CN101418337A - 玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，基于腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因、丝氨酸－十六酰基转移酶基因FUM8、长寿保证因子基因FUM17，应用DNAman序列分析软件分别设计了多对引物，并与镰刀菌属特异性引物IstF/IstR一起，通过实验比较得到了特异性最佳的引物配组；在同一反应体系中同时检测腐马素产毒菌株；采用复合PCR技术，多对引物在同一反应体系中同时扩增；其检测步骤为：待检样品直接采用改良的SDS法提取模板DNA；然后经复合PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析得出检测结果。提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式大规模推广。
Description
技术领域
本发明“一种玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法”，属于农作物病害防治和植物检疫技术领域。
背景技术
腐马素是一组主要由串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides或Fusarium moniliforme)和再育镰刀菌(Fusarium proliferatum)等镰刀菌属真菌产生的真菌毒素。它不但对某些牲畜有急性毒性及潜在的致癌性，如引起马脑炎、猪肺水肿或大鼠肝癌等，还能引起人类食道癌和神经管缺陷，严重威胁食品安全及人类和动物的健康。由于腐马素分布广，毒性强，已成为继黄曲霉素之后的又一个真菌毒素研究的新热点。近年来，玉米中腐马素水平的升高不仅引起玉米种植者的注意，还引起了牲畜饲养者、农业企业、食品工业、健康问题专业人士和政策制定者等的广泛关注。
中国是世界上已经确认的食品中腐马素的污染与食道癌的发生关系密切的两个国家之一，因此控制玉米等食品中腐马素的污染是当务之急，在农业生产和食品安全领域都有非常重要的意义。较全面地了解各地玉米及其制品上腐马素产毒菌株污染情况，建立完善、快捷的腐马素及其产毒株的检测手段和监控机制也势在必行。只有这样才能及时有效地发现和控制有关腐马素的污染，及时采取措施，从而提高我国农产品在国际市场上的质量和信誉，保证国际贸易的顺利进行，保护广大农民的切身利益。
目前，腐马素产毒菌株的分类和鉴定方法主要有形态学和分子生物学两种。其中，传统的形态学方法检测腐马素产毒菌株，需进行产毒培养、毒素提取和测定，需时约30天，费时费力。在生产实际鉴定应用和科研中，都有较大局限性。而分子检测手段大多以分类学基因和腐马素生物合成所必需的聚酮化合物合成酶基因FUM1为基础的，设计组特异性或属特异性引物进行PCR扩增检测，耗时可缩短到2天。但是，由于分类学基因是基于镰刀菌属内各个种的同源序列设计的，直接揭示菌株种类，而并不能直接揭示待测菌株的产毒性，很可能将未知的腐马素产毒菌株排除在外。目前扩增直接与腐马素产毒机制相关基因的引物是基于已知产毒菌株F.verticillioides的FUM1基因序列设计的，腐马素的合成是一个比较复杂的过程，受多种基因调节，对于FUM1基因的单一检测并不能完全保证结果的可靠性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种简单、有效、快速的腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法。
本发明的检测方法基于腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因、丝氨酸-十六酰基转移酶基因FUM8、长寿保证因子基因FUM17，应用DNAman序列分析软件分别设计了多对引物，并与镰刀菌属特异性引物ItsF/ItsR一起，通过实验比较得到了特异性最佳的引物配组。在同一反应体系中同时检测腐马素产毒菌株。是对仅根据分类学基因及FUM1基因设计特异性引物检测方法的补充和改进。对串珠镰刀菌之外的其他腐马素产毒菌株也可以检测到。同时，本方法采用复合PCR技术，多对引物在同一反应体系中同时扩增，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式在大规模推广。
