CN101942505A - 致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒，属于病原微生物检测领域。基于致病性嗜水气单胞菌标准株J-1株16S rDNA基因组的高度保守区间所设计的引物用于致病性嗜水气单胞菌种属特性的区别鉴定，扩增片段685bp；以该菌所分泌的特异性蛋白酶气溶素所设计的第二对引物用于气单胞菌的致病性的判定，片段大小为301bp。本发明能够快速、准确的判定待检菌株的种属特性和致病性，通过对实验菌株和临床分离株的常规生化鉴定方法和致病性鉴定方法的比较试验得知，该试剂盒的符合率为100％。在对本试剂盒的特异性、重复性、敏感性和保存期的评价试验中，均得到了理想的结果。

Description

致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒 

技术领域

本发明涉及一种致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒，属于病原微生物检测领域，涉及用于人和易感动物的致病性嗜水气单胞菌的检测。 

背景技术

气单胞菌有广泛的致病性，感染包括冷血动物在内的多种动物如鱼类、禽类及哺乳类，引致败血症或皮肤溃疡等局部感染，是水生动物尤其是鱼类最常见的致病菌，运动性气单胞菌在水温高的夏季可造成鱼类细菌性败血症暴发流行。人类感染运动性气单胞菌引致急性胃肠炎等，目前在国外已将本菌纳入腹泻病原菌的常规检测范围，是食品卫生检验的对象。嗜水气单胞菌还见于人类败血症、腹膜炎、出血性尿综合征的病例。本实验室陆承平，陈怀青等于2002年起草制订了《致病性嗜水气单胞菌检验方法》的国家标准(GB/T 18652-2002)。该国标中所涉及到该致病菌的常规生化鉴定方法以及DOT-ELISA检测方法。本发明致病性嗜水气单胞菌双重PCR检测试剂盒采用聚合酶链反应，能够更加快速、准确、有效的鉴定出该致病菌，为该病菌引起的水产动物细菌性败血症暴发流行的防控工作奠定基础。 

如何实现致病菌的快速有效检测，是长期困扰临床的问题，有的细菌极难培养，如嗜肺军团菌，有的细菌生长缓慢，如结核分枝杆菌，还有麻风杆菌、炭疽杆菌等少数无法培养或者致病力很强的菌种。常见细菌用传统培养方法的检测时间大约为3-5天，临床亟待更加快速准确的检测方法。基于聚合酶链反应(PCR)扩增的基因诊断技术备受青睐，聚合酶链反应对象是针对特定模板DNA基因片段设计的一小段互补寡核苷酸，PCR技术模拟DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，该原理主要包括3个基本反应过程：变性-退火-延伸。变性主要是指双链DNA的变性，即双链DNA经加热后，其热稳定性降低，配对碱基之间的氢键断裂，使双链DNA成为单链，以便与引物结合。退火是指单链DNA在温度降低时与引物的复性(称为退火)。在此过程中，引物与单链DNA模板仍然按照碱基互补的方式配对。延伸是指引物与DNA模板按碱基互补的原则配对后，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，进行体外的半保留复制，合成一条新的与模板DNA链互补的新链。经重复循环变性-退火-延伸3个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。通过倍数级的扩增后，该反应体系中表达出大量的规定长度目的基因片段。PCR产物通过凝胶电泳试验来验证是否含有要求长度的基因组。通过PCR反应，能够在短时间内确定待检模板是否为目的产物，这是本发明的创新点之一。 

细菌核糖体的DNA含有3种类型，即23S rRNA、16S rRNA和5S rRNA，它们含有的核苷酸分别约为2900个，1540个和120个。20世纪中期，Woese开始采用寡核苷酸编目法对生物进 行分类，他通过比较各类生物细胞的rRNA特征序列，认为16S rRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。其主要依据为：它们为细胞所共有，其功能同源且最为古老，既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应。5S rRNA虽易分析，但由于核苷酸少，没有足够的遗传信息用于分类研究。而23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的2倍，分析较困难。与此相比，16S rRNA的相对分子质量适中，作为研究对象较理想。16S rRNA基因是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因。长度约为1500pb，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，其序列包含10个可变区(variable region)和与之相同的11个恒定区(constant region)，可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关，Woese等与Olsen等基于对16SrRNA的分析构建了现已被公认的全生命系统进化树，越来越多的细菌依据16SrRNA被正确分类或重分类，本发明依据已公布的嗜水气单胞菌已有基因组序列，设计合成了16SrDNA引物，16S rDNA基因是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因，用于鉴别判定待检菌株的种属特性，能够准确的判定待检菌株是否为嗜水气单胞菌，此为本发明的创新点之二。(16S rRNA在细菌分类鉴定研究中的应用，刘文强等，动物医学进展，2006，27(11)：15218) 

