CN101736085A - 牛支原体环介导等温扩增检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物病原分子检测领域，涉及牛支原体的环介导等温扩增检测方法。其步骤包括：(1)引物合成：根据牛支原体特异性基因UvrC的序列设计两对特异引物；(2)培养牛支原体；(3)提取牛支原体总DNA；(4)环介导等温扩增反应和(5)环介导等温扩增反应产物分析。在凝胶成像系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，且其中最小的一条为157bp大小，或加入SYBR Green I后，若扩增产物变为黄绿色则为牛支原体阳性，若扩增产物为棕色则为牛支原体阴性。本发明可以100％扩增到临床分离到的牛支原体，且特异性强，对呼吸道常见菌可以作鉴别检测。本发明灵敏度高，检测下限为10个拷贝的阳性质粒。1小时出结果。实用性强，不需要昂贵的精密仪器。
Description
技术领域
本发明属于动物病原分子检测领域，具体涉及一种牛支原体的快速环介导等温扩增检测方法。
背景技术
牛支原体(mycoplasma bovis)是引起牛肺炎的重要病原之一，此外它还可以引起肉牛及奶牛的关节炎、结膜炎、乳房炎、流产等，给养牛业造成了巨大的经济损失。牛支原体在1961年首次于患有乳腺炎牛的牛乳中分离得到，我国自2008年首次报道了牛支原体肺炎之后，不断有各地牛场由于异地引牛而发生牛支原体肺炎死亡的病例。所以，建立一种行之有效的检测方法对牛支原体疾病的防控有着重要意义。
基于分子水平对牛支原体特异性基因进行PCR扩增可以及时准确的进行病原鉴别，但是普通的PCR，以及灵敏度更高的巢式PCR、荧光定量PCR，都必须依赖昂贵的精密仪器，检测费用高，对检测人员较高的技术要求等，无法在条件较差的基层实验室进行。环介导等温扩增法(loop mediated isothermalamplification，LAMP)可以在等温条件下高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶序列。这种方法不需要特别的设备，只需要一台可以提供60℃恒温环境的仪器(如水浴锅或便携式恒温电热器)。不仅大大降低了检测的费用，而且给临床应用带来极大方便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、特异而又简单实用的牛支原体LAMP检测方法。
本发明的具体方案包括下列步骤：
(1)引物设计：根据牛支原体特异性基因UvrC通过LAMP在线引物设计软件(http://primerexplorer.jp/e/index.html)及primer premier 5引物设计软件不断调整引物的碱基数及引物之间的距离直至符合LAMP引物的要求。最终确定在1775bp-1983bp的碱基序列之间6个不同区域设两对特殊的引物。
(2)培养牛支原体：取1.98ml的PPLO液体培养基(配方：葡萄糖2.5g，PPLO肉汤粉10.5g，酵母粉2.5g，马血清50ml，10％w/v精氨酸5ml，10×MEM 5ml，8万单位青霉素5ml，1％(w/v)酚红溶液500μl，加水至500ml。)于灭菌青霉素瓶中，按1∶99的比例加入牛支原体菌液20μL。将瓶口盖紧，置于37℃恒温培养箱中培养3天。待PPLO液体培养基由红色变为橙色且透亮表明牛支原体培养成功。
(3)提取牛支原体总DNA：取新培养的牛支原体菌液500μL于1.5ml灭菌Eppendorf管中，12000rpm离心15min，弃上清，沉淀溶于200μL灭菌ddH2O中。沸水浴10min后立即冰浴1-2min，待Eppendorf管冷却后-20℃保存备用。
(4)环介导等温扩增反应：以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对牛支原体DNA进行恒温扩增。其反应体系为：1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，2μl模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH2O补齐至25μl。将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃60min，80℃10min终止反应。
(5)环介导等温扩增反应产物分析：
分析方法1：琼脂糖凝胶电泳：取4μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在2％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像；
分析方法2：将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后即为工作液，在25μl的环介导等温扩增产物中加入3-4μlSYBR Green I工作液，在日光下用肉眼观察结果。
