CN108504753A - 一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法 - Google Patents

一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法 Download PDF

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Abstract

为解决现有技术中采用PMA‑qPCR方法检测活菌时的假阳性和假阴性问题，本发明提供了一种改进的检测和确定乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，其在PMA‑qPCR方法的基础上，在PMA处理前增加了SDS处理步骤，在提取DNA前，增加了溶葡萄球菌素处理步骤，在qPCR过程中增加了蜡样芽孢杆菌DNA作为扩增内参，很好的解决了原有方法的假阳性和假阴性的问题，提高了检测方法的灵敏性和特异性。

Description

一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法
技术领域
本发明涉及一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，属于微生物检测领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性、球状致病菌，能够产生肠毒素。它能引起食物中毒或临床感染，如蜂窝组织炎和骨髓炎。金黄色葡萄球菌是乳业中牛乳腺炎和人类疾病感染的主要原因。生乳中金黄色葡萄球菌的存在也是乳制品食物链中病原体的潜在来源，随之而来的是食物污染的风险。包括美国和意大利在内的许多国家，金黄色葡萄球菌的流行程度很高。因此，准确检测金黄色葡萄球菌的方法在流行病学中是非常必要的。
用于检测金黄色葡萄球菌的常规方法廉价且可靠，但费力费时。而基于PCR的方法由于其特异性和灵敏性，则可以克服常规方法的这些缺点。具体而言，实时荧光定量PCR(qPCR)可以实时或者快速检测牛奶样品中的金黄色葡萄球菌。然而，使用qPCR难以区分活细胞和死细胞，这导致了活细胞数量会被高估，特别是当死细胞数量超过活细胞数量的时候。
因此，采用qPCR法检测牛奶中金黄色葡萄球菌活菌时，会存在假阴性和假阳性的问题。PMA(叠氮溴化丙啶)-qPCR检测技术和EMA(叠氮溴化乙锭)-qPCR是近年来兴起的活菌检测技术，其原理是设计细胞膜不透性同时具有DNA高亲和力的光反应染料PMA或EMA等，穿透受损细胞的细胞膜，并使PMA或EMA嵌入双链DNA，暴露在强烈的可见光下形成共价键修饰的DNA，使其在PCR反应中的扩增被抑制，以达到区分死、活菌检测的目的。
但研究发现PMA-qPCR或EMA-qPCR检测结果仍存在高于实际活菌值的情况，这意味着存在部分非活菌的DNA在qPCR反应中完成了扩增的情况。PMA-qPCR或EMA-qPCR检测技术在检测经低温处理的活菌时不能有效区分活菌和死菌，易出现检测值偏高，检测结果不准确的情况。
现有技术仍然存在改进相应检测方法，以提高检测的灵敏性和特异性，降低假阴性和假阳性结果的需求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种新的检测和确定乳中存活的金黄色葡萄球菌细胞数量的方法，其采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法。
一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌数量的方法，包括以下步骤：在提取菌体DNA之前，用细胞膜不透性的DNA亲和性的光反应染料处理菌体，光照反应后去除未反应的光反应染料，提取DNA进行实时荧光定量PCR(qPCR)，其特征在于：在用光反应染料处理菌体之前，向菌体中加入SDS。
优选所述SDS加入后的终浓度为50-150ppm，更优选为90-110ppm。在本发明的一个具体实施方式中SDS加入后的终浓度为100ppm。
优选在去除未反应的光反应染料之后、提取DNA之前，向菌体中加入溶葡萄球菌素或其类似物。
