CN101736085A - 牛支原体环介导等温扩增检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物病原分子检测领域，涉及牛支原体的环介导等温扩增检测方法。其步骤包括：(1)引物合成：根据牛支原体特异性基因UvrC的序列设计两对特异引物；(2)培养牛支原体；(3)提取牛支原体总DNA；(4)环介导等温扩增反应和(5)环介导等温扩增反应产物分析。在凝胶成像系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，且其中最小的一条为157bp大小，或加入SYBR Green I后，若扩增产物变为黄绿色则为牛支原体阳性，若扩增产物为棕色则为牛支原体阴性。本发明可以100％扩增到临床分离到的牛支原体，且特异性强，对呼吸道常见菌可以作鉴别检测。本发明灵敏度高，检测下限为10个拷贝的阳性质粒。1小时出结果。实用性强，不需要昂贵的精密仪器。

Description

牛支原体环介导等温扩增检测方法

技术领域

本发明属于动物病原分子检测领域，具体涉及一种牛支原体的快速环介导等温扩增检测方法。

背景技术

牛支原体(mycoplasma bovis)是引起牛肺炎的重要病原之一，此外它还可以引起肉牛及奶牛的关节炎、结膜炎、乳房炎、流产等，给养牛业造成了巨大的经济损失。牛支原体在1961年首次于患有乳腺炎牛的牛乳中分离得到，我国自2008年首次报道了牛支原体肺炎之后，不断有各地牛场由于异地引牛而发生牛支原体肺炎死亡的病例。所以，建立一种行之有效的检测方法对牛支原体疾病的防控有着重要意义。

基于分子水平对牛支原体特异性基因进行PCR扩增可以及时准确的进行病原鉴别，但是普通的PCR，以及灵敏度更高的巢式PCR、荧光定量PCR，都必须依赖昂贵的精密仪器，检测费用高，对检测人员较高的技术要求等，无法在条件较差的基层实验室进行。环介导等温扩增法(loop mediated isothermalamplification，LAMP)可以在等温条件下高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶序列。这种方法不需要特别的设备，只需要一台可以提供60℃恒温环境的仪器(如水浴锅或便携式恒温电热器)。不仅大大降低了检测的费用，而且给临床应用带来极大方便。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、特异而又简单实用的牛支原体LAMP检测方法。

本发明的具体方案包括下列步骤：

(1)引物设计：根据牛支原体特异性基因UvrC通过LAMP在线引物设计软件(http://primerexplorer.jp/e/index.html)及primer premier 5引物设计软件不断调整引物的碱基数及引物之间的距离直至符合LAMP引物的要求。最终确定在1775bp-1983bp的碱基序列之间6个不同区域设两对特殊的引物。

(2)培养牛支原体：取1.98ml的PPLO液体培养基(配方：葡萄糖2.5g，PPLO肉汤粉10.5g，酵母粉2.5g，马血清50ml，10％w/v精氨酸5ml，10×MEM 5ml，8万单位青霉素5ml，1％(w/v)酚红溶液500μl，加水至500ml。)于灭菌青霉素瓶中，按1∶99的比例加入牛支原体菌液20μL。将瓶口盖紧，置于37℃恒温培养箱中培养3天。待PPLO液体培养基由红色变为橙色且透亮表明牛支原体培养成功。

(3)提取牛支原体总DNA：取新培养的牛支原体菌液500μL于1.5ml灭菌Eppendorf管中，12000rpm离心15min，弃上清，沉淀溶于200μL灭菌ddH₂O中。沸水浴10min后立即冰浴1-2min，待Eppendorf管冷却后-20℃保存备用。

(4)环介导等温扩增反应：以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对牛支原体DNA进行恒温扩增。其反应体系为：1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，2μl模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH₂O补齐至25μl。将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃60min，80℃10min终止反应。

(5)环介导等温扩增反应产物分析：

分析方法1：琼脂糖凝胶电泳：取4μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在2％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像；

