CN107312849B

CN107312849B - 一种检测牛支原体的cpa检测方法及其试剂盒与应用

Info

Publication number: CN107312849B
Application number: CN201710585360.6A
Authority: CN
Inventors: 张亮; 杨宏军; 程凯慧; 解晓莉; 苗自利; 朱勤峰; 朱罗罗; 孙刚; 胡林; 尤其敏
Original assignee: Ustar Biotechnologies Hangzhou Ltd; Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science
Current assignee: Ustar Biotechnologies Hangzhou Ltd; Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science
Priority date: 2017-07-18
Filing date: 2017-07-18
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2037-07-18
Also published as: CN107312849A

Abstract

本发明公开了一种检测牛支原体的CPA检测方法及其试剂盒与应用，该引物包括5条引物，采用交叉引物恒温扩增技术对待检测样品的DNA进行扩增，本发明可以100%扩增到临床分离到的牛型支原体，且特异性强，能够与其他常见牛源病原菌进行区分。本发明灵敏度高、检测耗时短、实用性强，不需要昂贵的精密仪器，反应1小时可检出10个拷贝以上的阳性质粒。

Description

一种检测牛支原体的CPA检测方法及其试剂盒与应用

技术领域

本发明属于动物病原分子检测领域，具体涉及一种用于检测牛支原体的CPA引物及其试剂盒与应用。

背景技术

牛型支原体(mycoplasma bovis)是引起成母牛乳腺炎、犊牛肺炎和关节炎的重要病原之一，有较强的传染性，并常与其他病原菌混合感染，严重威胁牛群健康，给养牛业造成了巨大的经济损失。牛型支原体在1961年首次于患有乳腺炎牛的牛乳中分离得到，我国自2008年首次报道了牛型支原体肺炎之后，不断有各地牛场发生犊牛牛型支原体肺炎死亡和成母牛型支原体乳腺炎的病例。因为支原体没有细胞壁，许多抗生素对牛型支原体无治疗效果，准确诊断是否发生支原体感染是临床用药的重要参考依据。因此，建立一种快速准确的检测方法对牛型支原体的防控和治疗有着重要意义。

基于分子水平对牛型支原体特异性基因进行PCR扩增可以及时准确的进行病原鉴别，但常规PCR、巢式PCR、荧光定量PCR，都必须依赖昂贵的精密仪器，检测费用高，耗时较长，且对检测人员有较高的技术要求，无法满足牧场现场诊断的需求。交叉引物恒温扩增法(Crossing-primer amplification,CPA)是目前我国唯一独立知识产权的恒温扩增技术，可以在恒温条件下快速、特异、灵敏地扩增目标序列，并且不需要昂贵的检测设备，只需要一台可以提供恒温环境的仪器(如水浴锅或便携式恒温电热器)。在大大降低了检测费用的同时，可直接应用于临床现场检测。另一方面，相比环介导等温扩增检测方法，该方法可对检测引物进行标记，并在扩增反应后采用胶体金进行直观的结果判定，更适合用于临床检测。

发明内容

针对以上现有技术，本发明提供了一种用于检测牛支原体的CPA引物及其试剂盒与应用，可实现快速、灵敏、特异而又简单实用的检测牛支原体。

本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种用于检测牛支原体的CPA引物，根据牛支原体特异性基因UvrC，通过引物设计软件oligo按照CPA引物要求进行引物设计，最终确定在946bp-1125bp的碱基序列之间5个不同区域设计5条特殊的引物，并分别对两条检测引物的5’末端进行荧光素(6-FAM)和生物素(Biotin)标记，标记后的扩增产物可采用胶体金进行检测。所述引物如下：

MPB2-BF：5'-TAT TGA CGT ATT TGC TTA T-3'，序列如SEQ ID NO：1所示；

MPB2-CPF：5'-CTT AAA CCT AGT GGA ATT GCC TTC TAT CGC TAT GGA ATA T-3'，序列如SEQ ID NO：2所示；

MPB2-DR：5'-6-FAM-TTA AAT TAA CCT TGT TGA T-3'，序列如SEQ ID NO：3所示；

MPB2-MBR：5'-BIOTIN-CTT AAA CCT AGT GGA ATT G-3'，序列如SEQ ID NO：4所示；

MPB2-BR：5'-AAA TTA TCT GGC AGT ATT T-3'，序列如SEQ ID NO：5所示。

以上字母缩略皆为：引物编号。

其中，所述MPB2-BF、MPB2-BR为外引物，反应中主要起到帮助检测引物形成主要扩增结构的作用，所述MPB2-CPF、MPB2-DR和MPB2-MBR为检测引物，反应中为主要的扩增引物。