嗜水气单胞菌的毒力因子有三类，一是胞外产物如毒素、蛋白酶；二是粘附素，如S蛋白、4型菌毛、外膜蛋白等；三是铁载体。气溶素(aerolysin)或称HEC毒素，具有溶血性、细胞毒性及肠致病性，属于穿孔毒素。该毒素是由气单胞菌属菌株分泌的一类可溶性蛋白，是气单胞菌主要的毒力因子之一。气溶素在嗜水气单胞菌中以无活性的可溶性二聚体前体形式分泌。该前体与特异性的GPI-锚定蛋白相互作用，使得毒素的局部浓度增加，前毒素通过蛋白酶水解C-末端肽激活转变成气溶素。气溶素中的APT结构域(Aerolysin/pertussis toxin domain)与靶细胞表面的特异性受体结合，促进聚合，聚合之后气溶素转化成为插入的状态。插入的结果导致分散的细胞膜通道的产生，使得红细胞的渗透压升高并最终裂解。最近的研究表明气溶素形成通道之后，激活G蛋白，从而导致内部存储Ca2+的释放。Charkraborty等(1986)对其基因进行了克隆，从基因水平证明aerA结构基因存在于整个气单胞菌中，而在其它菌中并未发现，是气单胞菌特有的结构基因。气溶素缺失株比原毒株毒性大大减弱，为气溶素的致病性提供了有力的证据。气溶素具有强毒性，低浓度就可裂解敏感细胞。研究发现该毒素具有溶血性、细胞毒性和肠毒性；在高50mg/mL浓度下，该毒素也可以溶液的形式存在。气溶素在嗜水气单胞菌的毒力因子中起重要作用，是研究最深入的通道形成毒素之一。本发明根据已有的嗜水气单胞菌的气溶素基因序列，设计合成一对引物，用于判定该菌是否具有致病性，此为本发明的创新点之三。(陆承平主编，兽医微生物学，第四版，中国农业出版社，2007，127-131；) 

发明内容

技术问题 

本发明旨在针对现有致病性嗜水气单胞菌诊断检测技术某些方面的不足，寻找一种能够准确、快速、稳定、高效的检测致病菌的诊断方法。该试剂盒采用聚合酶链反应体系，以现 今公认的细菌全生命系统进化树16S rDNA设计合成一对引物作为判定该致病菌的种属特性；以现今研究最为广泛和深入的该致病菌所分泌的气溶素设计另外一对引物作为判定该菌致病性另一标准。 

技术方案 

用于检测人和易感动物的致病性嗜水气单胞菌双重PCR检测试剂盒，其特征在于：其特征在于：该检测试剂盒使用的引物为基于致病性嗜水气单胞菌标准株J-1株16S rDNA基因组的高度保守区间所设计的引物以及该菌所分泌的特异性蛋白酶气溶素所设计的第二对引物，16S rDNA引物用于致病性嗜水气单胞菌种属特性的区别鉴定，特异性扩增的目的片段大小分别为：685bp，其引物序列为 

P1：5’-GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3’ 

P2：5’-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3’ 

气溶素Aer引物用于气单胞菌的致病性的判定，特异性扩增的目的片段大小分别为301bp，其引物序列为： 

P1：5’-AACCGAACTCTCCAT-3’ 

P2：5’-P2：CGCCTTGTCCTTGTA-3’。 

双重PCR检测试剂盒的用法，包括： 

1)标准株的选择 

本发明中所使用的标准株为嗜水气单胞菌J-1株，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。该菌株已于2009年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.3220。 

2)特异性引物的制备 

本试剂盒检测的16S rDNA和气溶素Aer特异性引物的上游引物和下游引物的使用浓度为25μmol/μL；引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融； 

