CN104726576A

CN104726576A - 一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素a基因的方法

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Publication number: CN104726576A
Application number: CN201510111879.1A
Authority: CN
Inventors: 史贤明; 宋明辉; 施春雷; 张易; 崔妍
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2015-03-13
Filing date: 2015-03-13
Publication date: 2015-06-24
Anticipated expiration: 2035-03-13
Also published as: CN104726576B

Abstract

本发明公开了一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，及其检测靶基因、引物和探针。本发明方法为：使用PMA处理待测食品样品，消除死细菌DNA导致的定量过高问题；建立了快速定量检测食品中金黄色葡萄球菌活菌，筛查肠毒素A基因并能够指示PCR反应假阴性的PMA-qPCR检测方法。该检测方法可以在5-6h内，对食品中污染量在10³-10⁸cfu/g范围内的金黄色葡萄球菌进行准确定量，以及肠毒素A基因的筛查。本发明建立的检测方法，特异性强，定量准确，检测速度快且能检测活菌。

Description

一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法

技术领域

本发明涉及食品安全领域，尤其涉及一种定量检测食品中金黄色葡萄球菌活菌及肠毒素A基因的内标PMA-qPCR方法，及其检测靶基因、引物对和探针。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要的食源性和临床致病菌，由其引起的食物中毒是一个世界性的卫生问题，对公共健康和食品安全带来巨大威胁。2011年我国对速冻米面制品的《食品安全国家标准》进行了修订，其中金黄色葡萄球菌由不得检出调整为限量检出，生制品和熟制品中金黄色葡萄球菌的最高检测限分别为10⁴cfu/g和10³cfu/g。虽然国家限量标准进行了新的调整，但其配套的检测方法依然为传统的选择平板培养法，该方法不仅耗时久，需要5～7天，而且操作复杂，不能满足目前对食品进行快速风险评估以及致病菌溯源的要求。因此，食品安全监控行业急需开发一套与新国家限量标准相配套的，快速准确定量食品中金黄色葡萄球菌的检测技术。

荧光定量PCR(qPCR)技术，和传统培养方法相比，在检测时间、灵敏度、成本以及高通量方面都具有很大优势，可实现对致病菌的快速定性和定量检测。但是目前应用PCR技术检测致病菌无法区分活菌与死菌，降低了致病菌检测的准确有效性。叠氮溴化丙锭(propidium monoazide，PMA)是一种具有高亲和力的光敏反应DNA结合染料，它可以和定量RT-PCR联合使用，进行选择性的扩增活细胞DNA，不扩增死细胞DNA，提高检测的准确有效性。此外对于PCR检测技术，检测靶点的特异性对于致病菌的准确检测格外重要。由于靶点序列的变异、基因水平的转移等因素，往往会导致假阴性、假阳性等误检结果，检测靶点的特异性和数量限制了基于核酸分子检测金黄色葡萄球菌的能力。因此不断发掘新的金黄色葡萄球菌特异检测靶点势在必行。

多重qPCR技术能在一个反应中同时检测多种致病菌或者多个致病因子，具有更高效快速的优势。金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素A被认为是引起食物中毒的最主要致病因子，90％以上的金黄色葡萄球菌食物中毒菌株都携带肠毒素A基因。与大部分肠毒素不同，肠毒素A不受群体感应系统(agr)的调控，在细菌数目比较低的时候也能产生肠毒素蛋白，而且94ng的肠毒素A就能导致食物中毒，因此在允许食品中较低数目金黄色葡萄球菌存在的同时，有必要对食品中肠毒素A基因进行检测，来评估食品中污染肠毒素A的风险。因此，本领域的技术人员致力于开发一种能同时检测金黄色葡萄球菌活菌和筛查肠毒素A基因的多重荧光定量PCR体系，来准确检测食品中金黄色葡萄球菌的污染及和肠毒素A的筛查。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种能快速定量检测食品中金黄色葡萄球菌活菌，筛查肠毒素A基因，并指示PCR反应假阴性PMA-qPCR检测方法。通过一次多重qPCR就能够对食品中污染的金黄色葡萄球菌活菌进行快速定量，并同时筛查污染的金黄色葡萄球菌是否携带有肠毒素A基因。能同时检测金黄色葡萄球菌活菌和筛查肠毒素A基因的多重荧光定量PCR体系，来准确检测食品中金黄色葡萄球菌的污染及和肠毒素A的筛查。