需要说明的是，本发明中的所涉及的引物是本发明成功的关键。在引物设计中不仅需要满足常规PCR引物的条件，还需根据CPA方法和目标序列的本身特点进行引物的初步设计，受限于方法本身，5条引物的设计都需要进行严格的筛选。本实验初期设计了10套引物组合进行生物信息学分析后，仅有2组符合要求。2组引物进行试验初筛，其过程包括引物二聚体和非特异性扩增检测。通过初筛后，还需对引物进行特异性和灵敏度检测，以保证检测方法的可靠性。最后，进行引物浓度和反应体系中各成分的正交试验，最终确定本专利所涉及的引物组合可保证本检测方法在特异性、灵敏度上达到最优。

本发明的第二个方面，提供一种用于CPA检测牛支原体的试剂盒，该试剂盒包含上述用于检测牛支原体的CPA引物。

本发明提供的试剂盒还包含以下成分：甜菜碱、dNTPs、BstDNA聚合酶缓冲液、BstDNA聚合酶、牛支原体DNA模板(待检测样品)和ddH₂0。

具体包括以下成分：

1.25 M甜菜碱(betaine)，200μM dNTPs，2.0μL 10×BstDNA聚合酶缓冲液，8UBstDNA聚合酶，2μL牛支原体DNA模板(待检测样品)，外引物各0.08μM，检测引物各0.64μM，ddH₂0补齐至20μL。

本发明的第三个方面，提供一种用于CPA检测牛支原体的试剂盒的使用方法，该使用方法包括：

(1)牛支原体基因组DNA的提取；

(2)交叉引物恒温扩增反应：将所述试剂盒内中除BstDNA聚合酶以外的其他试剂混匀置于PCR管中，95℃反应5min，立即冰浴1-2min；加入BstDNA聚合酶，并加入石蜡油，42℃扩增反应60min，95℃灭活10min后终止反应。

本发明的第四个方面，一种牛支原体的扩增方法，所述扩增方法包括步骤：在反应体系中进行CPA扩增，所述的反应体系中含有扩增牛支原体的5条特异性引物。

所述反应体系还包含以下成分：甜菜碱、dNTPs、BstDNA聚合酶缓冲液、BstDNA聚合酶、牛支原体DNA模板(待检测样品)和ddH₂0。

本发明的第五个方面，提供一种采用交叉引物恒温扩增检测技术鉴定和/或非诊断性检测牛支原体的方法，包括以下步骤：

(1)用上述扩增方法扩增待检测样品；

(2)在扩增反应之后，鉴定和/或检测待检测样品是否含有牛支原体。

具体包括以下步骤：

(1)以待测样品基因组DNA为模板，以MPB2-CP、MPB2-DR和MPB2-MBR为检测引物对牛支原体DNA进行恒温扩增；将所述试剂盒内中除BstDNA聚合酶以外的其他试剂和牛支原体基因组DNA混匀置于PCR管中，95℃反应5min，立即冰浴1-2min；加入BstDNA聚合酶，并加入石蜡油，42℃扩增反应60min，95℃灭活10min后终止反应。

(2)扩增反应结束后进行结果判定，采用下述判定方法中的任何一种：

a.采用胶体金对检测产物进行直接检测，肉眼判断是否出现检测线；

b.采用琼脂糖凝胶电泳方法进行判定；

c.在反应体系中加入荧光染料，观察是否出现荧光峰。

步骤(1)中，所述待测样品为环境样本或是牛肺脏组织或是牛关节组织及其周围组织或是牛乳，其中牛肺脏组织、牛关节组织及其周围组织可以是不以有生命的动物体及其离体样品作为采集对象。

步骤(2)中，在判定方法a中，胶体金试纸条上出现检测线和质控线时，检测结果为阳性；只出现质控线时，检测结果为阴性；无质控线时，检测结果不成立，需重新检测。

在判定方法b中，在凝胶成相系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，且其中最小的一条为80bp大小，若是存在以上情况，则为牛支原体阳性，反之则为牛支原体阴性。