3)增菌 

将经感染鲫鱼复壮的J-1株接种于装有250mL LB肉汤的500mL的烧瓶中，于28℃，150rpm，摇振培养24h，染色镜检为革兰氏阳性菌； 

4)菌液的处理和PCR模板的制备 

(1)J-1菌体收集，吸取1.5μL菌液入EP管10000r/min离心min，弃上清； 

(2)向每管加入200μL细菌DNA粗提试剂用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞； 

(3)加入66μL 5mol/L NaCl，充分混匀后，12000r/min离心10min，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣；将上清转移到新离心管中，加入等体积Tris饱和的苯酚用，充分混匀后，12000r/min离心3min，进一步沉淀蛋白质； 

其中细菌DNA粗提试剂为Tris 4.8456g，乙酸钠1.6406g，EDTA 0.2923g，SDS 10.0g，灭菌双蒸水调配，加浓盐酸至pH8.0； 

(4)取离心后的水层，加等体积的氯仿，充分混匀后，12000r/min离心3min，去除苯酚；小心取出上清用预冷两倍体积的无水乙醇沉淀，15000r/min高速离心15min，离心弃上清液； 

(5)用400μL 70％的乙醇洗涤两次； 

(6)真空干燥后，用50μl超纯水溶解DNA，-20℃冰箱放置备用； 

5)PCR扩增试剂的组装 

采用双层纸板简易包装，其大小大约为长15cm，宽5cm，盒内组成：①细菌DNA粗提试剂12mL；②PCR扩增试剂0.8mL；③超纯水1mL；④阳性对照DNA0.1mL；⑤操作说明书一份；其中PCR扩增试剂为2×Taq plus PCR Master Mix 625(12.5×50)μl，16srDNA上下游各50μl，Aer上下游引物各50μl； 

6)双重PCR反应体系的建立和扩增 

取PCR扩增试剂16.5μl于PCR薄壁管，然后加入制备好的PCR模板2.0μl，最后加入超纯水补足至25μl即可将完成的PCR管放入PCR反应仪，； 

反应参数：94℃预变性5min后，进入循环：94℃变性30S、50℃退火30S、72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，取出于4℃保存； 

7)16S rDNA，气溶素基因检测结果判定与表述 

取10μl产物，点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，140V电压，电泳30min，于凝胶成相系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照(以超纯水替代检样模板)无任何条带出现，而阳性对照(标准株J-1株基因组模板)应该出现以下两条特异性条带，具体判定方法： 

阴性对照组无任何条带出现。电泳结果出现685bp处出现明显条带，表现为16srDNA基因组，判定为嗜水气单胞菌；电泳结果如果出现301bp和685bp处均出现明显条带，301bp表现为气溶素Aer基因组，判定为致病性嗜水气单胞菌。 

有益效果 

本发明通过比对已发表的嗜水气单胞菌16S rDNA和气溶素序列，设计并合成了针对以上基因组的两组序列，建立了多重PCR反应体系。通过对PCR反应体系中变性温度和时间，退火温度和时间，延伸温度和时间，循环次数等反应参数的预实验反应；通过敏感性试验，特异性试验，保存期实验以及同一批次、不同批次间内、外试验，最后将PCR反应产物送至上海英俊生物技术有限公司测定产物序列，从不同角度验证该检测试剂盒的准确、快速、稳定的特点。 

在已有基础上，应用该试剂盒对实验室保存的嗜水气单胞菌进行了检测验证，结果与预期结果一致。 

在已建立的双重PCR检测体系的前提下，本实验室通过比对该致病菌的胞外蛋白酶丝氨 酸胞外酶和弹性蛋白酶的核苷酸序列，设计合成了以上两种胞外蛋白酶的引物，分别建立了三重PCR反应体系和四重PCR反应体系，选取实验室的23株嗜水气单胞菌作为测试对象，与已建立的双重PCR检测体系相比较发现，双重PCR反应体系的检测结果能够覆盖多重PCR反应体系的检测结果，较之多重PCR检测体系，双重PCR检测体系能够更加稳定的鉴别致病性嗜水气单胞菌。 

附图说明：

图为16S rDNA，气溶素(Aer)基因检测结果判定。 

1阴性对照   2MARK    3阳性对照 

注：判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，而阳性对照的应该出现如上图所示的两条特异性条带。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件，例如，《分子克隆实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)(Sambrook等人)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。 