本发明不论对食品工业生产流程中金黄色葡萄球菌的监测和终产品的质量控制，还是对政府部门食品安全的管理和监控都具有很重要的意义。

为实现上述目的，本发明提供了一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，包括以下步骤：

a)对待测样品进行前处理；

b)提取待测样品中的菌体DNA，优选采用Qiagen DNA提取试剂盒；

c)以步骤(b)中提取的菌体DNA为模板，用优化建立的PMA-qPCR反应体系

和反应条件，进行实时荧光定量Real-time PCR检测；

d)反应结束后，根据荧光定量PCR的扩增曲线和Ct值，依据预先建立的金黄色

葡萄球菌和肠毒素A基因的定量标准曲线，计算检验样品中金黄色葡萄球菌活

菌数量及判定肠毒素A基因的携带情况。

进一步地，步骤(a)中的前处理为用PMA处理待测样品，即利用叠氮嗅化丙锭(PMA)，共价结合食品中死菌的DNA，去除死菌的DNA，达到活菌检测的目的包括以下步骤：

1)称取食品样品，加入无菌生理盐水，样品与无菌生理盐水的质量与体积比为：

1：9，均质拍打100s，吸取均质液，然后10000rpm/min离心1min，弃上清；

2)加入TE(10％TritonX100)缓冲液，TE(10％TritonX100)缓冲液与步骤(1)

中的均质液体积相同，振荡混均，然后10000rpm/min离心1min，弃上清，；

3)加入TE(10％TritonX100)缓冲液，体积为步骤(2)中TE(10％TritonX100)

缓冲液体积的一半，振荡混均后，加入PMA工作液，使其终浓度为50μM。混

均后，暗室孵育5min，然后置于PMA-lite LED光分解仪器上作用15min。

进一步地，步骤(c)中PCR反应体系包含，金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的特异引物和探针，肠毒素A基因的特异引物和探针，及扩增内标的模板和探针。

进一步地，所述金黄色葡萄球菌特异检测靶基因RpiR的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

发掘本发明中金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR过程如下：通过公用数据检索下载搜集，建立关于金黄色葡萄球菌和非金黄色葡萄球菌的基因组数据库。选取一株金黄色葡萄球菌的基因组作为目标基因组，然后利用本实验室开发的食源性致病菌特异靶点发掘软件SMM-system进行金黄色葡萄球菌特异靶点的发掘。先把金黄色葡萄球菌目标基因组在金黄色葡萄球菌基因组数据库中进行BLASTN比对，所有与金黄色葡萄球菌基因组数据库中完全匹配的CDS序列，被判定为金黄色葡萄球菌同源的CDS序列。然后将金黄色葡萄球菌同源CDS序列作为查询序列，进一步与由非金黄色葡萄球菌建立的本地基因组数目库进行BLASTN比对，返回结果最低e-value≥0.1的CDS序列最终鉴定为金黄色葡萄球菌特异靶点序列。然后对这些筛选出来的特异靶点序列设计引物，分别进行特异性和灵敏度评价，最后证明RpiR基因对应的引物特异性和灵敏度最佳，因此选定RpiR基因作为金黄色葡萄球菌的检测靶标。