在判定方法c中，若40分钟内出现荧光峰则为牛支原体阳性，反之则为牛支原体阴性。

所述检测方法不仅可用于牛支原体的现场检测，还包括非疾病的牛支原体的检测，包括奶样、气溶胶样本、环境样本中支原体的检测，所述方法为非疾病的诊断方法。

本发明的第六个方面，包括以下任一应用：

(1)所述的引物在制备用于CPA检测牛支原体试剂盒、芯片、扩增反应试剂的应用；

(2)所述的引物在鉴定和/或检测牛支原体中的应用；

(3)所述的试剂盒在鉴定和/或检测牛支原体中的应用；

(4)所述的扩增方法在鉴定和/或检测牛支原体中的应用；

(5)所述的方法在鉴定和/或检测牛支原体中的应用。

所述应用方法为非疾病的诊断方法。

上述技术方案中的一个技术方案具有如下有益效果：

(1)经济实用：反应是在恒温的条件下进行，所以不需要昂贵的PCR仪等扩增仪器，只需要一台可以提供恒温的设备，比如水浴锅、控温杯等；相比于环介导等温扩增检测方法，本方法可采用胶体金替代电泳，判定方式更为直观，并可用于现场检测。

(2)灵敏度高：采用本方法可以检测下限至10个拷贝的牛型支原体目的基因，比普通的PCR的灵敏度高10-100倍；另外，本方法优选使用胶体金进行检测，检测灵敏度较电泳方法高5-10倍，且检测过程耗时短，约1分钟。相比牛支原体环介导等温扩增检测方法，该方法的结果检测更为灵敏和特异。

(3)特异性强：采用5条引物，识别5个位点，增加了与牛支原体目的基因结合的特异性。

(4)可视化检测：可通过胶体金检测，可直接肉眼判断检测结果，直观可靠。

本发明中，通过对CPA恒温扩增技术和胶体金试纸条检测技术的结合建立了一整套检测牛支原体的技术，CPA技术在牛支原体检测更具备广泛的应用前景。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：CPA反应产物的胶体金试纸条检测结果，图中线a区域为质控线，线b区域为检测线。

图2是荧光恒温扩增仪显示的CPA扩增曲线，图中a～c曲线为阳性样品扩增曲线，d～e曲线为阴性样品扩增曲线

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

以下实施例均按照常规试验条件与方法进行，或者按照制造厂商所建议的试验条件。

本发明使用的材料以及试剂均可以通过商业途径得到，其中胶体金试纸条购自杭州优思达生物技术有限公司。

实施例1引物的筛选

目前，CPA是一种新型的核酸恒温扩增技术，现有技术与牛支原体相关的引物并没有借鉴意义，并且牛支原体的CPA引物设计也没有相关的参考文献和实验数据可以借鉴，其引物的设计原理和规则与PCR、LAMP等扩增技术也不相同，在引物设计过程中，会产生诸多牛支原体的引物序列，通过筛选、比较各设计的引物序列，本发明在诸多的引物中筛选和优化得到了5条特殊的引物，并非常规的引物序列所能替代的，其他引物难以满足检测的准确性以及较高的扩增效率，进行牛支原体DNA的CPA检测时，灵敏度高、特异性强。本发明根据牛型支原体特异性基因UvrC，通过引物设计软件oligo按照CPA引物要求进行引物设计。实验中需要设计非常多的引物组，从中进行优化和筛选。

本发明通过初步分析得到表1中的两组引物组，最终确定在946bp-1125bp的碱基序列之间5个不同区域设计5条特殊的引物(即引物组合2)，并分别对两条检测引物的5’末端进行荧光素(6-FAM)和生物素(Biotin)标记，用于检测结果的判读。

表1引物组序列

注：Biotin：生物素标记；FAM：羧基荧光素标记。引物组合1为筛选淘汰引物组合，引物组合2为本专利涉及的引物组合。

实施例2一种用于CPA检测牛支原体的试剂盒

利用实施例1所提供的专用引物，得到本发明用于CPA检测牛支原体的试剂盒。本发明通过对引物浓度和反应体系中各成分的优化，得到该试剂盒包含以下成分：1.25M甜菜碱(betaine)，200μM dNTPs，2.0μL 10×BstDNA聚合酶缓冲液，8U BstDNA聚合酶，2μL模板，外引物各0.08μM，检测引物各0.64μM，ddH₂0补齐至20μL。

