DNA进行定量扩增，如果每100ng的植物组织DNA中可以检测的异色拟盘多毛孢或/和小孢拟盘多毛孢的拷贝数大于1X10⁶，则表示该杨梅树在将来一定会发生凋萎病，如果每100ng的植物组织DNA中可以检测的异色拟盘多毛孢或/和小孢拟盘多毛孢的拷贝数小1X10⁵，则表示该杨梅树在将来不会发生凋萎病。

在一些优选的方式中，如果每100ng的植物组织DNA中可以检测的异色拟盘多毛孢或/和小孢拟盘多毛孢的拷贝数大于1X10⁷、1X10⁸或1X10⁹，则表示该杨梅树在将来一定会发生凋萎病。

在一个优选的方式中，植物组织为杨梅树一年生嫩枝中的组织。定量扩增的方法为荧光RT-PCR。

在另一个优选的方式中，所述的杨梅的凋萎病由异色拟盘多毛孢或/和小孢拟盘多毛孢菌所造成的。优选的，所述的杨梅的凋萎病由保藏号为CGMCC No.8714的异色拟盘多毛孢菌株PVXJ1或/和保藏号码为CGMCC No.8713的小孢拟盘多毛孢PMYS1菌株所引起的。

在优选的方式中，检测所用的引物为GAAATGACGCTCGAACAGGC和TGAAGAACGCAGCGAAATGC；或引物对为GAACAGGCATGCCCACTAGA和ATCGATGAAGAACGCAGCGA。

在一些优选的方式中，一旦发现每100ng的植物组织DNA中可以检测的异色拟盘多毛孢或/和小孢拟盘多毛孢的拷贝数大于1X10⁶，立即对杨梅树进行药物防治。如果每100ng的植物组织DNA中可以检测的异色拟盘多毛孢或/和小孢拟盘多毛孢的拷贝数小1X10⁵，不需要对杨梅树进行药物防治，进行正常的田间管理。

对于保藏真菌的生物学特性说明

菌株PVXJ1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码为CGMCC No.8714，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，拉丁学名：Pestalotiopsis versicolor，中文名称为：异色拟盘多毛孢，保藏日期为：2014年01月10日。

第二个菌株PMYS1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码为CGMCC No.8713，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，拉丁学名：Pestalotiopsis microspora，中文名称为：小孢拟盘多毛孢，保藏日期为：2014年01月10日。

附图说明

图1为本发明实用的拷贝数与CT值的标准曲线；

图2标准品的扩增曲线图；

图3标准品的溶解曲线图。

有益效果

使用本发明的方法，可以早起鉴定杨梅树是否具有发生凋萎病的风险，通过DNA的拷贝数的多少预测杨梅树凋萎病的发生风险，可以提前预测凋萎病的发生，采取及时有效的防治措施。

具体实施方式

1材料和方法

1.1样品采集及预处理

1.2试剂

真菌分离纯化所用的PDA培养基购自青岛日水生物技术有限公司。PCR扩增所用的TaqDNA聚合酶、dNTPs（4种混合）、10×PCR buffer均购自北京鼎国生物科技有限责任公司，拟盘多毛孢的特异性引物由上海生工生物工程有限公司合成，实时荧光定量PCR所用的SYBR荧光试剂、pMD18-T载体及感受态细胞均购自宝生物工程（大连）有限公司。CTAB法提取基因组所需的试剂均购自上海生工生物工程有限公司，具体试剂见下表。

表1  实验试剂名称及生产商

1.3仪器

低温离心机（Eppendorf5417R）；常温离心机（Eppendorf5414D）；冰箱（海尔HR-205TB）超纯水制备系统（MILLIPORE F5CN29159）；电泳仪（DYY-6C型）；数码电泳凝胶成像系统（BID-RAD Gel Doc）；微波炉（Galanz wp700TL23-K5）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9243BS-III）；超净工作台（SW-CJ-2FD）；电子分析天平（Sartorius BT124S）；微量移液枪（德国Eppendorf公司）；PCR仪（Applied Biosystems Gere Ampr2720）；电泳仪（DYY-12型）；回旋式振荡器（HY-5型）；不锈钢立式灭菌锅（LDZX-50KBS）；电热恒温水浴锅（DK-S24型）；荧光定量检测仪（ABI PRISM7500）；核酸微量分光光度检测仪（Naonodrop2000）