从NCBI GenBank下载RpiR基因的所有核酸序列，进行同源比对分析，查找RpiR基因的保守区域。同时从GenBank下载金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(sea)的碱基序列，然后进行同源比对分析，查找该基因的保守区域。分别在RpiR和sea的保守核酸序列区域，设计特异引物和目标探针。本发明用于检测特异靶基因RpiR核酸保守序列以及肠毒素A基因的保守核酸序列的引物对如下所示：

金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的正向引物RpiR-F序列为：

5’-GATTGCATGATTTTTGTGACGAA-3’

金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的反向引物RpiR-R序列为：

5’-GGCCACCTGTGCAATTGACT-3’

肠毒素A基因的正向引物Sea-F序列为：

5’-GTGGTACACCAAACAAAACAGCTT-3’

肠毒素A基因的反向引物Sea-R序列为：

5’-TCTCTTCGGTCAATCGATTATTATCA-3’。

本发明的PMA-qPCR反应体系中的目标探针序列如下所示：

金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的探针序列为：

FAM-5’-CAAGGTAGTCATAGTGAATTG-3’-MGB；

肠毒素A基因sea的探针序列为：

VIC-5’-TGTATGGTGGTGTAACGTTA-3’-MGB；

扩增内标探针IAC探针序列为：

NED-5’-ATTGGTGCTGAATAGTGTGT-3’-MGB。

发明采用DNA Random Shuffling方法改组肠毒素A基因的探针序列，构建扩增内标探针，5’用荧光染料NED标记，3’用MGB标记，其特征如下，NED-ATTGGTGCTGAATAGTGTGT-MGB。然后用内标探针序列替代肠毒素A基因PCR产物中的目标探针序列，作为内标模板序列，使目标反应与内标反应具有大小、GC含量完全一样的PCR产物。其特征是，内标模板序列如SEQ ID NO:3所示。在反应体系中添加扩增内标，可以有效指示PCR反应的假阴性。

本发明中，步骤(c)中的的反应体系各溶液比例为：Premix Ex Taq(2x)：RpiR-F(10μM)：RpiR-F(10μM)：sea-F(10μM)：sea-F(10μM)：Probe-1(FAM,10μM)：Probe-2(VIC,10μM)：IAC探针(NED,10μM)：内标DNA(550copy)：模板：无菌水为12.5：0.5：0.5：0.5：0.5：0.5：0.5：0.5：1：5：3。其中最优体系为25μL，包括：PremixEx Taq(2x)12.5μL，RpiR-F(10μM)0.5μL，RpiR-F(10μM)0.5μL，sea-F(10μM)0.5μL，sea-F(10μM)0.5μL，Probe-1(FAM,10μM)0.5μL，Probe-2(VIC,10μM)0.5μL，IAC探针(NED,10μM)0.5μL，内标DNA(550copy)1μL，模板5μL，无菌水3μL。

步骤(c)中的最优的反应条件为：95℃预变性30s，再循环40次，每个循环的程序包括：95℃变性10s，60℃退火30s，收集FAM，VIC，NED三个荧光信号通道的信号，循环结束后，结束反应。

本发明在利用比较基因组学发掘金黄色葡萄球菌新检测靶点的基础上，建立了能够快速定量检测食品中金黄色葡萄球菌活菌，筛查肠毒素A基因，并能够指示PCR反应假阴性的内标PMA-qPCR检测方法。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明的检测靶点是自行通过比较基因组学、生物信息学筛选，并经过生物学验证得到的，具有单一特异性，弥补了原来检测靶点的特异性不强等缺陷；本发明在前期样品处理过程中通过添加PMA，消除了死细胞导致的定量过高问题；本发明在定量金黄色葡萄球菌活菌的同时，通过筛查肠毒素A基因的携带情况，来评估可能带来的风险；本发明建立的检测方法，检测检测时间短，特异性强，检测结果可靠，结果判定简单，更加具有实用性，对准确定量检测食品中的金黄色葡萄球菌具有非常重要的指导意义和应用价值。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明中金黄色葡萄球菌特异检测靶基因RpiR引物和探针特异性评价结果；