分析方法2：将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后即为工作液，在25μl的环介导等温扩增产物中加入3-4μlSYBR Green I工作液，在日光下用肉眼观察结果。

(6)结果判定：在分析方法1中，在凝胶成相系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，且其中最小的一条为157bp大小。

在分析方法2中，若扩增产物变为黄绿色则为牛支原体阳性，若扩增产物为棕色则为牛支原体阴性。

步骤(4)所述的本发明的引物序列如下：

F1P 5’-GATTTTTGCATAGCTTTTAAAGTGA-TTTT-GAAGGCAAACTAAGAAACATAAAAGG-3’

B1P 5’-GACGCTTCAGTTGAAGAATTATCA-tttt-AATCCTTATTTTTAATGCTTTTGGC-3’

B3 5’-AAGCACCCTATTGATTTTTACTC-3’

F3 5’-AGAAACAGACAAAAAATTAGTTCAC-3’

本发明所设计的两对特异引物成功建立了对牛支原体快速、灵敏、特异而又简单实用的牛支原体分子检测方法。与其它传统PCR方法相比该发明有以下优点：

1.经济实用：反应是在恒温的条件下进行，所以不需要昂贵的PCR仪，只需要一台可以提供恒温的设备，比如水浴锅。

2.灵敏度高：采用本方法可以检测下限至10个拷贝的牛支原体目的基因，比普通的PCR的灵敏度高10-100倍。

3.特异性强：采用4条引物，识别6个位点，增加了与牛支原体目的基因结合的特异性。

4.检测简单：直接肉眼观察反应产物经SYBR Green I染色后的颜色变化来定性判断靶序列扩增与否。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明牛支原体特异性基因UvrC的核苷酸序列；

图1：是本发明对牛支原总DNA扩增电泳结果；

图中：泳道M：2000bp DNA Marker，泳道1、2、3、4为四个重复。泳道5为对照；

图2：是本发明对牛支原体DNA扩增产物中加入SABR Green I后照片。左边管为牛支原体阳性结果，右边管为牛支原体阴性结果；

图3：是本发明对对临床分离到的牛支原体进行电泳检测结果；

图中：泳道M：2000bp DNA Marker，泳道1-17临床分离支原体，依次为：YL-1、SZN-1、FX、XM0929、YJ0719、E-8、E-3、0525、YL-0720、1834、X-1、JS1015、0607、XT、BZ、E2、X-2，泳道18为对照；

图4：是本发明对牛支原体特异性检测。图中：泳道M：2000bp DNA Marker，泳道1：支原体阳性对照，泳道2-9：依次为丝状支原体山羊亚种PG3，绵羊肺炎支原体Y98，牛鼻气管炎病毒，大肠杆菌，牛型分枝杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，炭疽芽孢杆菌，泳道10：阴性对照；

图5：是本发明对阳性克隆质粒LAMP结果及对LAMP产物酶切结果。图中：泳道M：2000bp DNA Marker，P1、P2是两个克隆的阳性质粒LAMP结果，m1、m2分别为P1、P2的酶切结果，最后的泳道为对照；

图6：是本发明对牛支原体LAMP检测方法灵敏度实验结果。图中：泳道M：15000bp DNA Marker，第2条泳道为阴性对照，第3-9泳道依次为阳性质粒模板含量为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰个拷贝；

图7：是本发明对牛支原体肺炎牛病变肺脏检测。泳道M：2000bp DNA Marker，泳道1为病变肺脏组织样，泳道2为阴性对照，泳道3为健康肺组织样，泳道4为支原体阳性对照；