实施例子1：真菌的分离纯化、保存以及产孢

1、分离菌之前将根、茎、叶冲洗干净，吸去表面残留水渍，并将茎表皮去除。

2、在超净工作台上操作下列步骤：首先75%酒精灭菌30s，用灭菌的剪刀将根、茎剪成小段，厚约2mm，将叶片剪成小片，约0.5cm×1.0cm。用灭菌的镊子将处理好的材料接种于PDA培养基表面，每个平皿接种三段或三片，呈三角形排列。

3、将培养皿用保鲜膜包好并置于25℃的恒温箱中，无光照条件下生长约3天，观察真菌分离情况并记录数据。通常情况下真菌和一些杂菌掺杂生长，为此下面进行第一次纯化。

4、用接种针挑选长势较好的白色拟盘多毛孢真菌菌丝，将其接种到新的PDA培养基上，并做好标记。

5、将平皿用保鲜膜包好并放置到25℃的恒温箱中，无光照条件下生长约3天，一般情况可以观察到较为纯净无杂菌的白色真菌菌落，记录纯化数据。

6、第二次分离纯化：继续挑选长势较好的目标菌落并做好标记，接种于新的周围已贴上灭菌滤纸片的PDA培养基上，长出无任何杂菌的真菌菌落，做最后一次真菌纯化结果的数据统计；最终获得两个菌株，分别标号为PVXJ1和PMYS1。

7，根据科赫氏法则鉴定PVXJ1和PMYS1为杨梅凋萎病的致病菌。根据分生孢子形态及ITS（转录间隔区）序列分子鉴定他们分别为异色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢。

8、待菌丝长满滤纸片后，轻轻夹下6～7片滤纸片，放在已经灭菌的纸袋中，将袋口折叠封好置于无菌玻璃平皿中，37℃温箱内过夜烘干12～14h；每份菌株保存三份。

9、烘干后将纸袋装进塑料袋，抽真空后用封口机密封，-80℃保存。

实施例子2：不同浓度孢子对杨梅树的接种实验

接种用的杨梅凋萎病病原菌为强致病力菌株PVXJ1和PMYS1。两菌株获得的分生孢子按1:1比例用灭菌水配成不同浓度的混合分生孢子悬浮液，分别为：2×10⁷个·mL^-1，2×10⁶个·mL^-1，2×10⁵个·mL^-1，2×10⁴个·mL^-1，2×10³个·mL^-1，2×10²个·mL^-1。

供试杨梅树都为2年生健康杨梅树（利用荧光RT-PCR，利用实施例子5中涉及的引物进行鉴定，不含有任何凋萎病分子，即不含异色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢菌）。2013年4月末取上述种质资源直径为0.6-0.9cm的1年生枝条。在每根枝段在离顶端5cm处小心去除叶片一枚，在叶痕位置接种不同浓度的分生孢子悬浮液20μL，以接种灭菌水作为对照，棉花吸水保湿，保鲜膜轻轻缠绕。每份资源以3根枝段为1次重复，共设3次重复。接种后的杨梅树放置在大棚里统一进行管理，让环境温度、湿度和光照保持一致，让其自然发病。从接种开始起，每隔15天进行嫩茎、根、叶片取样并进行植物组织的DNA的提取。

