CN101724692A - 用于诊断桑细菌性枯萎病的引物及诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于诊断桑细菌性枯萎病的引物，上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了一种利用该引物诊断细菌性枯萎病的方法，包括以下步骤：将经表面消毒的桑树根去皮、切碎，置于无菌水中，离心振荡制得水悬液，以水悬液为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后用指示剂显色，如凝胶上存在DNA条带，则桑树感染了细菌性枯萎病，如无DNA条带，则桑树未感染细菌性枯萎病。发明引物特异性高，利用该引物检测桑细菌性枯萎病，检测周期短，比用常规方法节省时间90％以上，灵敏度和准确率较高。
Description
技术领域
本发明属于农作物防病治病及植物检疫领域，尤其涉及一种PCR法诊断桑细菌性枯萎病的引物及诊断方法。
背景技术
自2006年开始在桑树主栽区浙江杭嘉湖地区发现一种严重的桑树病，桑农在夏伐整枝后出现大面积桑树树枯死现象，被称为“桑树瘟”。经过对桑园的发病情况与病株症状的细致观察及深入研究，发现该病为一种全新的桑树细菌病害，中文命名为“桑细菌性枯萎病”，病原菌为“Enterobacter morus”(朱勃，王国芬，谢关林，周勤，徐福寿，李斌，陈建锋.2009.Enterobacter spp.：引起“桑枯萎”病的新证据.中国科学：C辑：211-219.)。
近年来由于该病不断蔓延而且发病程度日趋严重，已对蚕农造成了重大的经济损失，然而目前已报道的桑树细菌病害已达8种，特别是桑细菌性枯萎病的田间症状难以与“桑(细菌性)青枯病”和桑树因失水引起的生理性“凋萎”相区别，桑农和一般技术人员很难用常规的方法直接区分，进而导致防治措施没有针对性，不但浪费人力物力，更延误了防治该病的最佳时机以致造成重大损失。对田间桑细菌性枯萎病的早期诊断与病原检测刻不容缓。
传统病害诊断采用肉眼症状识别、病原菌分离、革兰氏染色、生理生化反应特性测定、Biolog等鉴定方法，周期长达一周，过程繁琐，且检测结果不一定可靠。PCR技术作为一种现在流行的病害分子诊断和病原检测手段，可有效地对这一未知病原的检测和病害诊断提供良好的帮助。
发明内容
本发明提供了一种用于诊断桑细菌性枯萎病的引物，该引物特异性高，解决了传统检测方法检测周期长的问题。
用于诊断桑细菌性枯萎病的引物，其上游引物的碱基序列如SEQ IDNO：1所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了一种利用上述引物诊断桑细菌性枯萎病的方法，包括以下步骤：
将经表面消毒的桑树根去皮、切碎，置于无菌水中，离心振荡制得水悬液，以水悬液为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后用指示剂显色，如凝胶上存在DNA条带，则桑树感染了细菌性枯萎病，如无DNA条带，则桑树未感染细菌性枯萎病。
所述的PCR扩增反应条件优选如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共进行40个循环；72℃延伸5min。
一种包含上述引物的试剂盒，该试剂盒PCR体系采用20μl体系时，具体组成如下：
2xTaq PCR Mix 10μl
上游引物 0.25μl
下游引物 0.25μl
ddH2O 8.5μl。
本发明引物特异性高，利用该引物检测桑细菌性枯萎病，检测周期短，比用常规方法节省时间90％以上，灵敏度和准确率较高。
附图说明
图1为各菌株利用本发明引物PCR扩增所得产物的凝胶电泳图；
图2a为附着在桑树根各菌株利用发明引物PCR扩增所得产物凝胶电泳图；
图2b附着在桑树茎各菌株利用发明引物PCR扩增所得产物凝胶电泳图；
图2c为附着在桑树叶的各菌株利用发明引物PCR扩增所得产物凝胶电泳图；
图3为采集的22个桑树根样本水悬液利用本发明引物PCR扩增所得产物凝胶电泳图。
图4为桑细菌性枯萎病病原与8株国际标准菌株rpoB序列的比较图。
具体实施方式
引物合成
通过比对桑细菌性枯萎病病原(Enterobacter morus)L1、L2、L3、L4和7株国际标准菌株(国际标准编号分别为Enterobacter cloacae subsp.dissolvens LMG2683T，E.cancerogenus LMG2693T，E.pyrinus LMG22970T，E.turicensis LMG23730T，E.helveticus LMG23732T，E.nimipressuralisLMG10245T及E.agglomerans LMG2557T)的rpoB序列，如图4所示，发现两个桑细菌性枯萎病病原的特异性区域(灰色)，根据该两个特异性区域，利用联配软件(ClustalW)及引物合成软件(Primer5)，得到一对引物，该引物的上游引物(EMrpobF)为5’-GCCAAGCCGATTTCTGGAGCA下游引物(EMrpobR)为5’-GCATACAGGTTAGCTTTGC，通过该对引物能特异性扩增大小约为300bp的DNA片段。上述引物可以通过常规方法合成，本实施例引物由上海生工生物工程有限公司合成。
提取DNA
取1.5ml的细菌培养物10000r/min离心2min；沉淀物加入467μl的TE缓冲液(pH 8.0)，用吸管反复吹打使之重悬。加入30μl 10％(重量/体积)的SDS和3μl 20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37℃水浴1h；加入等体积的酚氯仿，轻轻混匀，12000r/min离心10min，取上清液，加入占上清液体积1/10的NaAc(pH5.2)，混匀；加入占上述混合溶液体积0.6的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，冰浴20min，12000r/min离心5min；弃上清，加入1ml 70％(体积)的冰乙醇洗涤30s，12000r/min离心2min；弃上清，干燥，重溶于100μl的TE缓冲液(pH 8.0)，-20℃保存。