(一)致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的制备 

1.1疫苗株的选择 

本发明中所使用的疫苗株为嗜水气单胞菌J-1株。 

1.2特异性引物的制备 

本试剂盒检测的16srDNA和气溶素特异性引物扩增的目的片段人小分别为：685bp(16srDNA)、301bp(Aer)。上游引物和下游引物的使用浓度为25μmol/μL。可根据附录A.1给出的引物寡核昔酸序列人工合成。使用前按本标准要求进行稀释。引物稀释液置于-20℃保存备用。避免反复冻融。引物寡核普酸序列见附录A。 

1.3增菌 

将经感染鲫鱼复壮的Ah J-1接种于装有250mL LB肉汤的500mL的烧瓶中，于28℃，150rpm，摇振培养24h。染色镜检为革兰氏阴性菌。 

1.4菌液的处理和PCR模板的制备 

(1)菌体收集，吸取1.5μL菌液入EP管10000r/min离心min，弃上清； 

(2)向每管加入200μL细菌DNA粗提试剂用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞； 

(3)加入66μL 5mol/L NaCl，充分混匀后，12000r/min离心10min，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣；将上清转移到新离心管中，加入等体积Tris饱和的苯酚用，充分混匀后，12000r/min离心3min，进一步沉淀蛋白质； 

(4)取离心后的水层，加等体积的氯仿，充分混匀后，12000r/min离心3min，去除苯酚。小心取出上清用预冷两倍体积的无水乙醇沉淀，15000r/min高速离心15min，离心弃上清液。 

(5)用400μL 70％的乙醇洗涤两次。 

(6)(真空)干燥后，用50μl超纯水溶解DNA，-20℃冰箱放置备用。 

1.5PCR扩增试剂的组装 

采用双层纸板简易包装，其大小大约为长15cm，宽5cm，盒内组成：①细菌DNA粗提试剂12mL；②PCR扩增试剂0.8mL；③超纯水1mL；④阳性对照DNA0.1mL；⑤操作说明书一份。 

1.6双重PGR反应体系的建立和扩增 

取PCR扩增试剂16.5μl于PCR薄壁管，然后加入制备好的PCR模板2.0μl，最后加入超纯水补足至25μl即可。将完成的PCR管放入PCR反应仪。 

反应参数：94℃预变性5min后，进入循环：94℃变性30S、50℃退火30S、72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，取出于4℃保存。 

1.716srDNA，气溶素基因检测结果判定与表述 

取10μl产物，点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，140V电压，电泳30min，于凝胶成相系统下拍照判定，具体判定方法见下表： 

具体判定方法： 

阴性对照组无任何条带出现。电泳结果出现685bp处出现明显条带，表现为16srDNA基因组，判定为嗜水气单胞菌；电泳结果如果出现301bp和685bp处均出现明显条带，301bp表现为气溶素Aer基因组，判定为致病性嗜水气单胞菌。 

附录1 

目的基因 

附录2 

模板制备试剂 

·Tris 4.8456g 

·乙酸钠1.6406g 

·EDTA 0.2923g 

·SDS 10.0g 

灭菌双蒸水调配，加浓盐酸至pH8.0 

附录3 

PCR扩增试剂 

·2×Taq plus PCR Master Mix 625(12.5×50)μl 

·16srDNA上下游各50μl 

·Aer上下游引物各50μl 

(二)致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒特异性、重复性、敏感性和保存期评价 

本实施例中对实施例1中制备的致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒重复性、敏感性、稳定性和保存期等主要特征分别进行了测评。 

2.1试剂盒特异性试验 

选取选取J-1株，提取非嗜水气单胞菌基因组五株。按照试剂盒使用说明书操作进行。产物于1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。对J-1株进行扩增，可扩增到特异性条带；而对大肠杆菌IMT5155(马新蕾，王少辉，刘永杰等，禽致病性大肠杆菌IMT5155株毒力相关基因片段E9的表达及生物学特性分析，《畜牧与兽医》，20-24，295期)、葡萄球菌标准菌株(钟辉，姚火春，奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌临床分离株生化特性与菌体蛋白免疫原性分析，《农业生物技术学报》，2006年06期)、爱德华菌菌株(欧阳志明，陈怀青，陆承平，迟缓爱德华菌的粘附特性，《南京农业大学学报》，1997年03期)、猪链球菌(姚火春；陈国强；陆承平，猪链球菌1998分离株病原特性鉴定，《南京农业大学学报》，1999年02期)对照样品扩增，PCR结果均为阴性。 