优选所述溶葡萄球菌素或其类似物加入后的终浓度为150-250μg/mL；更优选为200μg/mL。
优选所述光反应染料为PMA或EMA。在本发明的一个具体实施方式中所述光反应染料为PMA。
优选所述光反应染料加入后的终浓度为30-50μM，更优选为35-45μM。在本发明的一个具体实施方式中光反应染料加入后的终浓度为40μM。
在本发明的一个实施方式中，所述光照反应的处理方式为：充分混匀菌体和光反应染料，于暗处培养15-25分钟，优选20分钟，然后置于500W钨灯下曝光5-15分钟，优选为10分钟。
优选进行qPCR时，扩增金黄色葡萄球菌的上游引物序列为：5’-CACCTGAAACAAAGCATCCTAAA-3’(SEQ ID NO.1)、下游引物序列为：5’-CGCTAAGCCACGTCCATATT-3’(SEQ ID NO.2)。
在本发明的一个实施方式中，用于金黄色葡萄球菌的水解探针序列为：5’-TGGTCCTGAAGCAAGTGCATTTACGA-3’(SEQ ID NO.3)。
优选进行qPCR时，加入蜡样芽孢杆菌的DNA作为扩增内参。
优选扩增蜡样芽孢杆菌的上游引物序列为：5’-CGCAAGGCTGAAACTCAAAG-3’(SEQID NO.4)、下游引物序列为：5’-GAGGATGTCAAGACCTGGTAAG-3’(SEQ ID NO.5)。
在本发明的一个实施方式中，用于蜡样芽孢杆菌的水解探针序列为：5’-ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA-3’(SEQ ID NO.6)。
在本发明的一个实施方式中，所述qPCR的反应条件为：
qPCR反应体系(20μL)包含：10μL KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix，1μL DNA模板，上、下游引物各0.05μL(250nM)，水解探针为0.1μL(500nM)。
反应程序：95℃预变性10min，95℃变性15s，62℃退火1min，进行40个循环。
优选用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取DNA。
优选所述方法还包括乳品前处理步骤，所述前处理步骤是为了富集乳中金黄色葡萄球菌。在本发明的一个实施方式中，所述乳品前处理步骤包括，离心乳品，去除上层脂肪及上清，洗涤沉淀后重悬沉淀。在本发明的一个实施方式中，所述离心的条件为：10000r/min离心5-10分钟。在本发明的一个实施方式中，采用无菌生理盐水洗涤并重悬沉淀。
优选所述方法还包括利用已知浓度的梯度稀释的金黄色葡萄球菌菌液制备细菌数量和qPCR Cq值的标准曲线的步骤。在本发明的一个实施方式中，所述标准曲线的制备步骤包括：取金黄色葡萄球菌活菌悬液，进行适当稀释后使菌液浓度为107CFU/mL，然后提取DNA，将提取后的DNA按10倍梯度连续稀释5次，对每个浓度下的DNA分别进行qPCR反应，用CFX Manager 3.1计算得到标准曲线。
优选所述去除未反应的光反应染料的方法为，将光照反应后的菌体混合物离心，并洗涤沉淀。在本发明的一个实施方式中，所述离心条件为10000g离心20min，所述洗涤使用PBS。
本发明通过18株菌株验证发现所述金黄色葡萄球菌的引物具有良好的包容性和排他性。
根据本发明，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌，在提取DNA之前，加入溶葡萄球菌素或其类似物，有利于更好地提取DNA，提高本发明检测方法的灵敏性。
根据本发明，在用光反应染料处理菌体之前，使用SDS能增强光反应染料对菌体的渗透性。SDS在膜去稳定化方面非常有效，可用于精确区分活细胞和死细胞。发明人通过实验发现，与其他表面活性剂相比，如卵磷脂等，SDS促进光反应染料渗透性的效果更好。但SDS对活细胞的细胞膜也会产生损伤，需要选择SDS的加入浓度，保证SDS的促渗透作用和对活细胞的损伤作用恰当平衡。
根据本发明，在进行qPCR时，采用蜡样芽孢杆菌的DNA作为扩增内参，可以避免假阴性结果的出现。由于蜡样芽孢杆菌的DNA非常稳定，不易分解，有利于保证添加内参的有效作用。