按照以上同样的方法，对相同的杨梅树进行喷洒接种杨梅树叶，主干进行喷洒接种，喷洒的孢子浓度为也为分别为：2×10⁷个·mL^-1，2×10⁶个·mL^-1，2×10⁵个·mL^-1，2×10⁴个·mL^-1，2×10³个·mL^-1，2×10²个·mL^-1。另外，喷洒灭菌水作为对照。

实施例子3：杨梅组织中真菌基因组的提取和纯化

1、取适量（1.5～2.5g）预处理过的实施例子2中接种的杨梅的嫩枝加入研磨钢罐，将钢罐于液氮中速冻2～3min，用Thermorgan高通量组织研磨仪研磨1～1.5min，将样品迅速转移至10ml离心管中。

2、加入4ml2%CTAB裂解液，置于65℃水浴锅中水浴45～50min，取出加入等体积的24:1的氯仿：异戊醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心10分钟。

3、小心吸取上清液到新的10ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃中冷冻沉降1h，13000rpm离心10分钟。

4、弃上清液，加入1ml70%乙醇悬起洗涤沉淀，将沉淀和乙醇全部转移至1.5ml离心管，12000rpm离心4分钟，弃上清。

5、重复上述步骤4。

6、倒置离心管，室温干燥DNA或者于超净工作台上吹干剩余乙醇。

7、加入40μl65℃预热的TE或ddH₂O，并在37℃中保温直至DNA完全溶解。

8、DNA溶解后，可按样品体积加入1/10体积的浓度为10mg/ml的Rnase A并在37℃处理10min除去RNA。取1μl进行Nanodrop检测浓度和纯度，另取3-5μl于1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

9、置4℃中备用，或置-20℃长期保存。

实施例子4：真菌菌丝基因组的提取

应提前将研钵及研杵清洗干净，锡纸包裹，烘箱内200℃、2h后待冷却；提前检查试剂是否有效充分；提前将菌株的组织在塑料袋内用液氮完全冷冻，放置于-80℃冷冻保存。

1、提前清理实验台，铺双层保鲜袋，准备防冻手套等，将菌丝从有赛璐玢膜的PDA培养基上用刀片轻轻刮下，将样品置于研钵中，倒入液氮，充分研磨至粉末状。提前称量2ml离心管重，将样品粉末小心倒入2ml离心管中，室温放置1-2min；再称量2ml离心管重，计算样品质量。

2、按照0.1g经过PDA培养的菌丝体（所有的菌株使用PDA培养基（马铃薯淀粉5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，加水定容至1L，灭菌）25℃平板培养1周后，用来进行菌株的DNA的提取）样品加入600μl2%CTAB的比例加入65℃预热的2%CTAB；充分混匀，置65℃水浴1h，期间可适当摇匀，期间每隔5-10min混匀一次，取出后放至室温。

3、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇25:24:1，充分颠倒混合（将提取液中含有的蛋白质杂质变性），室温下12000rpm离心10min。

4、将上清转移到新2.0ml离心管中（注意：不要吸到中间的蛋白质层），加入等体积氯仿/异戊醇24:1（通风橱操作，如果需要吸取充分，可将吸到的蛋白质层再离心），充分颠倒混合（抽提提取液中含有的蛋白质，并萃取出其中的酚）；室温下12000rpm离心10min。

5、将上清转移到新1.5ml离心管中，向上清中加入两倍体积无水乙醇（也可加入1/10体积3mol/L NaAc pH=5.2），充分颠倒混匀，使DNA从溶液中析出，形成絮状沉淀（可室温或-20℃放置1-2h促进DNA沉淀）；4℃2000rpm心20min。

6、弃上清，加入500μl70%乙醇，颠倒混匀，至沉淀悬起。

7、4℃2000rpm离心5min，再用500μl70%乙醇洗涤一次。

8、4℃2000rpm离心5min，弃酒精，将剩余的液体尽量吸净并干燥。

9、加入适量（40μl）TE缓冲液或ddH₂O溶解DNA，如果DNA溶解困难，可37℃温育10min。

10、DNA溶解后，可按样品体积加入1/10体积的浓度为10mg/ml的Rnase A并在37℃处理10min除去RNA。取1μl进行Nanodrop2000检测浓度和纯度，另取3-5μl于1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例子5：PCR引物设计和筛选