(6)结果判定：在分析方法1中，在凝胶成相系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，且其中最小的一条为157bp大小。
在分析方法2中，若扩增产物变为黄绿色则为牛支原体阳性，若扩增产物为棕色则为牛支原体阴性。
步骤(4)所述的本发明的引物序列如下：
F1P 5’-GATTTTTGCATAGCTTTTAAAGTGA-TTTT-GAAGGCAAACTAAGAAACATAAAAGG-3’
B1P 5’-GACGCTTCAGTTGAAGAATTATCA-tttt-AATCCTTATTTTTAATGCTTTTGGC-3’
B3 5’-AAGCACCCTATTGATTTTTACTC-3’
F3 5’-AGAAACAGACAAAAAATTAGTTCAC-3’
本发明所设计的两对特异引物成功建立了对牛支原体快速、灵敏、特异而又简单实用的牛支原体分子检测方法。与其它传统PCR方法相比该发明有以下优点：
1.经济实用：反应是在恒温的条件下进行，所以不需要昂贵的PCR仪，只需要一台可以提供恒温的设备，比如水浴锅。
2.灵敏度高：采用本方法可以检测下限至10个拷贝的牛支原体目的基因，比普通的PCR的灵敏度高10-100倍。
3.特异性强：采用4条引物，识别6个位点，增加了与牛支原体目的基因结合的特异性。
4.检测简单：直接肉眼观察反应产物经SYBR Green I染色后的颜色变化来定性判断靶序列扩增与否。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明牛支原体特异性基因UvrC的核苷酸序列；
图1：是本发明对牛支原总DNA扩增电泳结果；
图中：泳道M：2000bp DNA Marker，泳道1、2、3、4为四个重复。泳道5为对照；
图2：是本发明对牛支原体DNA扩增产物中加入SABR Green I后照片。左边管为牛支原体阳性结果，右边管为牛支原体阴性结果；
图3：是本发明对对临床分离到的牛支原体进行电泳检测结果；
图中：泳道M：2000bp DNA Marker，泳道1-17临床分离支原体，依次为：YL-1、SZN-1、FX、XM0929、YJ0719、E-8、E-3、0525、YL-0720、1834、X-1、JS1015、0607、XT、BZ、E2、X-2，泳道18为对照；
图4：是本发明对牛支原体特异性检测。图中：泳道M：2000bp DNA Marker，泳道1：支原体阳性对照，泳道2-9：依次为丝状支原体山羊亚种PG3，绵羊肺炎支原体Y98，牛鼻气管炎病毒，大肠杆菌，牛型分枝杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，炭疽芽孢杆菌，泳道10：阴性对照；
图5：是本发明对阳性克隆质粒LAMP结果及对LAMP产物酶切结果。图中：泳道M：2000bp DNA Marker，P1、P2是两个克隆的阳性质粒LAMP结果，m1、m2分别为P1、P2的酶切结果，最后的泳道为对照；
图6：是本发明对牛支原体LAMP检测方法灵敏度实验结果。图中：泳道M：15000bp DNA Marker，第2条泳道为阴性对照，第3-9泳道依次为阳性质粒模板含量为106、105、104、103、102、101、100个拷贝；
图7：是本发明对牛支原体肺炎牛病变肺脏检测。泳道M：2000bp DNA Marker，泳道1为病变肺脏组织样，泳道2为阴性对照，泳道3为健康肺组织样，泳道4为支原体阳性对照；
图8：牛支原体菌落镜检图片。
图9：LAMP检测牛支原体试验流程。
图10：LAMP扩增目的片段，下划线英文字母标注的序列为引物结合区域，方框区的碱基为AluI酶切位点。
具体实施方式
实施例1：对临床分离到的牛支原体进行检测
1.牛支原体的分离及培养
参见表1的分离物及采集地点，将病变牛肺脏组织表面用酒精棉灼烧灭菌，在病变与正常组织交界处取一小块深层组织，划线接种于PPLO固体培养基(配方：葡萄糖2.5g，PPLO肉汤粉10.5g，琼脂粉7.5g，酵母粉2.5g，马血清50ml，10％w/v精氨酸10ml，10×MEM 5ml，8万单位青霉素5ml，加水至500ml。)上。置于37℃CO2恒温培养箱中，培养2-3天后在显微镜下观察有很小的形似煎蛋样的支原体菌落。选择支原体生长丰富区域切一小块0.5cm2大小的固体培养基放入2ml的PPLO液体培养基中，37℃恒温培养箱中继续培养2-3天。待PPLO液体培养基由红色变为橙色且透亮表明支原体生长。
2.LAMP扩增
提取牛支原体总DNA：取新培养的牛支原体菌液500μL于1.5ml灭菌Eppendorf管中，12000rpm离心15min，弃上清，沉淀溶于200μL灭菌ddH2O中。沸水浴10min后立即冰浴1-2min，待Eppendorf管冷却后-20℃保存备用。