(+：出现特异性条带；-：未出现特异性条带) 

2.2试剂盒灵敏度试验 

选取嗜水气单胞菌过夜培养物，提取基因组，用10倍比稀释10^-1-10^-8浓度后，各吸取2μl加入PCR反应体系，按照试剂盒操作使用说明书进行操作，根据试验结果测定本试剂盒的最低使用浓度。将不同稀释度制备的菌悬液进行PCR扩增，当菌液稀释10^-7，仍然可以得到有效的扩增。 

(+：出现特异性条带；-：未出现特异性条带) 

2.3重复性试验 

取不同批组装的3个试剂盒，分别在不同时间、不同操作条件(包括PCR仪、操作人员)下对阳性模板进行检测。根据多重PCR检测结果，本试剂盒重复性良好。 

(+：出现特异性条带；-：未出现特异性条带) 

2.4试剂盒保存期实验 

选取选取实验室J-1株和嗜水气单胞菌W1株基因组和反应混合液分装于EP管，于-4℃和-20℃保存，分别与30天，60天，90天，120天，150天不同时间进行PCR反应。产物于1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。将试剂盒分为2组，分别置于4℃和一20℃保存。 

(+：出现特异性条带；-：未出现特异性条带) 

通过优化双重PCR反应体系，组装了双重PCR检测试剂盒。对实验室已保存的阳性菌株进行扩增，均可扩增到特异性条带；而对大肠杆菌标准菌株、葡萄球菌标准菌株等对照样品扩增，PCR结果均为阴性，说明该试剂盒特异性强。用试剂盒检测不同稀释度的阳性样品，其检测灵敏度可达到100fg/mL，说明该试剂盒灵敏性高。试剂盒批间和批内重复性试验结果表明，该试剂盒具有良好的重复性。同时，本试剂盒在4℃和-20℃条件下保存五个月。实验室菌株的检测结果表明，本试剂盒能准确检测致病性嗜水气单胞菌的主要毒力因子，本研究研制的多重PCR检测试剂盒具有灵敏、特异、快速的优点，为我国动物源嗜水气单胞菌毒力基因的 检测及流行病学调查提供了新的技术手段。 

(三)致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒检测效果比较 

选取本实验室保存20株嗜水气单胞菌菌株(见下表)，从南京地区卫岗等四处农贸市场共取鱼样200尾，活体解剖采集鱼体肝、肾、脾等未污染病料，亦或是粪便或病变皮肤等污染病料，参照致病性嗜水气单胞菌检验方法(国标GB/T 18652-2002)，按照以下方案来验证致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒快速、准确、有效的特点。 

1.单胞菌的初步鉴定和模板的制备 

无菌操作沾取采集鱼体肝、肾、脾等未污染病料等2-3环于LB固体培养基中，28℃温箱过夜培养。挑取平板培养基上单个菌落，进行革兰氏染色，挑选镜检结果为短杆状革兰氏阴性菌做为检测对象。 

选取可疑菌落，挑取2-3环至5mL LB液体培养基中，密封。28℃，200r/min震荡培养10-12h。吸取1.5mL菌液入EP管，采取基因组试剂盒提取，氯仿法提取，饱和酚法提取，煮沸法提取，对结果进行比较，结果显示前三种方法均能够稳定、有效提取到细菌的基因组。 

2.嗜水气单胞菌的生化鉴定 

挑取培养基菌液，分别接种葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷及水洋苷等5种糖发酵试验管。28℃培养24h。试验管颜色从紫色变为黄色，判为嗜水气单胞菌。结果显示取样菌株中有十五株菌生化指标显示为嗜水气单胞菌。实验室保存菌株均为嗜水气单胞菌。 

挑取培养基表面菌落少许，涂布于浸有1％盐酸四甲基对苯胺的滤纸片上。10s内观察细菌涂布处的颜色细菌涂布处出现红色，判为嗜水气单胞菌。氧化酶反应结果与上述生化反应结果一致。 

3.斑点酶联免疫试验和脱脂奶平板鉴定嗜水气单胞菌的致病性 

将待检菌株接种于脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板，28℃培养24h。结果显示菌落周围出现清晰、透明的溶蛋白圈，判为阳性。结果见附表。 