Primer3software设计荧光定量PCR和传统PCR的引物。PVXJ1和PMYS1的ITS序列用（JN861773；JN861776)(Ren HY,Li Gang,Qi XJ,Fang Li,Wang HR,Wei JG,Zhong S.Identification and characterization of Pestalotiopsis spp.causing twig blight disease of bayberry(Myrica rubra Sieb.&Zucc)in China.European Journal of Plant Pathology,2013,173(3):451-461.）DNAStar排列一致，CLUSTALW(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-e.html)进行序列的比较，用异色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢的一致区域设计引物。NCBI GenBank database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)内使用BLASTn验证引物的特异性。。

表2引物序列特性

采用25μl体系，包括10×buffer2.5μl，2.5mM dNTPs1μl，10μM的正反引物各1μl，Taq酶0.5μl，100ng/μl DNA模板1μl，加灭菌水至25μl。利用普通PCR程序95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。用上述2对引物分别扩增PVXJ1和PMYS1的基因组，得到目的基因。以1×TBE（10×TBE配方为：Tris108g，Na₂EDTA·2H₂O7.44g，硼酸55g，定容至1L)为缓冲液，PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳（电压：120V，30min），EB染色15min后再用凝胶成像分析系统对其进行拍照检测。

实施例子6：质粒标准品的构建与标准曲线的制作

质量标准品的构建

从实施例子5中扩增得到的目的基因片段经过琼脂糖凝胶电泳检测其大小，紫外光下拍照，确认正确后，利用生工生物的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行目标片段纯化。然后利用纯化后的扩增产物和TaKaRa的pMD-18T载体按其说明书进行连接实验。将连接好的产物进行转化和培养，具体步骤如下：取5μl连接产物，加入60μl TaKaRa的DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击45s，置于冰上2min。取出后加入400μl液体LB培养基，37℃150rpm振荡1h，涂板于加了氨苄青霉素的固体LB平板上，37℃过夜培养。第二天观察长出的菌落，用1μl的无菌枪头挑出白色的阳性克隆，放入加了LB液体培养基的试管中进行培养，培养条件为37℃，250rpm摇菌15-18h。最后，利用Axgen的质粒提取试剂盒按其说明书进行质粒提取，同上进行电泳检测，并送去上海生工生物有限公司进行测序鉴定，最后得到正确的标准品，ND drop2000测定其浓度，然后保存于-20℃冰箱，备用。

携带目标片段的质粒梯度稀释用来构建标准曲线。经过多次上机检测，最后确定从0.1ng/μl（经计算相当于0.6×10⁸拷贝数）的标准品浓度开始10倍梯度稀释，总共稀释5个梯度，利用ABI PRISM7500的荧光定量仪器，按照TaKaRa SYBR Premix DimerEraser(Perfect RealTime)的荧光定量试剂盒选择20μl的体系说明进行操作，荧光定量PCR方法重复3次，扩增标准品，以标准品拷贝数的log值为纵坐标，以扩增得到的Ct值为横坐标，做出标准曲线，得到线性和可靠的标准曲线（R²>0.99）。

标准曲线制作

如图1所示，是用实验前期所构建的稀释后5个浓度梯度的标准品质粒，采用Pvm1R/Pvm1L引物进行荧光定量扩增得出Ct值，然后作图得出的标准曲线：y=-3.2525x+38.85（y：DNA拷贝数的lg值；x：Ct值）。可见标准曲线的相关性，R²都已经大于0.99，因此标准曲线已经可以作为后续检测样品的可靠定量参考。图2是标准品质粒的扩增曲线，由图可以看出，扩增效率良好，扩增曲线是从最大基线之后开始，扩增曲线平滑有序，标准品达到了实验预期要求。图3是标准品进行荧光扩增过程后得出的溶解曲线图，只有单一峰且峰值出现在Tm值上，说明引物是特异性扩增的，没有引物二聚体产生，结果可用。同时采用荧光RT-PCR方法对其他属于拟盘多毛孢的其他菌株（PVXJ1和PMYS1）进行扩增和溶解曲线的验证，发现本发明涉及的引物可以很好的特异检测拟盘多毛孢，而对于其他的真菌却表现出没有拷贝数的检测。