图8：牛支原体菌落镜检图片。

图9：LAMP检测牛支原体试验流程。

图10：LAMP扩增目的片段，下划线英文字母标注的序列为引物结合区域，方框区的碱基为AluI酶切位点。

具体实施方式

实施例1：对临床分离到的牛支原体进行检测

1.牛支原体的分离及培养

参见表1的分离物及采集地点，将病变牛肺脏组织表面用酒精棉灼烧灭菌，在病变与正常组织交界处取一小块深层组织，划线接种于PPLO固体培养基(配方：葡萄糖2.5g，PPLO肉汤粉10.5g，琼脂粉7.5g，酵母粉2.5g，马血清50ml，10％w/v精氨酸10ml，10×MEM 5ml，8万单位青霉素5ml，加水至500ml。)上。置于37℃CO₂恒温培养箱中，培养2-3天后在显微镜下观察有很小的形似煎蛋样的支原体菌落。选择支原体生长丰富区域切一小块0.5cm²大小的固体培养基放入2ml的PPLO液体培养基中，37℃恒温培养箱中继续培养2-3天。待PPLO液体培养基由红色变为橙色且透亮表明支原体生长。

2.LAMP扩增

提取牛支原体总DNA：取新培养的牛支原体菌液500μL于1.5ml灭菌Eppendorf管中，12000rpm离心15min，弃上清，沉淀溶于200μL灭菌ddH₂O中。沸水浴10min后立即冰浴1-2min，待Eppendorf管冷却后-20℃保存备用。

环介导等温扩增反应：以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对牛支原体DNA进行恒温扩增。其反应体系为：1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，2μl模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH₂O补齐至25μl。将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃60min，80℃10min终止反应。

环介导等温扩增反应产物分析：

分析方法1：琼脂糖凝胶电泳：取4μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在2％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像；

分析方法2：将SYBR GreenI荧光染料稀释100倍后即为工作液，在25μl的环介导等温扩增产物中加入3-4μlSYBR Green I工作液，在日光下用肉眼观察结果；

结果判定：在分析方法1中，在凝胶成相系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，且其中最小的一条为157bp大小；结果如图3。

实施例2：牛支原体LAMP检测方法特异性实验

培养表2所列菌种：丝状支原体山羊亚种PG3、绵羊肺炎支原体Y98按体积比为1∶99的比例接种于PPLO液体培养基置于37℃恒温培养箱中培养3天，待PPLO液体培养基由红色变为黄色且透亮时停止培养。牛型分枝杆菌按体积比为1∶99的比例接种于7H9液体培养基(购自碧迪公司)中，37℃摇床培养7天至培养基浑浊。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、炭疽芽孢杆菌分别按体积比为1∶99的比例接种于TSB液体培养基(购自碧迪公司)中，37℃摇床培养24小时至培养基浑浊。牛传染性鼻气管炎病毒根据病毒毒价接种于培养好的MDBK细胞，细胞培养基为DMEM(配方：13.4gDMEM粉，3.7gNaHCO₃PH6.8-7.0，定容至1L)置于37℃二氧化碳恒温培养箱中培养3天，15000rpm超速离心2.5h集毒。

表2牛支原体LAMP检测的特异性试验(验证试验)

注：“+”表示可以检测到有梯形条带且最小片段为157bp，“-”表示不能检测到。

总DNA提取：丝状支原体山羊亚种PG3、绵羊肺炎支原体Y98、炭疽芽孢杆菌、大肠杆菌、牛型分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌七中菌分别取500μL菌液于1.5ml灭菌Eppendorf管中，12000rpm离心15min，弃上清，沉淀溶于200μL灭菌ddH₂O中。沸水浴10min后立即冰浴1-2min，待Eppendorf管冷却后-20℃保存备用。将所收集的牛传染性鼻气管炎病毒溶于200μL灭菌ddH₂O中。沸水浴10min后立即冰浴1-2min，待Eppendorf管冷却后-20℃保存备用。

环介导等温扩增反应：以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对表2所列菌种DNA进行恒温扩增。其反应体系为：1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，2μl模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH₂O补齐至25μl。将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃ 5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃60min，80℃ 10min终止反应。

环介导等温扩增反应产物分析：

分析方法1：琼脂糖凝胶电泳：取4μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在2％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像；

分析方法2：将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后即为工作液，在25μl的环介导等温扩增产物中加入3-4μlSYBR Green I工作液，在日光下用肉眼观察结果。

结果判定：在分析方法1中，在凝胶成相系统的紫外灯下观察是否有梯形条带，且其中

最小的一条为157bp大小。结果如图4。

实施例3：牛支原体LAMP检测方法灵敏度实验

用uvrC基因的阳性质粒作模板，检测牛支原体LAMP方法的灵敏度。方法如下：

1.按照实施例1的方法培养牛支原体并提取牛支原体总DNA.