4.致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的初步应用比较 

取PCR试剂16.5μl于PCR薄壁管，然后加入制备好的PCR模板2.0μl，最后加入超纯水补足至25μl，阴性对照为PCR反应的空白对照(以水代替DNA模板)。阳性对照为J-1株基因组。反应参数：94℃预变性5min后，进入循环：94℃变性30S、50℃退火30S、72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，取出于4℃保存。取10μl产物，点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，140V电压，电泳30min，于凝胶成相系统下拍照判定，结果见附表。 

附表： 

(J-1，PBS-10，FBS-35，DF850P，DF4-3CC，TK961010，DF4-2GC，MR-2，PEG14，HB04：任燕，致病性嗜水气单胞菌的检测与一种温敏胞外蛋白酶基因的克隆、表达及其免疫性研究，2006，硕士论文。(http://epub.cnki.net/grid2008/detail.aspx？filename＝2005087897.nh&dbname＝CMFD2005)Ah4332，BSK-10，SBS-104，HA9，SPS-103，T4，HB07，HB04，L316，AH9617：王春林，曹雪，刘晓丹，郭垆璞，胡婷，倪晓丹，刘永杰*，陆承平，嗜水气单胞菌不同分离株生化特性及胞外蛋白酶的检测，《畜牧与兽医》2008年06期。(http://dlib.edu.cnki.net/kns50/detail.aspx？QueryID＝219&CurRec＝1)

结果表明，应用本研究所建立的双重PCR检测体系，对临床分离株和本实验室保存菌株进行检测，检测结果与脱脂奶平板检测结果的符合率为100％。 

综上所述，本发明致病性嗜水气单胞菌双重PCR检测试剂盒采用聚合酶链反应，能够更加快速、准确、有效的鉴定出该致病菌，为该病菌引起的水产动物细菌性败血症暴发流行的防控工作奠定基础。本发明有以下创新点：1.采用聚合酶链反应体系，通过短时间的体外扩 增反应，能够得到大量的目的片段，确定待检模板是否为目的产物，实现待检菌株的快速有效检测。2.16S rDNA基因是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因。长度约为1500pb，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。本发明依据已公布的嗜水气单胞菌已有基因组序列，设计合成了16SrRNA引物，用于鉴别判定待检菌株的种属特性，能够准确的判定待检菌株是否为嗜水气单胞菌。3.气溶素在嗜水气单胞菌的毒力因子中起重要作用，是研究最深入的通道形成毒素之一。本发明根据已有的嗜水气单胞菌的气溶素基因序列，设计合成一对引物，用于判定该菌是否具有致病性，此为本发明的创新点之三。对嗜水气单胞菌的检测手段的研究方面，主要有选择性培养基鉴别培养法、常见细菌的快速诊断系统(API系统、Eenterotube系统、PhP系统、MicroID和Biolog系统)、葡萄球菌A蛋白协同凝集试验、免疫荧光技术、斑点酶联免疫吸附试验、单克隆抗体技术、聚合酶链反应、核酸探针技术等。选择性培养基鉴别培养法这种简单、实用，但是使用选择培养基时，温度和时间要求较严格，培养时间较长，只能用于粗略检测，不甚精确。常见细菌的快速诊断系统受到检测菌种的限制，无法判定菌株的致病性。免疫荧光抗体标记技术被认为比ELISA更敏感，但由于需要荧光显微镜，而使它的应用受到了限制。斑点酶联免疫吸附试验这种方法敏感性高、重复性好，具有较强的特异性，且可同时检测大量样本，并能区分致病性与非致病性，但点酶法的判定仍需建立在嗜水气单胞菌的种属鉴定的基础上。聚合酶链反应PCR具有简便快速和敏感性、特异性强的优点，是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。本发明设计了致病性嗜水气单胞菌的特异性引物，能够快速、准确的判定待检菌株的种属特性和致病性，通过对实验菌株和临床分离株的常规生化鉴定方法和致病性鉴定方法的比较试验得知，该试剂盒的符合率为100％。在对本试剂盒的特异性、重复性、敏感性和保存期的评价试验中，均得到了理想的结果。 

序列表

<110>南京农业大学

<120>致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒

<130>说明书

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>16S rDNA引物P1

<222>(1)..(23)