本发明通过以下技术方案实现：
第一步：PCR引物设计
根据聚酮化合物合成酶FUM1基因、丝氨酸-十六酰基转移酶基因FUM8、长寿保证因子基因FUM17的基因序列，应用DNAman序列分析软件分别设计了多对引物。设计引物通过不断调整，直到得到特异性最佳的引物配组。复合PCR反应所用引物共四对，fum1-F/fum1-R、fum8-F/fum8-R、fum17-F/fum17-R和ItsR/ItsF，其引物序列如下：
fum1-F GCAACTCACCTTACTCGCTATTC
fum1-R TGTTCAGAGGGGTCTTTGGTTA
fum8-F CACTGCATATGACTACCTCTTGGGAGGAT
fum8-R CTCGAATTCGGACATGTCCCTCGCGATAA
fum17-F CTTTTTCTAGCAACTTCTAAATCACTTAT
fum17-R TTGCTCGAGTTAGTCCCCATGCTCGATTTC
ItsF AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA
ItsR TTTAACGGCGTGGCCGC
其中fum1-F/fum1-R引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出635bp的产物，fum8-F/fum8-R引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出1152bp的产物，fum17-F/fum17-R引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出344bp的产物，ItsR/ItsF引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出431bp的产物。
引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。每管1ODU260，储存液浓度25μmol/L，用灭菌双蒸水配制。-20℃保存备用。
第二步：样品中模板DNA提取
样品中DNA的提取方法采用改良的SDS提取法：将玉米或其制品磨成粉，取约0.2g置于50ml的试管中；加入4ml DNA提取液(200mM Tris-HCl pH＝8.5，250mM NaCl，25mMEDTA pH＝8.0，0.5％(W/V)SDS)并且涡旋使其充分混合；加入2ml的苯酚和1.5ml氯仿，涡旋振荡，2500g离心15min；将上清液转移到2ml的离心管中，每支中加上清液900μl，氯仿900μl，13200rpm离心5min；将上层溶液转移到新的2ml试管中，加入RNase I(终浓度C≥100μg/ml)；在37℃培养2-3h；加入等体积的冷的5M氯化锂溶液，轻轻振荡充分混合，在冰上再放置15min；4℃下13200rpm离心10min，然后将所有的上清液一起都放在一个50ml的试管中；加入2.5倍体积的100％乙醇，在水和乙醇的交界处形成一层DNA团，然后混合；4℃3000g离心20min，小心地弃取上层清液；加20ml70％的冷乙醇，4℃3000g离心20min，小心地弃去上层清液；沉淀在空气中干燥15min，然后加入300-400μlTE缓冲液或重蒸水ddH2O，混匀；模板DNA母液贮存在-80℃条件下。使用前稀释成浓度为50ng/μl溶液，存放在-20℃条件下。
第三步：复合PCR扩增
复合PCR扩增反应体系为：反应体系总体积为25μl，包括1.75μl的10×PCR缓冲液，1.5μl的25Mm MgCl2，1.0μl的10MmdNTP，0.5μl的Taq酶，2μl第二步得到的模板DNA，1.8μl第一步中的引物，其中fum-1F、fum-1R、fum-17F和fum-17R各0.1μl，ItsF和ItsR各0.2μl，fum-8F和fum-8R各0.5μl，其余以重蒸水补足。