2.用普通PCR方法扩增目的片段：用两条外引物F3、B3扩增牛支原体总DNA中目的片段，反应体系为1×U TaqMix DNA聚合酶，上游引物F3 0.4μM，下游引物B3 0.4μM，牛支原体总DNA 6μL，ddH₂O补齐至50μL。将上述试剂混匀后置于PCR仪中，反应参数设置为：95℃5min，95℃1min，55℃1min，72℃30s，72℃10min，4℃10min。

3.PCR产物分析：取50μL PCR产物在1.5％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，凝胶成相系统上成像。结果可以看到208bp大小的片段。

4.阳性质粒的构建：将扩增的目的基因从琼脂糖凝胶上切下，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自TianGen公司)回收DNA。将回收产物与PMD-18T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)连接，连接体系为：1μL PMD-18T载体，10μL solution，9μL回收产物，将上述试剂混匀后16℃水浴12h。取10μL连接产物加入100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃循环水中热击90s，快速冰浴1-2min使细胞冷却，加入500μL LB液体培养基，37℃摇床上培育45min，4000rpm离心5min，弃去500μL上清液，将余下液体吹打均匀，吸取100μL涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平皿上，37℃培养12h。用灭菌移液器头挑取菌落置于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培育12h，按小提试剂盒(购自TIANGEN公司，目录号：DP103-03)所述方法提取重组质粒。用LAMP及酶切方法鉴定重组质粒，具体步骤为：

以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对提取的质粒进行恒温扩增。其反应体系为：1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，2μl模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH₂O补齐至25μl。将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃ 5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃60min，80℃ 10min终止反应。用Alu I限制性核酸酶切酶(购自NEB公司)对LAMP产物进行酶切，其反应体系为：Alu I 1μl，Lamp产物3μl，buffer 2μl，ddH₂O 14μl。37℃水浴3h。Lamp扩增结果及酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳，取lamp及酶切产物各4μl，分别加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在2％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像；结果lamp扩增产物为梯形条带，酶切产物无梯形条带。如图5。

5.将克隆的阳性质粒10倍稀释后通过紫外分光光度计测定浓度，计算质粒拷贝数，

公式为：

(6.23×10²³copies/mol)×(浓度g/ml)÷[碱基数×(660道尔顿/碱基)]＝拷贝数/ml

经计算阳性质粒拷贝数为：6.45×10¹²copies/ml

用ddH₂O将上述质粒进行倍比稀释，使其终浓度为5×10⁷copies/μl，5×10⁶copies/μl，5×10⁵copies/μl，5×10⁴copies/μl，5×10³copies/μl，5×10²copies/μl，5×10¹copies/μl，5×10⁰copies/μl，1×10⁰copies/μl。

6.LAMP灵敏度实验：以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对阳性质粒进行扩增，使体系中含质粒拷贝数依次为：10⁸个，10⁷个，10⁶个，10⁵个，10⁴个，10³个，10²个，10个，5个，1个。体系中其它试剂为1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH₂O补齐至25μl。将上述除酶以外的所有试剂包括质粒模板混匀置于PCR管中，95℃5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃ 60min，80℃ 10min终止反应。

7.结果分析：琼脂糖凝胶电泳，取4μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在2％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像；结果LAMP对阳性质粒的扩增下限为10个，如图6。

