CN107541509A - 用于检测奶牛乳房炎6种传染性病原体的lamp引物组合及其应用 - Google Patents
用于检测奶牛乳房炎6种传染性病原体的lamp引物组合及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测奶牛乳房炎6种传染性病原体的LAMP引物组合及其应用。本发明首先提供了一种引物组合，由序列1至序列36所示的36种DNA分子组成。所述引物组合可应用于检测待测菌是否为牛支原体、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、牛棒状杆菌或表皮葡萄球菌，可应用于检测待测样本中是否含有牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌。本发明提供的引物组合鉴定用于检测奶牛乳房炎6种传染性病原体，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测奶牛乳房炎6种传染性病原体的LAMP引物组合及其应用。
背景技术
奶牛乳房炎是乳区泌乳组织的炎症，通常由细菌感染造成，发病于一到多个乳区，导致产奶量减少，停止产奶，牛奶品质改变。奶牛乳房炎每年影响25-50％的奶牛，是奶牛养殖损失最大的疾病。
奶牛乳房炎由多种非特定的病原微生物引起，目前已发现的约有150多种(包括球菌、杆菌、支原体、真菌或酵母菌、病毒等)，其中较为常见的可分为传染性病原体和非传染性病原体。据报道，全球每年因奶牛乳房炎造成的损失，美国20亿美金，英国2.67亿，日本5亿美元，我国30亿元。平均每个病例损失约200美元左右(约合1200元)，损失主要来自产奶量下降和使用抗生素导致的废弃奶，占到总损失的70％。
目前检验检疫工作中用于检测和鉴定细菌方法主要有传统的分离培养法、PCR、Southern Blot杂交、酶联免疫吸附法(ELISA)等简单的分子生物学和免疫学方法。传统的分离培养、形态观察、生理生化、选择培养基等检测病原菌的方法存在灵敏度低、特异性差、工作量大、耗时长、通量低等显著特点。微生物培养法，耗时长需要3-4d出检测报告，不能满足及时的针对病原体治疗牛乳房炎的目的。免疫学技术(如ELISA)灵敏度高，但容易污染，经常出现假阳性。通常采用一种病原菌一种特异性引物的特定病原体检查的引物特异性PCR技术，虽然可以达到对单一菌的快速、正确和方便的诊断目的，但在病原菌未名时，需要多种不同引物进行试验，这对于病原菌的复杂性和PCR程序的多样性来说显然不够理想。PCR存在检测时间长、易污染、假阳性率高的缺点,使其应用受到限制。以上这些用于病原微生物检测的技术和方法都存在诸多技术问题，而且在实际中由于病原微生物种类繁多，上述方法很难同时对多种病原微生物进行高效的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测奶牛乳房炎6种传染性病原体的LAMP引物组合及其应用。
本发明首先提供了一种引物组合，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ、引物组Ⅴ和引物组Ⅵ组成；
(a2)由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ、所述引物组Ⅴ和所述引物组Ⅵ中的任意两个、任意三个、任意四个或任意五个组成；
(a3)所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ、所述引物组Ⅴ或所述引物组Ⅵ。
所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；
所述引物Ⅰ-F3为如下(b1)或(b2)；
(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-B3为如下(b3)或(b4)；
(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-FIP为如下(b5)或(b6)；
(b5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-BIP为如下(b7)或(b8)；
(b7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(b8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-LF为如下(b9)或(b10)；
(b9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(b10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-LB为如下(b11)或(b12)；
(b11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(b12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB组成；
所述引物Ⅱ-F3为如下(c1)或(c2)；
(c1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(c2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-B3为如下(c3)或(c4)；
(c3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(c4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-FIP为如下(c5)或(c6)；
(c5)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(c6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-BIP为如下(c7)或(c8)；
(c7)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(c8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-LF为如下(c9)或(c 10)；
(c9)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(c10)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-LB为如下(c11)或(c12)；
(c11)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(c12)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子。
所述引物组Ⅲ由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB组成；
所述引物Ⅲ-F3为如下(d1)或(d2)；
(d1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
(d2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-B3为如下(d3)或(d4)；
(d3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
(d4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-FIP为如下(d5)或(d6)；
(d5)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
(d6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-BIP为如下(d7)或(d8)；
(d7)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
(d8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-LF为如下(d9)或(d10)；
(d9)序列表的序列17所示的单链DNA分子；
(d10)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-LB为如下(d11)或(d12)；
(d11)序列表的序列18所示的单链DNA分子；
(d12)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子。
所述引物组Ⅳ由引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB组成；
所述引物Ⅳ-F3为如下(e1)或(e2)；
(e1)序列表的序列19所示的单链DNA分子；
(e2)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-B3为如下(e3)或(e4)；
(e3)序列表的序列20所示的单链DNA分子；
(e4)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-FIP为如下(e5)或(e6)；
(e5)序列表的序列21所示的单链DNA分子；
(e6)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-BIP为如下(e7)或(e8)；
(e7)序列表的序列22所示的单链DNA分子；
(e8)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-LF为如下(e9)或(e10)；
(e9)序列表的序列23所示的单链DNA分子；
(e10)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-LB为如下(e11)或(e12)；
(e11)序列表的序列24所示的单链DNA分子；
(e12)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子。
所述引物组Ⅴ由引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB组成；
所述引物Ⅴ-F3为如下(f1)或(f2)；
(f1)序列表的序列25所示的单链DNA分子；
(f2)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-B3为如下(f3)或(f4)；
(f3)序列表的序列26所示的单链DNA分子；
(f4)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-FIP为如下(f5)或(f6)；
(f5)序列表的序列27所示的单链DNA分子；
(f6)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-BIP为如下(f7)或(f8)；
(f7)序列表的序列28所示的单链DNA分子；
(f8)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-LF为如下(f9)或(f10)；
(f9)序列表的序列29所示的单链DNA分子；