PCR反应条件为：1)预变性温度94℃，时间5min；2)循环数33，变性温度94℃，时间30s；退火温度53℃，时间45s；延伸温度72℃，时间1min；3)终延伸温度72℃，时间10min；4)保存在4℃。
第四步：检测结果判定
制备3.0％的琼脂糖EB凝胶(含EB0.5μg/ml)，取第三步扩增产物10μl点样，同时以DL2000作为分子量对照，电压设置80V(5V/cm)，电泳时间30到50min。电泳结束后，在紫外光下(波长258cm)，用自动凝胶成像系统观察、扫描并储存电泳结果。
有益效果：
本发明用于检测玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR方法，与国内外现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：
1)检测范围广。既可用于检测从发病组织分离的腐马素产毒菌株，也可用于检测无发病症状的玉米材料是否带有腐马素产毒菌株。
2)检测准确性高。本方法基于腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因、丝氨酸-十六酰基转移酶基因FUM8、长寿保证因子基因FUM17设计了多对引物并与镰刀菌属特异性引物ItsF/ItsR一起，在同一反应体系中同时检测腐马素产毒菌株。不仅能用于已知腐马素产毒菌株的检测，对未知的腐马素产毒菌株也能检测到。
3)操作方便快捷。本发明采用复合PCR技术，多对引物在同一反应体系中同时扩增。而且扩增模板DNA可以直接用样品提取，省去了菌株DNA纯化富集的繁琐过程。整个过程简单、快速、高效。一般整个检测过程可在6个小时内完成。
4)特异性强。本发明设计的三对引物可特异性检测腐马素产毒菌株，扩增时均无非特异性条带。
因此本方法实用性强，可满足植物检疫及食品安全检测的需要。
附图说明
图1是本发明的实施例1的实验结果及引物对fum1-F/fum1-R，fum8-F/fum-8-R，fum17-F/fum17-R，ItsR/ItsF复合PCR反应特异性.其中以串珠镰刀菌野生型为阳性对照，以聚酮化合物合成酶Fum1p被敲除的串珠镰刀菌野生型及桔青霉为阴性对照。
M.DNA Ladder 2000.A1.串珠镰刀菌野生型，2.ZJ1-1，3.HNLX1-1，4.HNLX1-2，5.HNZZ1-1，6.HNZZ2-1，7.HNZMD1-1，8.HNZMD2-1，9.NMG2-1，10.NMG1-1，11.SDDY1-1，12.SDHZ-1，13.SDXY2-1，14.SDXY2-2，15.SDXY5-1，16.SDXY3-1，17.SDXY4-1，18.SX1-1，19.SXBJ1-1，20.SXBJ2-1，21.SXYL1-1，22.SXYL2-1，23.SXYL3-1，24.SXYL4-1，25.SXBJ3-1，26.SXBJ3-2，27.聚酮化合物合成酶Fum1p被敲除的串珠镰刀菌野生型，28.桔青霉。
图2fum1-F/fum1-R，fum8-F/fum8-R，fum17-F/fum17-R及ItsR/ItsF单对引物PCR的敏感性M.DNALadder2000.1-6，7-12，13-18，19-24孔使用引物分别为fum1-2L/fum1-2R，fum8-3N/fum-8-4E，fum17-P-F2/fum17-P-R2及ItsR，ItsF.1-5，7-11，13-17，19-23孔为串珠镰刀菌野生型的DNA，浓度为10ng，1ng，100pg，10pg，1pg；6，12，18，24孔为无菌水对照.
图3引物fum1-F/fum1-R，fum8-F/fum8-R，fum17-F/fum17-R及ItsR/ItsF复合PCR的敏感性M.DNALadder2000.1-5孔为串珠镰刀菌野生型的DNA，浓度为10ng，1ng，100pg，10pg，1pg；6，孔为无菌水对照.
具体实施方式
实施例1在未加工的玉米粒上分离菌株检测腐马素产毒菌株
本实验使用的未加工的玉米棒和粒从全国各地收集，共44份。其中华北地区1份(内蒙古3份，河北1份，山西2份)，西北地区(陕西)7份，东北地区1份(黑龙江4份，辽宁1份、吉林2份)，华北和华中地区15份(山东9份、河南6份)，江南地区9份(江苏2份、浙江2份，上海5份)。
第一步：引物合成
将本发明所设计的引物序列(见表1)