上述细菌培养物是指分别含有如下菌株的培养物：桑细菌性枯萎病病原L1、L2、L3和L4；桑青枯病病原(Pseudomonas solanacearum)、桑疫病病原(Pseudomonas syringae pv.mori)及8株与桑细菌性枯萎病病原近缘的国际标准菌株(国际标准编号分别为Enterobacter cloacae subsp.dissolvens LMG2683T，E.cancerogenus LMG2693T，E.pyrinus LMG22970T，E.amnigenus LMG2784T，E.turicensis LMG23730T，E.helveticusLMG23732T，E.nimipressuralis LMG10245T及E.agglomerans LMG2557T)。
为了进一步说明本发明引物的特异性，还分离纯化了了附着在桑树根、茎、叶的菌株的DNA，具体操作如下：
选取健康桑树根、茎、叶样本，浸入无菌水中，用接种针在NA平板上划线，选取形状不同的单菌落，置于NB培养液培养至指数期，按上述方法提取分离得到的菌株的DNA。
特异性检测
以上述提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物进行PCR扩增，反应条件如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共进行40个循环；72℃延伸5min。
PCR体系如下：
1μl DNA模板(约1ng)，上、下游引物各20pmol，2xTaq PCR-Mix 10μl(上海申能博彩公司生产)，ddH2O补足到总体积20μl。
PCR产物用1.5％的琼脂糖在1×TBE缓冲液中电泳后，用Goldview显色拍照，如图1所示，1～4道为桑细菌性枯萎病病原；5～12为桑细菌性枯萎病病原近缘的8个国际标准菌株；13～14分别为桑青枯病病原和桑疫病病原。可以发现四株桑细菌性枯萎病病原呈阳性反应，其它菌株均呈阴性反应。如图2所示，从桑树根、茎、叶分离的所有菌株均呈阴性反应，由此可见，本发明引物特异性高。
检测病原菌
选取表现出“凋萎”症状的桑树，截取桑树根作为试验材料，总共21个样本，具体检测操作如下：
先去掉桑根外层的土壤，然后用70％酒精泡洗3min，剥去外皮，用无菌水冲洗3次，每次1min。
接着将每个样本作两种处理，其中一种处理为：将桑树根用灭菌剪刀剪成小段，装入事先放有1ml无菌水的离心管中，装入离心机充分漩涡震荡，制得水悬液。
以该水悬液为模板，利用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物进行PCR扩增，反应条件与特异性检测中的扩增反应条件相同，PCR反应体系如下：
2μl水悬液，上、下游引物各20pmol，2xTaq PCR-Mix 10μl(上海申能博彩)，ddH2O补足到总体积20μl。
扩增产物用1.5％的琼脂糖在1×TBE缓冲液中电泳后，用Goldview显色拍照，观察凝胶电泳上DNA条带分布情况。如图3所示，2、10～15、21号样本均扩增出大约300bp的DNA片段。
另一种处理为：先去掉桑根外层的土壤，然后用70％酒精泡洗3min，剥去外皮，用无菌水冲洗3次，每次1min。然后用接种针在TTC平板上划线，置于30℃下培养，观察菌落生成情况，挑选不同形状的单菌落进行鉴定(朱勃等.2009.Enterobacter spp.：引起“桑枯萎”病的新证据.中国科学：C辑：211-219.)，鉴定结果与PCR检测方法得到的结果一致，说明利用本发明引物可以诊断桑细菌性枯萎病病原。
为了进一步提高检测速率，可以利用本发明引物制成试剂盒，该试剂盒和传统的PCR分子诊断试剂盒结构一样，由盒体和盒体内的PCR体系组成，如选用20μl体系时，其组成为：2xTaq PCR-Mix 10μl、上、下游引物各0.5μl以及ddH2O 8μl。进行PCR扩增时，直接加入模板DNA即可，简单方便。
SEQUENCE LISTING
<110>浙江大学
<120>用于诊断桑细菌性枯萎病的引物及诊断方法
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>桑细菌性枯萎病病原(Enterobacter morus)
<400>1
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<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>桑细菌性枯萎病病原(Enterobacter morus)
<400>2
cggtaacaac accgtcg 19
Claims (5)
1.用于诊断桑细菌性枯萎病的引物，其特征在于：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种利用权利要求1所述的引物诊断桑细菌性枯萎病的方法，包括以下步骤：
将经表面消毒的桑树根去皮、切碎，置于无菌水中，离心振荡制得水悬液，以水悬液为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后用指示剂显色，如凝胶上存在DNA条带，则桑树感染了细菌性枯萎病，如无DNA条带，则桑树未感染细菌性枯萎病。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应条件如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共进行40个循环；72℃延伸5min。
4.一种包含权利要求1所述的引物的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒内的PCR体系组成如下：
2xTaq PCR Mix 10μl
上游引物 0.25μl
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