<223>

<400>1

gaaaggttga tgcctaatac gta                      23

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>16S rDNA引物P2

<222>(1)..(21)

<223>

<400>2

cgtgctggca acaaaggaca g                        21

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>气溶素Aer引物P1

<222>(1)..(15)

<223>

<400>3

aaccgaactc tccat                               15

<210>4

<211>15

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>气溶素Aer引物P2

<222>(1)..(15)

<223>

<400>4

cgccttgtcc ttgta                              15

Claims (3)

1.用于检测人和易感动物的致病性嗜水气单胞菌双重PCR检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒使用的引物为基于致病性嗜水气单胞菌标准株J-1株和16S rDNA基因组的高度保守区间所设计的引物以及该菌所分泌的特异性蛋白酶气溶素所设计的第二对引物。

2.根据权利要求1所述的双重PCR检测试剂盒，其特征在于：

16S rDNA引物用于致病性嗜水气单胞菌种属特性的区别鉴定，特异性扩增的目的片段大小分别为：685bp，其引物序列为

P1：5’-GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3’

P2：5’-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3’

气溶素Aer引物用于气单胞菌的致病性的判定，特异性扩增的目的片段大小分别为301bp，其引物序列为：

P1：5’-AACCGAACTCTCCAT-3’

P2：5’-P2：CGCCTTGTCCTTGTA-3’

3.权利要求1或2所述的双重PCR检测试剂盒的用法，包括：

1)标准株的选择

本发明中所使用的标准株为嗜水气单胞菌J-1株，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)，该菌株已于2009年8月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.3220；

2)特异性引物的制备

权利要求1所述的16S rDNA和气溶素Aer特异性引物的上游引物和下游引物的使用浓度为25μmol/μL；引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融；

3)增菌

将经感染鲫鱼复壮的Ah J-1接种于装有250mL LB肉汤的500mL的烧瓶中，于28℃，150rpm，摇振培养24h，染色镜检为革兰氏阴性菌；

4)菌液的处理和PCR模板的制备

(1)J-1菌体收集，吸取1.5μL菌液入EP管10000r/min离心min，弃上清；

(2)向每管加入200μL细菌DNA粗提试剂用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞；

(3)加入66μL 5mol/L NaCl，充分混匀后，12000r/min离心10min，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣；将上清转移到新离心管中，加入等体积Tris饱和的苯酚用，充分混匀后，12000r/min离心3min，进一步沉淀蛋白质；

其中细菌DNA粗提试剂为Tris 4.8456g，乙酸钠1.6406g，EDTA 0.2923g，SDS 10.0g，灭菌双蒸水调配，加浓盐酸至pH8.0；

(4)取离心后的水层，加等体积的氯仿，充分混匀后，12000r/min离心3min，去除苯酚；小心取出上清用预冷两倍体积的无水乙醇沉淀，15000r/min高速离心15min，离心弃上清液；

(5)用400μL 70％的乙醇洗涤两次；

(6)真空干燥后，用50μl超纯水溶解DNA，-20℃冰箱放置备用；

5)PCR扩增试剂的组装

采用双层纸板简易包装，其大小大约为长15cm，宽5cm，盒内组成：①细菌DNA粗提试剂12mL；②PCR扩增试剂0.8mL；③超纯水1mL；④阳性对照DNA0.1mL；⑤操作说明书一份；其中PCR扩增试剂为2×Taq plus PCR Master Mix 625(12.5×50)μl，16srDNA上下游各50μl，Aer上下游引物各50μl；

6)双重PCR反应体系的建立和扩增

取PCR扩增试剂16.5μl于PCR薄壁管，然后加入制备好的PCR模板2.0μl，最后加入超纯水补足至25μl即可将完成的PCR管放入PCR反应仪；

反应参数：94℃预变性5min后，进入循环：94℃变性30S、50℃退火30S、72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，取出于4℃保存；

7)16srDNA，气溶素基因检测结果判定与表述

取10μl产物，点样于1.0％琼脂糖凝胶电泳板孔中，140V电压，电泳30min，于凝胶成相系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，而阳性对照的应该出现以下两条特异性条带，具体判定方法：

电泳结果出现685bp则为16srDNA基因组判定为嗜水气单胞菌，电泳结果出现301bp和685bp双泳带判定为致病性嗜水气单胞菌。

Images