环介导等温扩增反应：以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对牛支原体DNA进行恒温扩增。其反应体系为：1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，2μl模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH2O补齐至25μl。将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃60min，80℃10min终止反应。
环介导等温扩增反应产物分析：
分析方法1：琼脂糖凝胶电泳：取4μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在2％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像；
分析方法2：将SYBR GreenI荧光染料稀释100倍后即为工作液，在25μl的环介导等温扩增产物中加入3-4μlSYBR Green I工作液，在日光下用肉眼观察结果；
结果判定：在分析方法1中，在凝胶成相系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，且其中最小的一条为157bp大小；结果如图3。
实施例2：牛支原体LAMP检测方法特异性实验
培养表2所列菌种：丝状支原体山羊亚种PG3、绵羊肺炎支原体Y98按体积比为1∶99的比例接种于PPLO液体培养基置于37℃恒温培养箱中培养3天，待PPLO液体培养基由红色变为黄色且透亮时停止培养。牛型分枝杆菌按体积比为1∶99的比例接种于7H9液体培养基(购自碧迪公司)中，37℃摇床培养7天至培养基浑浊。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、炭疽芽孢杆菌分别按体积比为1∶99的比例接种于TSB液体培养基(购自碧迪公司)中，37℃摇床培养24小时至培养基浑浊。牛传染性鼻气管炎病毒根据病毒毒价接种于培养好的MDBK细胞，细胞培养基为DMEM(配方：13.4gDMEM粉，3.7gNaHCO3PH6.8-7.0，定容至1L)置于37℃二氧化碳恒温培养箱中培养3天，15000rpm超速离心2.5h集毒。
表2牛支原体LAMP检测的特异性试验(验证试验)
注：“+”表示可以检测到有梯形条带且最小片段为157bp，“-”表示不能检测到。
总DNA提取：丝状支原体山羊亚种PG3、绵羊肺炎支原体Y98、炭疽芽孢杆菌、大肠杆菌、牛型分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌七中菌分别取500μL菌液于1.5ml灭菌Eppendorf管中，12000rpm离心15min，弃上清，沉淀溶于200μL灭菌ddH2O中。沸水浴10min后立即冰浴1-2min，待Eppendorf管冷却后-20℃保存备用。将所收集的牛传染性鼻气管炎病毒溶于200μL灭菌ddH2O中。沸水浴10min后立即冰浴1-2min，待Eppendorf管冷却后-20℃保存备用。
环介导等温扩增反应：以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对表2所列菌种DNA进行恒温扩增。其反应体系为：1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，2μl模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH2O补齐至25μl。将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃ 5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃60min，80℃ 10min终止反应。
环介导等温扩增反应产物分析：
分析方法1：琼脂糖凝胶电泳：取4μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在2％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像；
分析方法2：将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后即为工作液，在25μl的环介导等温扩增产物中加入3-4μlSYBR Green I工作液，在日光下用肉眼观察结果。
结果判定：在分析方法1中，在凝胶成相系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，且其中
最小的一条为157bp大小。结果如图4。
实施例3：牛支原体LAMP检测方法灵敏度实验
用uvrC基因的阳性质粒作模板，检测牛支原体LAMP方法的灵敏度。方法如下：
1.按照实施例1的方法培养牛支原体并提取牛支原体总DNA.