根据本发明，优选用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取DNA，该方法的提取效率高于试剂盒法，提取的DNA浓度更高，可进一步提高检测方法的灵敏性。
本发明的方法可以快速检测出乳中金黄色葡萄球菌活菌，特异性强，灵敏度高，可以避免假阳性结果，并且进一步还可以避免假阴性结果。
术语定义
溶葡萄球菌素是由假葡萄球菌(Staphylococcus simulans)分泌的一种细胞外锌金属蛋白酶，即甘氨酰甘氨酸内肽酶，可以水解细胞壁肽聚糖上的五甘氨酸联接。
溶葡萄球菌素类似物，包括溶葡萄球菌素(野生型)、任何溶葡萄球菌素突变体或变体、任何保留了水解细胞壁肽聚糖上的五甘氨酸联接能力的相关酶，所述的酶能在体内或体外对葡萄球菌的细胞壁肽聚糖上的五甘氨酸联接进行蛋白分解。所述突变包括位点删除、插入、和替换突变。本发明里的溶葡萄球菌素类似物可重组表达或用别的方式表达。
根据本发明，术语“qPCR”一般指称为实时定量聚合酶链式反应。此技术使用PCR同时扩增并量化靶核酸，其中量化依靠插入荧光染料或序列特异性探针，其含有仅在与靶核酸杂交后可检出的荧光报告分子。
最简单的定量方法是使用插层荧光染料，例如SYBR绿或EVA绿。这些染料自行插入到特定产物延伸过程中产生的双链DNA分子中。随着PCR产物量的增加，更多的染料被掺入从而荧光信号增加。
另一种定量方式是使用序列特异性探针，有水解(TaqMan)或杂交(Light-Cycler)探针。水解探针在5’末端标记有荧光染料，在3’末端标记有淬灭物。由于淬灭物在空间上与报道染料接近，导致荧光信号的淬灭。水解探针在延伸期中在互补DNA的合成过程中被切去，报道染料和淬灭物分离，而发出荧光。杂交探针系统由两个探针组成，这两个探针彼此相邻地结合靶序列。两个探针均用荧光染料标记。用光源激发探针的5’末端的第一荧光基团(供体)，能够向3’末端的第二荧光基团发生荧光共振能量转移(FRET)引起第二荧光基团的激发。若在靶序列互补链的延伸过程中第一荧光基团被聚合酶所降解，FRET不再发生，荧光信号就会减少。
经常使用的荧光染料包括但不限于Fluophor1，Fluorphor2，氨基香豆素，氟化荧光素，Cy3，Cy5，铕，铽，BODIPY，丹磺酰，萘(naphtalene)，钌，四甲基罗丹明，6-羧基荧光素(6-FAM)，VIC，YAK，罗丹明和德克萨斯红(TexasRed)。经常使用的淬灭物包括但不限于：TAMRATM，6-羧基四甲基罗丹明，甲基红或黑暗淬灭剂(darkquencher)。
术语“实时”是指在PCR的每个循环中进行具体测量。靶序列的增加与荧光在循环与循环之间的增加或降低相关。在一次运行(通常由数个循环组成)结束时，在PCR的指数期基于所得的荧光信号进行定量。扩增的测量通常通过Cq(定量循环)值来完成，Cq值描述荧光第一次上升到显著高于背景荧光的循环值。
根据本发明，“细胞膜不透性的DNA亲和性的光反应染料”具有本领域通用的技术含义。它们具有细胞膜不透性，但对DNA具有高亲和力，能渗入细胞膜受损的细胞中，嵌入其双链DNA，在可见光下与DNA发生共价键合。已知的这种光反应染料包括但不限于PMA(叠氮溴化丙啶)、EMA(叠氮溴化乙锭)。
附图说明
图1SDS浓度对金黄色葡萄球菌活菌的抑制情况。横坐标为在3×107CFU/mL金黄色葡萄球菌溶液中加入的SDS浓度，纵坐标为平板培养后菌落数。
图2PMA浓度对qPCR的Cq值的影响。横坐标为DNA提取之前，加入的PMA浓度，纵坐标为qPCR的Cq值。
图3A-图3C不同浓度的溶葡萄球菌素下，提取的DNA在1×103-1×107CFU/mL，DNA浓度与qPCR的Cq值的标准曲线。
图4使用SDS-PMA-qPCR法在加标样品中检测金黄色葡萄球菌活菌。a组为加入活菌的牛奶样品，b组为加入活菌和死菌的牛奶样品，c组为加入活菌和死菌的牛奶样品。黑色柱子为加入SDS和PMA，灰色柱子为不加SDS和PMA。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。需要说明的是，实施例不能作为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员理解，任何在本发明基础上所作的改进和变化都在本发明的保护范围之内。
以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。