用于CPA检测牛支原体的试剂盒的使用方法，该使用方法包括：

(1)采用注射器式核酸提取方法提取牛支原体基因组DNA作为检测模板；

(2)交叉引物恒温扩增反应：将所述试剂盒内中除BstDNA聚合酶以外的其他试剂和牛支原体基因组DNA混匀置于PCR管中，95℃反应5min，立即冰浴1-2min；加入BstDNA聚合酶，并加入石蜡油，42℃扩增反应60min，95℃灭活10min后终止反应。

实施例3牛型支原体交叉引物恒温扩增检测方法

具体包括以下步骤：

(1)引物设计：根据牛型支原体特异性基因UvrC，通过引物设计软件oligo按照CPA引物要求进行引物设计。最终确定在946bp-1125bp的碱基序列之间5个不同区域设计5条特殊的引物，并分别对两条检测引物的5’末端进行荧光素(6-FAM)和生物素(Biotin)标记，具体见实施例1。

(2)培养牛型支原体：取4.5mL的PPLO液体培养基(配方：葡萄糖2.5g，PPLO粉21.0g，酵母粉2.5g，马血清150mL，10X MEM 10mL，12万单位青霉素1mL，1％(w/v)酚红溶液1mL，PH值在7.6-8.0，加水至1L)于灭菌的青霉素瓶中，按体积比为1:10加入牛型支原体菌液500μL；盖紧瓶口，置于37℃恒温培养箱中培养3天，待PPLO液体培养基由红色变为黄色且透亮时，表明牛型支原体培养成功。

(3)提取牛型支原体总DNA:取新培养的牛型支原体菌液500μL于1.5mL灭菌Eppendorf管中，12000rpm离心15min，弃上清，沉淀溶于200μL灭菌ddH20中。沸水浴10min后立即冰浴1-2min，待Eppendorf管冷却后-20℃保存备用。

(4)交叉引物恒温扩增反应:以MPB2-B、MPB2-BR为外引物，以MPB2-CP、MPB2-DR和MPB2-MBR为检测引物对牛型支原体DNA进行恒温扩增；其反应体系为：1.25M betaine，200μM dNTPs，2.0μL 10X BstDNA聚合酶Buffer,8U BstDNA聚合酶，2μL模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH₂0补齐至20μL；将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃5min，立即冰浴1-2min；加入8U BstDNA聚合酶，并加入20μL石蜡油，42℃反应60min，95℃灭活10min后终止反应。

(5)交叉引物恒温扩增反应产物分析：

分析方法1：采用胶体金对检测产物进行直接检测，肉眼判断是否出现检测线，如图1；

分析方法2：采用琼脂糖凝胶电泳，取9μL扩增产物，加入1μL 10×loding buffer(购自TAKARA公司)，混匀，在2％w/v的琼脂糖凝胶中电泳30min，用嗅化乙锭染色15min后，在凝胶成相系统上成像；

分析方法3：放入荧光恒温扩增仪或荧光定量PCR仪器进行反应60min，观察40分钟内是否出现荧光峰，如图2所示；

(6)结果判定：

在分析方法1中，胶体金试纸条上出现检测线和质控线时，检测结果为阳性，如图1中1号到20号检测试纸条；只出现质控线时，检测结果为阴性；无质控线时，检测结果不成立，需重新检测。

在分析方法2中，在凝胶成相系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，且其中最小的一条为80bp大小，若存在以上情况，结果为阳性，反之为阴性。

在分析方法3中，若40分钟内出现荧光峰则为牛型支原体阳性，反之则为牛型支原体阴性。

实施例4牛支原体CPA的灵敏性检测

提取牛型支原体基因组DNA，采用本发明中的MPB2-BF、MPB2-BR两条引物进行普通PCR扩增，电泳后回收约180bp大小DNA片段，连入T载体，进而转化大肠杆菌感受态细胞，涂琼脂板筛选后挑取菌落，过夜摇菌，并通过菌液PCR鉴定阳性菌，进而提取质粒DNA并定量，作为阳性模板。根据提取的质粒DNA浓度和质粒大小，计算每毫升的质粒数，对质粒DNA进行定量和稀释为1个/μL、10个/μL、100个/μL、1000个/μL、10000个/μL、100000个/μL，并设置阴性对照和阳性对照。采用本发明中“交叉引物恒温扩增反应”(参考实施例3中的方法)对各组进行扩增后，采用胶体金试纸条进行检测，发现本发明建立的牛型支原体交叉引物恒温扩增方法的检测限为10个拷贝。