2.用普通PCR方法扩增目的片段：用两条外引物F3、B3扩增牛支原体总DNA中目的片段，反应体系为1×U TaqMix DNA聚合酶，上游引物F3 0.4μM，下游引物B3 0.4μM，牛支原体总DNA 6μL，ddH2O补齐至50μL。将上述试剂混匀后置于PCR仪中，反应参数设置为：95℃5min，95℃1min，55℃1min，72℃30s，72℃10min，4℃10min。
3.PCR产物分析：取50μL PCR产物在1.5％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，凝胶成相系统上成像。结果可以看到208bp大小的片段。
4.阳性质粒的构建：将扩增的目的基因从琼脂糖凝胶上切下，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自TianGen公司)回收DNA。将回收产物与PMD-18T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)连接，连接体系为：1μL PMD-18T载体，10μL solution，9μL回收产物，将上述试剂混匀后16℃水浴12h。取10μL连接产物加入100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃循环水中热击90s，快速冰浴1-2min使细胞冷却，加入500μL LB液体培养基，37℃摇床上培育45min，4000rpm离心5min，弃去500μL上清液，将余下液体吹打均匀，吸取100μL涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平皿上，37℃培养12h。用灭菌移液器头挑取菌落置于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培育12h，按小提试剂盒(购自TIANGEN公司，目录号：DP103-03)所述方法提取重组质粒。用LAMP及酶切方法鉴定重组质粒，具体步骤为：
以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对提取的质粒进行恒温扩增。其反应体系为：1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，2μl模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH2O补齐至25μl。将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃ 5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃60min，80℃ 10min终止反应。用Alu I限制性核酸酶切酶(购自NEB公司)对LAMP产物进行酶切，其反应体系为：Alu I 1μl，Lamp产物3μl，buffer 2μl，ddH2O 14μl。37℃水浴3h。Lamp扩增结果及酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳，取lamp及酶切产物各4μl，分别加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在2％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像；结果lamp扩增产物为梯形条带，酶切产物无梯形条带。如图5。
5.将克隆的阳性质粒10倍稀释后通过紫外分光光度计测定浓度，计算质粒拷贝数，
公式为：
(6.23×1023copies/mol)×(浓度g/ml)÷[碱基数×(660道尔顿/碱基)]＝拷贝数/ml
经计算阳性质粒拷贝数为：6.45×1012copies/ml
用ddH2O将上述质粒进行倍比稀释，使其终浓度为5×107copies/μl，5×106copies/μl，5×105copies/μl，5×104copies/μl，5×103copies/μl，5×102copies/μl，5×101copies/μl，5×100copies/μl，1×100copies/μl。
6.LAMP灵敏度实验：以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对阳性质粒进行扩增，使体系中含质粒拷贝数依次为：108个，107个，106个，105个，104个，103个，102个，10个，5个，1个。体系中其它试剂为1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH2O补齐至25μl。将上述除酶以外的所有试剂包括质粒模板混匀置于PCR管中，95℃5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃ 60min，80℃ 10min终止反应。
7.结果分析：琼脂糖凝胶电泳，取4μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在2％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像；结果LAMP对阳性质粒的扩增下限为10个，如图6。
实施例4：对牛支原体肺炎牛病变肺脏检测
在临床疑似发生牛支原体肺炎的牛场扑杀一头黄牛(品种为西门答尔杂交牛种)，取病变肺组织，同时进行LAMP快速诊断与牛支原体培养，比较二者的结果。
LAMP检测程序如下：