实施例4：对牛支原体肺炎牛病变肺脏检测

在临床疑似发生牛支原体肺炎的牛场扑杀一头黄牛(品种为西门答尔杂交牛种)，取病变肺组织，同时进行LAMP快速诊断与牛支原体培养，比较二者的结果。

LAMP检测程序如下：

1、将牛支原体肺炎病变肺脏组织(病变肺脏来源：河南开封某牛场)表面用酒精棉灼烧灭菌，在病变与正常组织交界处取一小块深层组织，放入玻璃研磨器中，按每0.5克组织加入1ml灭菌PBS对组织进行研磨，吸1ml匀浆液于灭菌Eppendorf管中，煮沸10min，冰浴1min，12000rpm离心30s，取上清于另一灭菌Eppendorf管中。

2、环介导等温扩增反应：以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对牛支原体DNA进行恒温扩增。其反应体系为：1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，2μl模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH₂O补齐至25μl。将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃60min，80℃10min终止反应。

3、琼脂糖凝胶电泳：取4μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在2％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像。

4、结果为牛支原体阳性(见图7)。

牛支原体培养方法如下：

将牛支原体肺炎病变肺脏组织表面用酒精棉灼烧灭菌，在病变与正常组织交界处取一小块深层组织，划线接种于PPLO固体培养基上。置于37℃CO₂恒温培养箱中，培养2-3天后在显微镜下观察。

培养第3天，在显微镜下4×10倍放大观察菌落(图8)，观察到典型的“煎蛋样”菌落。

序列表

<110>华中农业大学

<120>牛支原体环介导等温扩增检测方法

<130>

<141>2009-11-17

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2299

<212>DNA

<213>牛支原体(mycoplasma bovis)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2299)

<223>

<400>1

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Claims (1)

1.一种牛支原体环介导等温扩增检测方法，其步骤包括：

(1)引物合成：根据牛支原体特异性基因UvrC的序列设计两对特异引物，所述引物如下：

F1P  5’-GATTTTTGCATAGCTTTTAAAGTGA-TTTT-GAAGGCAAACTAAGAAACATAAAAGG-3’，

B1P  5’-GACGCTTCAGTTGAAGAATTATCA-tttt-AATCCTTATTTTTAATGCTTTTGGC-3’，

B3   5’-AAGCACCCTATTGATTTTTACTC-3’，

F3   5’-AGAAACAGACAAAAAATTAGTTCAC-3’；

(2)培养牛支原体：取1.98ml的PPLO液体培养基于灭菌的青霉素瓶中，按体积比为1∶99加入牛支原体菌液20μL；盖紧瓶口，置于37℃恒温培养箱中培养3天，待PPLO液体培养基由红色变为橙色且透亮时停止培养；

(3)提取牛支原体总DNA：取新培养的牛支原体菌液500μL于1.5ml灭菌Eppendorf管中，12000rpm离心15min，弃上清，将沉淀溶于200μL灭菌ddH₂O中，沸水浴10min后立即冰浴1-2min，待Eppendorf管冷却后于-20℃保存备用；

(4)环介导等温扩增反应：以F1P、B1P为内引物，以F3、B3为外引物对牛支原体DNA进行恒温扩增；其反应体系为：1.4M betaine，200μM dNTPs，2.5μl 10×BstBuffer，8U Bst NDA聚合酶大片段，2μl模板，外引物各0.08μM，内引物各0.64μM，ddH₂O补齐至25μl；将上述除酶以外的所有试剂混匀置于PCR管中，95℃5min，立即冰浴1-2min，加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59℃60min，80℃10min终止反应；

(5)环介导等温扩增反应产物分析：采用琼脂糖凝胶电泳：取4μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液，混匀，在2％w/v的琼脂糖凝胶中于5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭染色15min后，在凝胶成相系统上成像；或者将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，在25μl的环介导等温扩增产物中加入3-4μlSYBR Green I工作液，在日光下用肉眼观察结果；

其中步骤(2)所述的PPLO液体培养基配方如下：

葡萄糖2.5g，PPLO肉汤粉10.5g，酵母粉2.5g，马血清50ml，10％w/v精氨酸5ml，10×MEM 5ml，8万单位青霉素5ml，1％(w/v)酚红溶液500μl，PH值在7.6-8.0，加水至500ml。

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