图2是本发明中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的引物和探针特异性评价结果；

图3是本发明中PMA-qPCR反应体系中检测靶基因RpiR的灵敏度评价结果；

图4是本发明中PMA-qPCR反应体系中肠毒素A基因的灵敏度评价结果；

图5是本发明中PMA-qPCR反应体系中扩增内标的有效扩增能力评价；

图6是本发明中PMA-qPCR反应体系在纯培养物中的荧光定量标准曲线；

图7是本发明中PMA-qPCR反应体系在速冻米面制品中的荧光定量标准曲线。

具体实施方式

实施例1

PMA-qPCR检测方法的建立

步骤一，检测引物和相关探针的设计

通过比较基因组学分析，获得金黄色葡萄球菌的特异检测靶基因RpiR。从NCBIGenBank下载RpiR基因的所有核酸序列，进行同源比对分析，查找RpiR基因的保守区域。该靶点序列的碱基序列信息如SEQ ID NO:1所示。同时从GenBank下载金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(sea)的碱基序列，然后进行同源比对分析，查找该基因的保守区域。肠毒素A基因的碱基序列信息如SEQ ID NO:2所示。

分别将RpiR和sea的碱基序列输入到Beacon designer7.0中，在两个基因保守区域设计引物对和探针，设置GC％范围为40-60％，产物大小范围为70-150bp之间，从备选引物对和探针中选出较好的引物对和探针，引物和探针序列见表1(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，探针由赛默飞世尔科技中国有限公司合成)：

表1 检测引物和相关探针序列信息

步骤二，扩增内标模板及其探针序列的设计

用DNA Random Shuffling方法改组肠毒素A基因的探针序列，构建扩增内标探针，5’用荧光染料NED标记，3’用MGB标记，其特征如下，NED-ATTGGTGCTGAATAGTGTGT-MGB。然后用内标探针序列替代肠毒素A基因PCR产物中的目标探针序列，作为内标模板序列，其特征是，内标模板序列如SEQ IDNO:3所示。扩增内标单链DNA模板由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，内标探针由赛默飞世尔科技中国有限公司合成。扩增内标模板及其探针序列添加到PMA-qPCR检测体系中，可以有效指示检测反应中的假阴性，提高检测的可靠性。

步骤三，PMA-qPCR检测体系及反应参数的优化(Probe Premix购自宝生物工程(大连)有限公司)。

对PMA-qPCR检测体系中的引物、探针及内标模板的浓度进行相关评价，以确定最佳反应体系。本发明所述的PMA-qPCR最优反应体系为25μL包括：Premix Ex Taq(2x)12.5μL，RpiR-f(10μM)0.5μL，RpiR-r(10μM)0.5μL，sea-f(10μM)0.5μL，sea-r(10μM)0.5μL，Probe-1(FAM,10μM)0.5μL，Probe-2(VIC,10μM)0.5μL，IAC探针(NED,10μM)0.5μL，内标DNA(550copy)1μL，模板5μL，无菌水3μL

然后将反应管离心后，放入荧光定量PCR反应仪中，然后在对应的软件界面中按照以下PCR循环参数进行：95℃预变性30s，然后40个循环，每个循环的程序包括95℃变性10s，60℃退火30s，收集荧光信号。