实施例5牛支原体CPA的特异性检测

采用本专利所述的CPA检测方法对本实验室保存的23株不同菌株的DNA模板进行检测，显示牛型支原体标准株PG45(中国农业大学动物医学院惠赠)和8株临床分离株(本实验室保存的临床分离株)均为阳性结果，其它14株菌(详细菌株种类及来源见表2)检测均为阴性性结果，表明该方法具有很好的特异性。

表2.牛支原体CPA特异性试验所用14株菌株信息表

实施例6牛支原体CPA方法的临床应用及与常规PCR检测方法的对比

从3家牧场采集疑似牛型支原体感染的犊牛肺炎样品(鼻拭子)89份，采用注射器式核酸提取方法提取样品的全DNA作为检测模板。依照实施例3所述方法，对89份样品进行检测，并与常规PCR检测方法(对比方法参照专利CN201510308586.2)进行比较。检测统计结果如表1和表2.

表3.样品检测结果的统计

表4.CPA与PCR检测方法的比较

检测方法	阳性样品数	阴性样品数	阳性符合率	阴性符合率
					PCR	36	53	—	—
CPA	41	48	100％	90.57％

结果分析：该方法与PCR检测方法的阳性符合率为100％说明该方法具有相同的特异性；阴性符合率为90.57％，说明该方法的检出率高于普通PCR方法，具有更高的敏感性。综上，该方法在临床样品检测中具有优于普通PCR的表现。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院奶牛研究中心；杭州优思达生物技术有限公司

<120> 一种检测牛支原体的CPA检测方法及其试剂盒与应用

<130> 2017

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tattgacgta tttgcttat 19

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cttaaaccta gtggaattgc cttctatcgc tatggaatat 40

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttaaattaac cttgttgat 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttaaaccta gtggaattg 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaattatctg gcagtattt 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttgtatgtt ggtaaagca 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgaagcattc tcttgcgta 19

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgaattaata gcgccgtcag agtctactag tcctggtgtt 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tctactagtc ctggtgtttc atgaattaat agcgccgtca 40

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agaggctata aattaggta 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caggattata tctgtcaat 19

Claims

1.一种用于CPA检测牛支原体的试剂盒，其特征是：该试剂盒包含用于检测牛支原体的CPA引物，甜菜碱、dNTPs、BstDNA聚合酶缓冲液、BstDNA聚合酶和ddH₂0；所述CPA引物是根据牛支原体特异性基因UvrC设计5条引物，并分别对两条引物的5’末端进行荧光素和生物素标记，所述引物包括：

MPB2-BF：5'-TAT TGA CGT ATT TGC TTA T-3'，序列如SEQ ID NO：1所示；

MPB2-BR：5'-AAA TTA TCT GGC AGT ATT T-3'，序列如SEQ ID NO：5所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是，试剂盒使用时反应体系具体由以下成分组成：1.25M甜菜碱，200μMdNTPs，2.0μL 10×BstDNA聚合酶缓冲液，8U BstDNA聚合酶，2μL待检测样品，外引物MPB2-BF和MPB2-BR各0.08μM，检测引物MPB2-CPF、MPB2-DR和MPB2-MBR各0.64μM，ddH₂0补齐至20μL。

3.权利要求2所述的试剂盒非疾病诊断目的的使用方法，其特征是，该使用方法包括：

(1)牛支原体基因组DNA的提取；

4.如权利要求3所述的方法，其特征是，步骤(2)中，扩增反应结束后进行结果判定，采用下述判定方法中的任何一种：

b.采用琼脂糖凝胶电泳方法进行判定；

c.在反应体系中加入荧光染料，观察是否出现荧光峰。

5.一种牛支原体非疾病诊断目的的扩增方法，其特征是，所述扩增方法包括步骤：在反应体系中进行CPA扩增，所述的反应体系中含有扩增牛支原体的权利要求1中所述的5条特异性引物。

6.下述任一应用，包括：

(1)权利要求1中所述的5条引物在制备用于CPA检测牛支原体试剂盒、芯片、扩增反应试剂的应用；

(2)权利要求1中所述的5条引物在非疾病诊断目的的鉴定和/或检测牛支原体中的应用；

(3)权利要求1或2所述的试剂盒在非疾病诊断目的的鉴定和/或检测牛支原体中的应用；

(4)权利要求5所述的扩增方法在非疾病诊断目的的鉴定和/或检测牛支原体中的应用。