表1 本发明中所设计的PCR引物
**Bluhm，2002.
提交给上海生工生物工程技术服务公司合成。每管1OD U260，储存液浓度25μmol/L，用灭菌双蒸水配制。-20℃保存备用。
第二步：菌株的分离、纯化
将玉米棒上粒全部剥下，每份样品取20粒，用无菌水清洗一次，洗去表面脏物。70％酒精消毒3min，10％次氯酸钠消毒7min，然后用无菌水冲洗3次。无菌条件下，将样品平铺到PDA(马铃薯-葡萄糖-琼脂)培养基上，封口膜封口。置于培养箱中25℃暗培养。
统计每个样品在PDA培养基上的菌落，观察真菌的生长，4-5天后在显微镜下观察真菌的性状特征，分出不同的真菌，将其从菌落中挑出，各自接种到PDA培养基上进一步培养。一种真菌接种于一个培养皿内。
4-5天后，对纯化了的菌株进行单孢分离。准备3个倒有10ml无菌水的培养皿，用接种针挑取一小块菌丝放入一个培养皿中，用“L”型玻棒搅匀，蘸取少许溶液(1-2滴)溶解在第二个培养皿中，同样方法处理第三个培养皿，得到三个不同数量级浓度的孢子悬浮液。分别从三个不同孢子悬浮液中蘸取少许液体涂在PDA平板上，高浓度一个，中等浓度2个，低浓度3个。25℃暗培养，每隔12h观察一次，若发现有菌落产生则用记号笔从培养皿的反面标记，用解剖针连同培养基一起挑取到新的PDA平板中。即可获得单孢培养物。纯化后菌株于4℃保存备用。
如果需要长期保藏，则需要在PDA平板上培养几周。然后，用石蜡封存或用无菌水洗孢子然后保存在15％的甘油中。
第三步：模板DNA提取
(1)将菌株培养在50ml的液体酵母培养基中，在27℃，200rpm/min的振荡条件下培养3-5天。
(2)用Whatman滤纸过滤，抽滤收集孢子，在液氮中磨成粉，将粉末收集在50ml的试管中。
(3)在试管中加入4mlDNA提取液并且涡旋使其充分混合。
(4)加入2ml的苯酚和1.5ml氯仿，短时间涡旋振荡，2500g离心15min。
(5)将上清液转移到2ml的离心管中，每支中加900ul，然后加900ul氯仿，13200rpm离心5min。
(6)将上层溶液转移到新的2ml试管中，加入RNase I(终浓度C≥100μg/ml)。然后在37℃培养2-3h。。
(7)将试管和5M氯化锂溶液在冰上放置15min。
(8)往试管中加入等体积的冷的5M氯化锂溶液，轻轻振荡充分混合，在冰上再放置15min。
(9)4℃下13200rpm离心10min，然后将所有的上清液一起都放在一个50ml的试管中。
(10)加入2.5倍体积的100％乙醇，在水和乙醇的交界处形成一层DNA团，然后混合。
(11)4℃3000g离心20min，小心地弃取上层清液。
(12)加20ml70％的冷乙醇，然后在4℃下过夜，让杂质溶解。
(13)4℃3000g离心20min，小心地弃去上层清液。
(14)沉淀在空气中干燥15min，然后加入300-400μl dd H2O，在4℃下溶解过夜。
(15)用移液器吸取溶液的办法使其混匀。
模板DNA母液贮存在-80℃条件下。使用前稀释成浓度为50ng/μl溶液，存放在-20℃条件下。
第四步：复合PCR扩增
复合PCR扩增反应体系为：反应体系总体积为25μl，包括1.75μl的10×PCRbuffer，1.5μl的25Mm MgCl2，1.0μl的10Mm dNTP，0.5μl的Taq酶，2μl第二步得到的模板DNA，1.8μl第一步中的引物，其中fum-1F、fum-1R、fum-17F和fum-17R各0.1μl，Its-F和Its-R各0.2μl，fum-8F和fum-8R各0.5μl，其余以重蒸水补足。
PCR反应条件为：1)预变性温度94℃、时间5min；2)循环数33，变性温度94℃，时间30s；退火温度53℃，时间45s；延伸温度72℃，时间1min；3)终延伸温度72℃，时间10min；4)保存在4℃。
第五步：检测结果判定
以制备3.0％的琼脂糖EB凝胶(含EB 0.5μg/ml)，取第三步扩增产物10μl点样，同时以DL2000作为分子量对照，电压设置80V(5V/cm)，电泳时间30到50min。电泳结束后，在紫外光下(波长258cm)，用自动凝胶成像系统观察、扫描并储存电泳结果。
实施结果：
在所有的44份材料中的21份上分离菌株到25个，其中HNLX1-1，HNZZ1-1，HNZZ2-1，HNZMD1-1，SDXY2-2，SDXY5-1，SDDY1-1，ZJ1-1，SXBJ2-1，SXBJ3-2，SXYL1-1，NMG1-1，SXYL2-1，SXYL3-1，SXYL4-1这15个菌株分别产生大约635bp，1152bp，344bp，和431bp的预期DNA片段(图1，表2)，与阳性对照野生型串珠镰刀菌PCR结果一致，FUM1，FUM8，FUM17基因及ITS阳性，为腐马素产毒菌株。菌株HNLX-2，NZMD-2-1，SDHZ1-1，SDXY2-1，SDXY3-1，SDXY4-1，NMG2-1，SXBJ3-1，SX1-1和SXBJ1-1这10个菌株未扩增出任何片段，与阴性对照结果相同。聚酮化合物合成酶Fum1p被敲除的串珠镰刀菌野生型菌株未扩增出FUM1片段。而其他片段都能正常扩增(图1，表2)。证明引物对fum1-F/fum1-R，fum8-F/fum8-R，fum17-F/fum17-R，ItsR/ItsF复合PCR反应检测串珠镰刀菌腐马素产毒菌株的特异性良好。并且分离菌株的复合PCR检测结果与单对引物PCR结果一致，也证明了本发明复合PCR方法的特异性和可靠性(图1，表2)。
表2 玉米上分离菌株单对引物PCR和复合PCR检测结果.