步骤四，PMA-qPCR检测体系的特异性及灵敏度测定

相关参考菌株：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)标准菌株包括ATCC13565(sea+)，ATCC8095(sea+)，ATCC29213(sea+)，ATCC14458，ATCC27664，ATCC27661。非金黄色葡萄球菌参照菌株：表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis(ATCC12228)，溶血性葡萄球菌Staphylococcus haemolyticus(ATCC29970)，模仿葡萄球菌Staphylococcus simulans(ATCC27851)，沃氏葡萄球菌Staphylococcus warneri(ATCC49454)，松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciuri(ATCC29061)，头状葡萄球菌Staphylococcus capitis(ATCC35661)，腐生型葡萄球菌Staphylococcus saprophytic type(ATCC49907)，肠炎沙门氏菌(ATCC13076)，大肠杆菌O157(ATCC25922)，阴沟肠杆菌(ATCC13047)，粪肠球菌(ATCC49452)，屎肠球菌(ATCC14025)，阪崎肠杆菌(ATCC29514)，蜡样芽孢杆菌(ATCC1220)，枯草芽孢杆菌(ATCC6633)，铜绿假单胞菌(IQCC12625)，痢疾志贺氏菌(CMCC51335)，肺炎克雷伯菌(ATCC13883)，变性杆菌(ATCC12453)，肺炎链球菌(ATCC27336)，枸橼酸杆菌(ATCC8090)，副溶血弧菌(ATCC33846)，单核细胞增生李斯特菌(ATCC13932)。(注：ATCC-美国标准菌种收藏所，CMCC-中国医学细菌菌种保藏管理中心，IQCC-检验检疫菌种保藏中心)。DNA的提取：取过夜培养的菌悬液1mL，转到1.5mL离心管中，10,000rpm离心2min，用无菌水洗涤1次，再次离心后采用试剂盒(Qiagen DNeasy Blood&TissueKit)提取DNA，提取的DNA模板在-20℃贮存备用。

取金黄色葡萄球菌以及非金黄色葡萄球菌的DNA稀释液，然后利用优化好的PMA-qPCR检测体系进行特异性验证。金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的评价结果如图1所示，所有金黄色葡萄球菌标准菌株均得到有效扩增(Ct<20)，其中阳性扩增曲线包含标准菌株6株。而在所有非金黄色葡萄球菌中没有有效扩增(Ct>35)。肠毒素A基因的特异评价结果如图2所示，所有的sea阳性金黄色葡萄球菌均获得有效扩增(Ct<20)，其中阳性扩增曲线包含标准菌株3株，而在sea阴性金黄色葡萄球菌中没有有效扩增(Ct>35)。表明RpiR和sea的相关引物和探针具有良好的特异性。

灵敏度评价：取金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC13565(sea+)过夜培养的菌液，采用试剂盒(Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit)提取DNA后，进行10倍梯度稀释，然后用优化好的荧光定量Real-time检测体系进行扩增，以确定RpiR和sea最低DNA检测下限。RpiR的评价结果如图3所示，sea的评价结果如图4所示，其中A-E代表的DNA浓度分别为A：115pg/μL；B:11.5pg/μL；C:1.15pg/μL；D:115fg/μL；E:11.5fg/μL。由结果可知，标准菌株基因组DNA等比稀释，Q-PCR结果呈现规律性Ct值变化，说明荧光定量PCR检测体系和仪器参数稳定。其中金黄色葡萄球菌的检测靶点RpiR的最低检测下限为115fg/μL，而肠毒素A基因的最低检测下限同样为115fg/μL。由于内标和肠毒素A基因存在竞争关系，当肠毒素A基因的模板浓度>11.5pg/μL时，内标不能获得有效扩增(如图5所示)。

步骤五，PMA-qPCR定量标准曲线的绘制。

纯培养物中定量标准曲线的绘制：将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC13565(sea+)过夜培养的菌液，进行平板计数后，使用生理盐水进行10倍梯度稀释，浓度梯度分别为1.02×10⁷cfu/mL，1.02×10⁶cfu/mL，1.02×10⁵cfu/mL，1.02×10⁴cfu/mL，1.02×10³cfu/mL，1.02×10²cfu/mL，1.02×10¹cfu/mL，每个浓度梯度3个平行，PMA处理后，采用试剂盒(Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit)分别进行DNA的提取。提取结束后，每个浓度梯度平行加入3个反应管，同时进行扩增。反应结束后，根据获得的有效Ct值(Ct<35)，绘制金黄色葡萄球菌在纯培养物中的Real-time PCR定量标准曲线。结果如图6所示，金黄色葡萄球菌的检测靶点RpiR在金黄色葡萄球菌菌液浓度10¹-10⁷cfu/mL之间可以获得良好线性关系(Ct<35)，得到的线性回归方程为：y＝-3.1032x+38.515，R²＝0.996。而肠毒素A基因在菌液浓度10²-10⁷cfu/mL之间可以获得良好线性关系(Ct<35)，得到的线性回归方程为：y＝-3.4001x+40.905，R²＝0.9998。