实施例子7：荧光定量PCR扩增

将实施例子3中提取的植物组织中的真菌基因组模板浓度稀释到标准曲线范围内（100ng），按照TaKaRa SYBR Premix DimerEraser(Perfect Real Time)的荧光定量试剂盒选择20μl的体系说明进行操作具体为：Premix Ex（2×）10μl，PCR Forward Primer（10μM）0.6μl，PCR Reverse Primer（10μM）0.6μl，ROX Reference Dye II4μl，Template（＜100ng）2μl，dH₂O（灭菌蒸馏水）6.4μl。Real time PCR程序95℃30sec；95℃5s，55℃30s，72℃34s，40个循环。实时荧光定量PCR的每个样品重复三次。得出每个样品的Ct值，然后根据标准曲线计算出目标片段的拷贝数。对于重复性不好的样品或者扩增效率差的个别样品分析原因，进行一些后处理如再次产物纯化等继续上机检测，直到得出可靠的Ct值。荧光定量PCR结束后需要额外添加一个溶解曲线。

从表3和表4可以看出，在每100ng杨梅嫩枝组织的DNA里含有拟盘多毛孢的DNA拷贝数大于2.1×10⁶时，可以判断该嫩枝一定会在后期表现出凋萎病的症状，在这个时候，可以进行有效的防治，而拷贝数小于2.1×10⁵拷贝的时候，在后期并不表现出凋萎病的症状，不会对杨梅树造成叶片枯死或嫩枝枯死，就不必进行药物防治，因为他们并不对杨梅树造成不利的影响。原因可能是杨梅树组织内的一定数量的拟盘多毛孢可以与杨梅树组织共生，但是杨梅组织内的拟盘多毛孢超过一定的阀值（每100ng杨梅嫩枝组织的DNA里含有拟盘多毛孢DNA拷贝数大于2.1×10⁶），杨梅组织在后期一定会表现出凋萎病的症状，这就需要在症状没有表现出来前提早进行药物防治。

表3：通过定量检测获得不同接种时间后的嫩枝组织DNA的拷贝数(100ng植物组织DNA)

表4接种不同天数的杨梅表观感病观察

同时，对对照嫩枝和叶片、根、茎进行同样的扩增，没有目的基因被检测出。同时，对于处理有不同浓度孢子液的叶片、根，茎也进行了同样方法的扩增，发现在接种0天到28天之间，目的基因被检测出有，但是拷贝数的数量级最大只有10³，小的只有10¹，和表现出的外观感病症状无关联，特别在嫩枝和嫩枝上的叶片上无任何病症。这说明嫩枝，特别是1年生嫩枝作为取样部位是检测目的基因拷贝数是提示以后是否发病的关键部位。

实施例子8：田间健康杨梅嫩枝拟盘多毛孢的拷贝数检测

选择浙江省的诸暨没有凋萎病发生的健康杨梅树，于2012年的9月采集8年生的杨梅树（不同时间取样都在同一个杨梅果园内发病程度相似的不同的杨梅树上的相同的位置取植物组织）的1年生嫩枝。然后参照实施例子3进行植物组织DNA的提取，采用实施例子4中的引物和参照实施例子6的方法进行RT-PCR进行目的DNA拷贝数的扩增（利用标准曲线）。监测的结果如下。