实施例2在未加工的玉米粒上直接检测腐马素产毒菌株
本实验使用的材料同实施例1。
第一步：引物合成
操作步骤同实施例1第一步。
第二步：模板DNA提取
将玉米粒磨成粉，取约0.2g置于50ml的试管中。加入4mlDNA提取液并且涡旋使其充分混合。加入2ml的苯酚和1.5ml氯仿，涡旋振荡，2500g离心15min。将上清液转移到2ml的离心管中，每支中加上清液900μl，氯仿900μl，13200rpm离心5min。将上层溶液转移到新的2ml试管中，加入RNase I(终浓度C≥100μg/ml)。然后在37℃培养2-3h。加入等体积的冷的5M氯化锂溶液，轻轻振荡充分混合，在冰上再放置15min。4℃下13200rpm离心10min，然后将所有的上清液一起都放在一个50ml的试管中。加入2.5倍体积的100％乙醇，在水和乙醇的交界处形成一层DNA团，然后混合。4℃3000g离心20min，小心地弃取上层清液。加20ml70％的冷乙醇，4℃3000g离心20min，小心地弃去上层清液。沉淀在空气中干燥15min，然后加入300-400μlTE缓冲液或重蒸水ddH2O，用移液器吸取溶液的办法使其混匀。模板DNA母液贮存在-80℃条件下。使用前稀释成浓度为50ng/μl溶液，存放在-20℃条件下。
第三步：复合PCR扩增
同实施例1第四步。
第四步：检测结果判定
同实施例1第五步。
实施结果：在所有的44份材料中有15份的复合PCR检测结果呈阳性，同实施例1中的结果完全一致，说明直接使用样品提取模板DNA进行复合PCR检测，省略菌的纯化富集是可行的。
实施例3玉米加工制品检测
本实验使用的材料为玉米加工制品玉米渣，玉米面，玉米饼，速冻玉米棒等共14份。
第一步：引物合成
操作步骤同实施例1第一步。
第二步：模板DNA提取
样品磨碎后按实施例2第二步的操作步骤提取模板DNA。
第三步：复合PCR扩增
同实施例1第四步。
第四步：检测结果判定
同实施例1第五步。
实施结果：
实验所收集的玉米制品上均未检测出腐马素产毒菌或其他菌株感染。或许与这些产品的来源有关，玉米棒及玉米粒这些天然产品多采自乡间农户，贮藏条件差，并且温度、湿度、卫生条件难以控制，较利于病原菌的侵染、生长和传播。而本实验中检测的玉米制品多为精加工制品，或具有独立包装，如玉米面，玉米饼，速冻玉米等，且多采自超级市场或商店，贮藏条件较好，不利于病原生长繁殖。
实施例4：本发明所设计的引物检测腐马素产毒菌株灵敏度及最小检出限的测定。
第一步：引物合成
操作步骤同实施例1第一步。
第二步：模板DNA稀释
以无菌水稀释串珠镰刀菌野生型染色体DNA浓度为10ng，1ng，100pg，10pg，1pg，
第三步：复合PCR扩增
把第二步稀释的模板DNA直接加入到实施例1第四步中的PCR反应体系中进行复合PCR扩增。
第四步：检测结果判定
同实施例1第五步。
实施结果：
测得fum1-F/fum1-R，fum8-F/fum-8-R，fum17-F/fum17-R，ItsR/ItsF的检出限分别为10pg，100pg，100pg，100pg(图2)。未加DNA的水对照结果为阴性。复合PCR检测限为1ng(图3)。
Claims (6)
1.一种玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：基于腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FUM1基因、丝氨酸-十六酰基转移酶基因FUM8、长寿保证因子基因FUM17，应用DNAman序列分析软件分别设计了多对引物，并与镰刀菌属特异性引物ItsF/ItsR一起，通过实验比较得到了特异性最佳的引物配组；在同一反应体系中同时检测腐马素产毒菌株；采用复合PCR技术，多对引物在同一反应体系中同时扩增；其检测步骤为：待检样品直接采用改良的SDS法提取模板DNA；然后经复合PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析得出检测结果。