速冻米面制品中定量标准曲线的绘制：

将金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC13565)的过夜菌液，平板计数后进行梯度稀释。分别称取25g不携带金黄色葡萄球菌的速冻猪肉水饺和速冻小馒头，依次加入225mL生理盐水，用均质仪拍打100s后，各取900μL均质液，分别加入100μL梯度稀释的菌液，每个浓度梯度3个平行，使食品均质液污染的金黄色葡萄球菌的量分别为1.9×10⁸cfu/g，1.9×10⁷cfu/g，1.9×10⁶cfu/g，1.9×10⁵cfu/g，1.9×10⁴cfu/g，1.9×10³cfu/g，1.9×10²cfu/g和1.9×10¹cfu/g。

PMA处理食品样品。在1mL均质液中加入2.5μL 20mM的PMA，使其终浓度为50μM。振荡混均，暗室室温放置5min，使PMA与死细胞中的DNA充分结合。LED光分解仪作用15min，使死细胞的DNA不能参与后续PCR的扩增。然后采用试剂盒(Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit)分别进行基因组DNA的提取。提取结束后，每个浓度平行加入3个反应管，同时进行扩增，反应结束后。把不同速度米面制品中获得的有效Ct值进行综合评价，绘制金黄色葡萄球菌在速冻米面制品中的Real-time PCR定量标准曲线。结果如图7所示，速冻米面制品中，金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR在菌液浓度10³cfu/g-10⁷cfu/g之间可以得到有效扩增，线性良好，得到的线性回归方程：y＝-3.1777x+42.287，R²＝0.9943。结果如图7所示，肠毒素A基因在菌液浓度10³-10⁷cfu/g之间可以得到有效扩增，线性良好，但是没有金黄色葡萄球菌靶点RpiR的扩增效率高，得到的线性回归方程：y＝-3.3333x+46.335，R²＝0.9973。

实施例2

PMA-qPCR检测方法的性能评估

把过夜培养的金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC13565(sea+)和标准菌株ATCC25923(sea-)，平板计数后进行梯度稀释。称取25g金黄色葡萄球菌阴性的速冻猪肉水饺，加入225mL生理盐水，用均质仪拍打100s后，取900μL均质液，分别加入100μL稀释的纯培养物，每个浓度梯度3个平行。单独用标准菌株ATCC 13565和ATCC 25923污染食品样品，使污染食品的菌株浓度约为10²cfu/g，10³cfu/g，10⁵cfu/g和10⁷cfu/g以及混合菌株污染食品样品(选择两个浓度梯度，分别约为：10⁷cfu/g ATCC25923和10³cfu/g ATCC 13565，10⁷cfu/g ATCC 25923和10⁵cfu/g ATCC 13565，每个浓度梯度3个平行)。然后用PMA处理食品样品，采用试剂盒(Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit)分别进行基因组DNA的提取。污染后的样品同时进行梯度稀释，采用国标GB4789的方法进行金黄色葡萄球菌的平板计数。采用PMA-qPCR方法，来进行金黄色葡萄球菌的定量，根据Ct值，利用前面建立的速冻米面制品中金黄色葡萄球菌Real-time PCR定量标准曲线，计算污染速冻食品的金黄色葡萄球菌的浓度。对比国标BP平板计数方法和荧光定量PCR结果(表2)，表明当金黄色葡萄球菌在食品中的污染量在10³cfu/g以上时，荧光定量获得的结果与BP平板计数获得的结果具有较好的一致性(>80％)，但是荧光定量PCR结果普遍比BP平板计数获得的定量结果低。