以下实施例中所采用的通用实验方法如下：
1、菌株的培养
将金黄色葡萄球菌(ATCC6538)和蜡样芽孢杆菌(ATCC11778)分别接种至LB培养液，在37℃摇床孵育24小时。取10毫升悬浮液转移到50毫升康宁管中，4℃下15000g离心3分钟，倒掉上清液，用0.85％的生理盐水重悬。为了确定菌液浓度，用生理盐水将其依次稀释6个梯度，取100μL在LB琼脂上涂布，37℃孵育24h后计数。
其他实验用菌株采用相同方法培养。
2、DNA提取
用TE buffer(10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0)将菌体重悬，加入溶葡萄球菌素(1000μg/mL，溶剂为去离子水)的储存液并调整其终浓度为200μg/mL，将混合液于37℃下培养1小时。DNA提取使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法，提取后的DNA用Nanodrop 1000分光光度计测定浓度，放置于-20℃下保存。
3、死菌的制备
将菌悬液在4℃下5000g离心10min，倒掉上清液，将菌体用0.1％的蛋白胨水重悬。重悬后的液体浓度调整为107-108CFU/mL，并平均分成两份。其中一份在90℃下加热20min制备死菌，另一份用来作为活菌。
实施例1
引物包容性和排他性验证
使用18株菌株，其中包括10株金黄色葡萄球菌标准菌株和另外8种已知菌株，用CTAB法提取细菌DNA。PCR反应体系(25μL)包括12.5μL Master Mix，模板DNA 2μL，上、下游引物各1μL，引物的浓度为4000nM，水8.5μL。
引物序列为：上游引物5’-CACCTGAAACAAAGCATCCTAAA-3’、下游引物5’-CGCTAAGCCACGTCCATATT-3’；
反应程序：95℃预变性10min，95℃变性15s，62℃退火1min，进行40个循环。扩增产物在1×TE缓冲液配制的2.5％的琼脂糖凝胶电泳中进行电泳。
如表1所示，采用上述引物，只有金黄色葡萄球菌的DNA显示出阳性信号，其他菌种的DNA均无阳性信号。这个结果说明选取的引物具有高度特异性且对其他菌种的DNA没有任何干扰。
表1用于包容性和排他性测试的菌株
实施例2
SDS浓度的优化
将SDS溶解在0.1％的蛋白胨水中，制备成20％的SDS储存液，然后灭菌。
金黄色葡萄球菌(ATCC6538)菌液(107CFU/mL)在90℃下加热处理35s，并在4℃下5000g离心10min。然后用不同浓度的SDS重悬，SDS的浓度分别为0、25、50、100、250、500、1000ppm。取100μL溶液涂平板，37℃下培养24h，观察菌落数量。根据SDS对金黄色葡萄球菌活菌的抑制情况选取最佳浓度。
如图1所示，当SDS浓度为0、25、50、100ppm时，对应的logCFU值分别为6.5、6.3、6.2、6.0。当SDS浓度为250、500、1000ppm时，logCFU值分别为4、4、0。从图中可见，当SDS浓度为100-250ppm时，logCFU值有一个急剧的下降。因此100ppm作为抑制死细胞信号的最佳浓度。
实施例3
PMA浓度的优化
将PMA溶解在无菌水中，制成10mM的储存液，在-20℃下避光保存。
在PMA处理前，先将等体积的金黄色葡萄球菌(ATCC6538)活菌液(107CFU/mL)和死菌液(107CFU/mL)均匀混合。取2mL混合液于离心管中，加入选取的最佳浓度的SDS溶液，然后加入不同浓度的PMA溶液，浓度分别为0、10、20、30、40、50μM，充分混匀后暗处培养20min，使PMA最大限度进入受损细胞内。然后将离心管置于500W钨灯下20cm处曝光10min(管口朝上，置于冰上)。曝光后的液体10000g离心20min以除去PMA并用PBS冲洗。随后用CTAB法提取基因组DNA，进行qPCR检测。
qPCR反应体系(20μL)：10μL KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix，金葡菌DNA模板和IAC的DNA模板各1μL，上、下游引物各250nM，体积为0.05μL，探针各500nM，体积为0.1μL。选取最大Cq值对应PMA浓度为最佳浓度。