2.根据权利要求1所述的玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：所述改良的SDS法提取样品模板DNA，其操作步骤为：将玉米或其制品磨成粉，取0.2g置于50ml的试管中，加入4mlDNA提取液并且涡旋使其充分混合；加入2ml的苯酚和1.5ml氯仿，涡旋振荡，2500g离心15min；将上清液转移到2ml的离心管中，每支中加上清液900ul，氯仿900ul，13200rpm离心5min；将上层溶液转移到新的2ml试管中，加入RNase I，终浓度C≥100μg/ml，然后在37℃培养2-3h；加入等体积的冷的5M氯化锂溶液，轻轻振荡充分混合，在冰上再放置15min；4℃下13200rpm离心10min，然后将所有的上清液一起都放在一个50ml的试管中；加入2.5倍体积的100％乙醇，在水和乙醇的交界处形成一层DNA团，然后混合；4℃3000g离心20min，小心地弃取上层清液；加20ml70％的冷乙醇，4℃3000g离心20min，小心地弃去上层清液；沉淀在空气中干燥15min，然后加入300-400μlTE缓冲液或重蒸水ddH2O，用移液器吸取溶液的办法使其混匀；模板DNA母液贮存在-80℃条件下，使用前稀释成浓度为50ng/μl溶液，存放在-20℃条件下。
3.根据权利要求1所述的玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：所述复合PCR反应所用引物共四对，fum1-F/fum1-R、fum8-F/fum8-R、fum17-F/fum17-R和ItsR/ItsF，其引物序列如下：
fum1-F GCAACTCACCTTACTCGCTATTC
fum1-R TGTTCAGAGGGGTCTTTGGTTA
fum8-F CACTGCATATGACTACCTCTTGGGAGGAT
fum8-R CTCGAATTCGGACATGTCCCTCGCGATAA
fum17-F CTTTTTCTAGCAACTTCTAAATCACTT AT
fum17-R TTGCTCGAGTTAGTCCCCATGCTCGATTTC
ItsF AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA
ItsR TTTAACGGCGTGGCCGC
其中fum1-F/fum1-R引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出635bp的产物，fum8-F/fum8-R引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出1152bp的产物，fum17-F/fum17-R引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出344bp的产物，ItsR/ItsF引物对在腐马素产毒菌株中特异性扩增出431bp的产物。
4.根据权利1、3要求所述的玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：所述复合PCR反应，其反应体系为：反应体系总体积为25μl，包括1.75μl的10×PCR缓冲液，1.5μl的25MmMgCl2，1.0μl的10Mm dNTP，0.5μl的Taq酶，2μl的模板DNA，1.8μl的引物，其余以重蒸水补足。
5.根据权利4要求所述的玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：1.8μl的引物中fum-1F、fum-1R、fum-17F和fum-17R各0.1μl，ItsF和ItsR各0.2μl，fum-8F和fum-8R各0.5μl。
6.根据权利1要求所述的玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合PCR检测方法，其特征在于：所述复合PCR反应，其反应条件为：预变性温度94℃，时间5min；循环数33，变性温度94℃，时间30s；退火温度53℃，时间45s；延伸温度72℃时间1min；终延伸温度72℃，时间10min；在4℃保存。
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