表2 人工污染速冻米面制品的检测结果

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)对待测样品进行前处理；

b)提取待测样品中的菌体DNA；

c)以步骤(b)中提取的菌体DNA为模板，用优化建立的PMA-qPCR反应体系和反应条件，进行实时荧光定量Real-time PCR检测；

d)反应结束后，根据荧光定量PCR的扩增曲线和Ct值，依据预先建立的金黄色葡萄球菌和肠毒素A基因的定量标准曲线，计算检验样品中金黄色葡萄球菌活菌数量及判定肠毒素A基因的携带情况。

2.如权利要求1所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特征在于，所述步骤(a)中的前处理为PMA法处理待测样品，包括以下步骤：

1)称取食品样品，加入无菌生理盐水，样品与无菌生理盐水的质量与体积比为1：9，均质拍打100s，吸取均质液，然后10000rpm/min离心1min，弃上清；

2)加入TE(10％TritonX100)缓冲液，TE(10％TritonX100)缓冲液与步骤(1)中的均质液体积相同，振荡混均，然后10000rpm/min离心1min，弃上清，；

3)加入TE(10％TritonX100)缓冲液，体积为步骤(2)中TE(10％TritonX100)缓冲液体积的一半，振荡混均后，加入PMA工作液，使其终浓度为50μM。混均后，暗室孵育5min，然后置于PMA-lite LED光分解仪器上作用15min。

3.如权利要求1所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特征在于，步骤(c)中PCR反应体系包含，金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的特异引物和探针，肠毒素A基因的特异引物和探针，及扩增内标的模板和探针。

4.如权利要求1所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌特异检测靶基因RpiR的碱基序列如SEQ IDNO:1所示。

5.如权利要求3所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特征在于，所述特异引物包括：

金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的正向引物RpiR-F序列为：

5’-GATTGCATGATTTTTGTGACGAA-3’；

金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的反向引物RpiR-R序列为：

5’-GGCCACCTGTGCAATTGACT-3’；

肠毒素A基因的正向引物Sea-F序列为：

5’-GTGGTACACCAAACAAAACAGCTT-3’；

肠毒素A基因的反向引物Sea-R序列为：

5’-TCTCTTCGGTCAATCGATTATTATCA-3’。

6.如权利要求3所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特征在于，所述探针包括：

金黄色葡萄球菌特异检测靶点RpiR的探针序列为：

FAM-5’-CAAGGTAGTCATAGTGAATTG-3’-MGB；

肠毒素A基因sea的探针序列为：

VIC-5’-TGTATGGTGGTGTAACGTTA-3’-MGB；

扩增内标探针IAC探针序列为：

NED-5’-ATTGGTGCTGAATAGTGTGT-3’-MGB。

7.如权利要求3所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特征在于，所述扩增内标模板序列如SEQ ID NO:3所示。

8.如权利要求1所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特征在于，所述步骤(c)中的反应体系包括：以下溶液体积比为：Premix Ex Taq(2x)：RpiR-F(10μM)：RpiR-F(10μM)：sea-F(10μM)：sea-F(10μM)：Probe-1(FAM,10μM)：Probe-2(VIC,10μM)：IAC探针(NED,10μM)：内标DNA(550copy)：模板：无菌水为12.5：0.5：0.5：0.5：0.5：0.5：0.5：0.5：1：5：3。

9.如权利要求1所述的一种检测食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素A基因的方法，其特征在于，步骤(c)中的反应条件为：95℃预变性30s，之后循环40次，每个循环的程序包括95℃变性10s，60℃退火30s，收集FAM，VIC，NED三个荧光信号通道的信号，循环结束后，结束反应。