引物序列为：上游引物5’-CACCTGAAACAAAGCATCCTAAA-3’、下游引物5’-CGCTAAGCCACGTCCATATT-3’；水解探针序列为：5’-TGGTCCTGAAGCAAGTGCATTTACGA-3’。
IAC引物序列为：上游引物5’-CGCAAGGCTGAAACTCAAAG-3’、下游引物5’-GAGGATGTCAAGACCTGGTAAG-3’；水解探针序列为：5’-ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA-3’。
反应程序：95℃预变性10min，95℃变性15s，62℃退火1min，进行40个循环，荧光信号被收集。
如图2所示，当PMA浓度为0、10、20、30、40、50μM时，对应的Cq值分别为20.6、20.8、20.7、21.2、23.5、23.0，将PMA最佳浓度定为40μM。
实施例4
qPCR反应体系(20μL)：10μL KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix，1μL DNA模板，上、下游引物各250nM，体积为各0.05μL，探针各500nM，体积为各0.1μL，引物和反应程序与实施例1中的PCR相同。
以蜡样芽孢杆菌的DNA作为IAC，其引物和探针序列与实施例1中的相同。
在反应体系中加入内参可以避免假阴性结果，如经过扩增反应金黄色葡萄球菌的结果是阴性，而蜡样芽孢杆菌的是阳性，则说明金黄色葡萄球菌的阴性结果可能是异常的，同时也能排除PCR反应仪器以及体系的问题。
溶葡萄球菌素浓度验证
三组梯度稀释的已知浓度的金黄色葡萄球菌溶液用来验证最佳溶葡萄球菌素的浓度。每组加入不同浓度的溶葡萄球菌素溶液，分别为50、100、200μg/mL。得到的标准曲线线性最佳的溶葡萄球菌素浓度对应为溶葡萄球菌素的最佳浓度。
取金黄色葡萄球菌ATCC6538活菌悬液，首先进行梯度稀释平板法确定菌液浓度为107CFU/mL，将菌液取出三份，每份2ml，每份在提取DNA之前加入溶葡萄球菌素储存液(1000μg/mL)，使溶葡萄球菌素终浓度为50、100、200μg/mL，然后用CTAB法提取DNA。将提取后的DNA按10倍梯度连续稀释5次。
按照本实施例所述qPCR的操作进行qPCR扩增反应，用CFX Manager 3.1计算得到标准曲线。
如图3A、3B和3C所示，当溶葡萄球菌素浓度分别为50、100和200μg/mL时，R2分别为0.866、0.904、0.998，E值分别为160、220、96％。当E值在90-110％的范围时，标准曲线线性良好。因此溶葡萄球菌素的最佳浓度为200μg/mL。
实施例5
用SDS-PMA-qPCR检测加标样品中的金黄色葡萄球菌活菌
实验使用超市购买的蒙牛UHT乳。经平板法验证其为无菌状态。牛奶被分成三组，为a、b、c三组，每组两份。a组加入金黄色葡萄球菌ATCC6538活菌菌液，使其终体积为2mL，活菌终浓度为3×105CFU/mL；b组加入金黄色葡萄球菌ATCC6538活菌菌液和死菌菌液，使其终体积为2mL，活菌终浓度为3×105CFU/mL，死菌终浓度为3×106CFU/mL；c组加入金黄色葡萄球菌ATCC6538活菌菌液和死菌菌液，其终体积为2mL，活菌终浓度为3×106CFU/mL，死菌终浓度为3×105CFU/mL。所有的样品一式三份。在DNA提取之前，分别设置为加SDS和PMA的处理，不加SDS和PMA的处理。所有样品均在提取DNA之前加入200μg/mL的溶葡萄球菌素进行处理。按照实施例4中记载的qPCR的反应条件进行qPCR实验。
如图4所示，SDS-PMA-qPCR法用来检测加标样品中的金黄色葡萄球菌活菌，以评估该方法的效率。如图4中a所示，当牛奶样品中加入3×105CFU/mL的活菌，提取DNA之前加入溶葡萄球菌素时，加入SDS和PMA的Cq值为24.4，不加SDS和PMA的Cq值为24.8。如图4中b所示，当牛奶样品中混入3×105CFU/mL的活菌和3×106CFU/mL死菌并加入溶葡萄球菌素时，加入SDS和PMA时的Cq值为24.7，不加入PMA和SDS时的Cq值为22.1。如图4中c所示，也有同样的趋势，当牛奶样品中加入3×106CFU/mL活菌和3×105CFU/mL死菌，并加入溶葡萄球菌素时，加入PMA和SDS的Cq值为24.0，不加入PMA和SDS时的Cq值为22.7。