每100ng健康杨梅树嫩枝的DNA内含有拟盘多毛孢的DNA拷贝数是2.15×10⁴-1.37×10⁵（表5）。

表5：诸暨健康杨梅树体9月份真菌分离数和真菌DNA拷贝数

实施例子9：不同地区、不同时间发生凋萎病的杨梅1年生嫩枝拟盘多毛孢的拷贝数监测

选择浙江省的瑞安、天台和临海3个地方的发生凋萎病的杨梅果园，于2012年的9月从3个地方分别采集8年生的发生凋萎病的杨梅树的1年生嫩枝（未发病，嫩绿色）。然后参照实施例子3进行植物组织DNA的提取，采用实施例子4中的引物和参照实施例子6的方法进行RT-PCR进行目的DNA拷贝数的扩增（利用标准曲线）。监测的结果如下。

三个发病地方的杨梅树DNA的拷贝数都达到了6.25×10⁶-8.87×10⁸。由此可见，采用分子方法，设定了杨梅树发生凋萎病的阀值，如果杨梅基因组DNA每100ng有拟盘多毛孢的拷贝数大于6.25×10⁶，预示着该杨梅树在将来一定会发生杨梅树凋萎病，相反，组织小于1×10⁵的拷贝数，则不会发生杨梅树凋萎病。分子拷贝数的结果这与这些嫩枝在后来是否真正发病及其相关，那些后来发病的杨梅嫩枝的拟盘多毛孢的拷贝数的数量级都大于10⁶，而不发病的嫩枝的拟盘多毛孢的拷贝数的数量级都小于10⁵，预示着杨梅嫩枝中的拟盘多毛孢的拷贝数存在一个阀值，可以早起预测该杨梅树是否发病。

表6：荧光定量PCR检测发生凋萎病的8年生杨梅树嫩枝处拟盘多毛孢DNA拷贝数结果

总而言之，如果1年生嫩枝的杨梅每100ng DNA的拟盘多毛孢的DNA拷贝数大于1×10⁶的拷贝数，则很可能会发生凋萎病，需要积极防治，如果小于1×10⁵的拷贝数，则发生凋萎病的可能性较小，可以按常规病害防治方法管理果园。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江省农业科学院

 

<120>  一种早期检测杨梅是否发生凋萎病的方法

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gaaatgacgc tcgaacaggc                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tgaagaacgc agcgaaatgc                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gaacaggcat gcccactaga                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

atcgatgaag aacgcagcga                                                 20

 

 

Claims (7)

1.一种早期检测杨梅是否发生凋萎病的方法，其特征在于，该方法包括： 对杨梅组织的DNA进行定量扩增，如果每100 ng的植物组织DNA中可以检测的异色拟盘多毛孢或/和小孢拟盘多毛孢的拷贝数大于1X10⁶，则表示该杨梅树在将来一定会发生凋萎病，如果每100 ng的植物组织DNA中可以检测的异色拟盘多毛孢或/和小孢拟盘多毛孢的拷贝数小1X10⁵，则表示该杨梅树在将来不会发生凋萎病。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，如果每100 ng的植物组织DNA中可以检测的异色拟盘多毛孢或/和小孢拟盘多毛孢的拷贝数大于1X10⁷、1X10⁸或1X10⁹，则表示该杨梅树在将来一定会发生凋萎病。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，植物组织为杨梅树一年生嫩枝中的组织。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，定量扩增的方法为荧光RT-PCR。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的杨梅的凋萎病由异色拟盘多毛孢或/和小孢拟盘多毛孢菌所造成的。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的杨梅的凋萎病由保藏号为CGMCC No.8714的异色拟盘多毛孢菌株PVXJ1或/和保藏号码为CGMCC No.8713的小孢拟盘多毛孢PMYS1菌株所引起的。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，检测所用的引物为GAAATGACGCTCGAACAGGC和TGAAGAACGCAGCGAAATGC；或引物对为GAACAGGCATGCCCACTAGA和ATCGATGAAGAACGCAGCGA。