1、将牛支原体肺炎病变肺脏组织(病变肺脏来源：河南开封某牛场)表面用酒精棉灼烧灭菌，在病变与正常组织交界处取一小块深层组织，放入玻璃研磨器中，按每0.5克组织加入1ml灭菌PBS对组织进行研磨，吸1ml匀浆液于灭菌Eppendorf管中，煮沸10min，冰浴1min，12000rpm离心30s，取上清于另一灭菌Eppendorf管中。
2、环介导等温扩增反应：以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对牛支原体DNA进行恒温扩增。其反应体系为：1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，2μl模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH2O补齐至25μl。将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃60min，80℃10min终止反应。
3、琼脂糖凝胶电泳：取4μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在2％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像。
4、结果为牛支原体阳性(见图7)。
牛支原体培养方法如下：
将牛支原体肺炎病变肺脏组织表面用酒精棉灼烧灭菌，在病变与正常组织交界处取一小块深层组织，划线接种于PPLO固体培养基上。置于37℃CO2恒温培养箱中，培养2-3天后在显微镜下观察。
培养第3天，在显微镜下4×10倍放大观察菌落(图8)，观察到典型的“煎蛋样”菌落。
序列表
<110>华中农业大学
<120>牛支原体环介导等温扩增检测方法
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ctttcctatt gatttttgtt taatctttct ctcaaaattc aggtctaatt ttttcatcat 2040
cgctaatgct cttattattt aaaactgcat catatcacat actatatgtt ttatttgcgt 2100
tagttaaaaa taagttcatt gtagcaaagg cctgattagc atatggattt tgtggagctc 2160
tctctcttct gctctttaat caagttttaa atgcattata actacgatta tattcgtctc 2220
atttactatc tttaataact ggtctagtta tttcaaagtc atctataact ttgagatttt 2280
ttaggtactg cttgtattc 2299
Claims (1)
1.一种牛支原体环介导等温扩增检测方法，其步骤包括：
(1)引物合成：根据牛支原体特异性基因UvrC的序列设计两对特异引物，所述引物如下：
F1P 5’-GATTTTTGCATAGCTTTTAAAGTGA-TTTT-GAAGGCAAACTAAGAAACATAAAAGG-3’，
B1P 5’-GACGCTTCAGTTGAAGAATTATCA-tttt-AATCCTTATTTTTAATGCTTTTGGC-3’，
B3 5’-AAGCACCCTATTGATTTTTACTC-3’，
F3 5’-AGAAACAGACAAAAAATTAGTTCAC-3’；
(2)培养牛支原体：取1.98ml的PPLO液体培养基于灭菌的青霉素瓶中，按体积比为1∶99加入牛支原体菌液20μL；盖紧瓶口，置于37℃恒温培养箱中培养3天，待PPLO液体培养基由红色变为橙色且透亮时停止培养；
(3)提取牛支原体总DNA：取新培养的牛支原体菌液500μL于1.5ml灭菌Eppendorf管中，12000rpm离心15min，弃上清，将沉淀溶于200μL灭菌ddH2O中，沸水浴10min后立即冰浴1-2min，待Eppendorf管冷却后于-20℃保存备用；
(4)环介导等温扩增反应：以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对牛支原体DNA进行恒温扩增；其反应体系为：1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×BstBuffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，2μl模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH2O补齐至25μl；将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃60min，80℃10min终止反应；
(5)环介导等温扩增反应产物分析：采用琼脂糖凝胶电泳：取4μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液，混匀，在2％w/v的琼脂糖凝胶中于5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭染色15min后，在凝胶成相系统上成像；或者将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，在25μl的环介导等温扩增产物中加入3-4μlSYBR Green I工作液，在日光下用肉眼观察结果；
其中步骤(2)所述的PPLO液体培养基配方如下：
葡萄糖2.5g，PPLO肉汤粉10.5g，酵母粉2.5g，马血清50ml，10％w/v精氨酸5ml，10×MEM 5ml，8万单位青霉素5ml，1％(w/v)酚红溶液500μl，PH值在7.6-8.0，加水至500ml。
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