上述实施例充分说明本方法特异性高，灵敏度强，并且能够精准检测乳中活的金黄色葡萄球菌。在DNA提取之前，加入合适浓度的SDS和PMA，假阳性信号可以完全被消除，通过应用IAC，假阴性结果也可以被消除，所以该方法可以同时避免假阳性结果和假阴性结果的出现。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法
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acaagcggtg gagcatgtgg ttta 24

Claims (10)

1.一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌数量的方法，包括以下步骤：在提取菌体DNA之前，用细胞膜不透性的DNA亲和性的光反应染料处理菌体，光照反应后去除未反应的光反应染料，提取DNA进行实时荧光定量PCR，其特征在于：在用光反应染料处理菌体之前，向菌体中加入SDS。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SDS加入后的终浓度为50-150ppm，更优选为90-110ppm，更优选为100ppm。
3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，在去除未反应的光反应染料之后、提取DNA之前，向菌体中加入溶葡萄球菌素或其类似物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶葡萄球菌素或其类似物加入后的终浓度为150-250μg/mL；更优选为200μg/mL。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述光反应染料加入后的终浓度为30-50μM，更优选为35-45μM，最优选为40μM；
优选所述光反应染料为PMA或EMA；优选为PMA。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，进行qPCR时，扩增金黄色葡萄球菌的上游引物序列为：5’-CACCTGAAACAAAGCATCCTAAA-3’、下游引物序列为：5’-CGCTAAGCCACGTCCATATT-3’；
优选用于金黄色葡萄球菌的水解探针序列为：5’-TGGTCCTGAAGCAAGTGCATTTACGA-3’。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，加入蜡样芽孢杆菌的DNA作为扩增内参；
优选蜡样芽孢杆菌的上游引物序列为：5’-CGCAAGGCTGAAACTCAAAG-3’、下游引物序列为：5’-GAGGATGTCAAGACCTGGTAAG-3’；
优选用于蜡样芽孢杆菌的水解探针序列为：5’-ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA-3’。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，用十六烷基三甲基溴化铵法提取DNA。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，还包括乳品前处理步骤，所述前处理步骤是为了富集乳中金黄色葡萄球菌；
优选所述乳品前处理步骤包括，离心乳品，去除上层脂肪及上清，洗涤沉淀后重悬沉淀。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括利用已知浓度的梯度稀释的金黄色葡萄球菌菌液制备细菌数量和qPCR Cq值的标准曲线的步骤；
优选所述标准曲线的制备步骤包括：取金黄色葡萄球菌活菌悬液，进行稀释后使菌液浓度为107CFU/mL，然后提取DNA，将提取后的DNA按10倍梯度连续稀释5次，对每个浓度下的DNA分别进行qPCR反应，用CFX Manager 3.1计算得到标准曲线。
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