(f10)将序列29经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列29具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-LB为如下(f11)或(f12)；
(f11)序列表的序列30所示的单链DNA分子；
(f12)将序列30经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列30具有相同功能的DNA分子。
所述引物组Ⅵ由引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB组成；
所述引物Ⅵ-F3为如下(g1)或(g2)；
(g1)序列表的序列31所示的单链DNA分子；
(g2)将序列31经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列31具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅵ-B3为如下(g3)或(g4)；
(g3)序列表的序列32所示的单链DNA分子；
(g4)将序列32经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列32具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅵ-FIP为如下(g5)或(g6)；
(g5)序列表的序列33所示的单链DNA分子；
(g6)将序列33经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列33具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅵ-BIP为如下(g7)或(g8)；
(g7)序列表的序列34所示的单链DNA分子；
(g8)将序列34经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列34具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅵ-LF为如下(g9)或(g10)；
(g9)序列表的序列35所示的单链DNA分子；
(g10)将序列35经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列35具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅵ-LB为如下(g11)或(g12)；
(g11)序列表的序列36所示的单链DNA分子；
(g12)将序列36经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列36具有相同功能的DNA分子。
所述引物组Ⅰ中，引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物组Ⅱ中，引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物组Ⅲ中，引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物组Ⅳ中，引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物组Ⅴ中，引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物组Ⅵ中，引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(h1)或(h2)：
(h1)鉴定牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌；
(h2)用于检测待测样本中是否含有牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(j1)或(j2)：
(j1)鉴定牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌；
(j2)用于检测待测样本中是否含有牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种检测待测菌是否为牛支原体、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、牛棒状杆菌或表皮葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测菌的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为牛支原体；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为金黄色葡萄球菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为无乳链球菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为酿脓链球菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为牛棒状杆菌；
如果采用所述引物组Ⅵ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为表皮葡萄球菌。
本发明还保护一种检测待测样本中是否含有牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有牛支原体；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有金黄色葡萄球菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有无乳链球菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有酿脓链球菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有牛棒状杆菌；
如果采用所述引物组Ⅵ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有表皮葡萄球菌。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅰ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅱ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅲ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅳ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅴ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅵ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应条件为：65℃恒温50min。
本发明还保护所述引物组合在检测待测菌是否为牛支原体、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、牛棒状杆菌或表皮葡萄球菌中的应用。
本发明还保护所述引物组合在检测待测样本中是否含有牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌中的应用。
以上任一所述牛支原体具体可为ATCC编号为25523的菌株。以上任一所述金黄色葡萄球菌具体可为CVCC编号为545的菌株。以上任一所述无乳链球菌具体可为CVCC编号为586的菌株。以上任一所述酿脓链球菌具体可为CGMCC编号为1.8868的菌株。以上任一所述牛棒状杆菌具体可为CVCC编号为CAU0107的菌株。以上任一所述表皮葡萄球菌具体可为ATCC编号为12228的菌株。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术,其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测常见的奶牛乳房炎病原体。LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。
本发明提供的引物组合鉴定用于检测奶牛乳房炎6种传染性病原体，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。
附图说明
图1为实施例2中采用引物组Ⅰ的结果。
图2为实施例2中采用引物组Ⅱ的结果。
图3为实施例2中采用引物组Ⅲ的结果。
图4为实施例2中采用引物组Ⅳ的结果。
图5为实施例2中采用引物组Ⅴ的结果。
图6为实施例2中采用引物组Ⅵ的结果。
图7为实施例4中样本一的结果。
图8为实施例4中样本二的结果。
图9为实施例4中样本三的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
CVCC全称为中国兽医微生物菌种保藏管理中心，网址为http://www.cvcc.org.cn/。CGMCC全称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，网址为http://www.cgmcc.net/。ATCC全称为美国模式菌种收集中心，网址为http://www.atcc.org/。
DNA拷贝数的计算方法如下：
1 A260吸光度值＝ds DNA 50μg/ml；
核酸浓度＝(OD260)×(稀释倍数)×(50)＝x ng/μl；
平均分子量(MW)代表克/摩尔，单位道尔顿(dolton)，即1 dolton＝1g/mol；
摩尔＝6.02×1023；
平均分子量(MW):dsDNA＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；
拷贝数计算公式:
(6.02×1023 copies/摩尔)×(x ng/μl×10-9)/(DNA长度×660)＝copies/μl。
牛支原体的基因组DNA长度为1 Mb。金黄色葡萄球菌的基因组DNA长度为2.82 Mb。无乳链球菌的基因组DNA长度为2.16 Mb。酿脓链球菌的基因组DNA长度为1.85 Mb。牛棒状杆菌的基因组DNA长度为2.52 Mb。表皮葡萄球菌的基因组DNA长度为2.5 Mb。
实施例1、试剂盒的制备
试剂盒由六个LAMP引物组组成，每个引物组用于检测一种奶牛乳房炎传染性病原体。
用于检测牛支原体引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列1)：GGACGACGTCAAATCATCA；
外引物B3(序列2)：CCGTAGCGTAGCTGATCT；
内引物FIP(序列3)：CCATGTCACCACTTCGCTTCTCTTTCCTCTTACGAGTGGGGCTA；
内引物BIP(序列4)：CAAACCTCAAAAAACCGTTCTCAGACGATTACTAGCGATTCCGACT；
环引物LF(序列5)：ACCGTCCATTGTAGCACGTGTG；
环引物LB(序列6)：AAGTCTGCAACTCGACTTCATG。
用于检测金黄色葡萄球菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列7)：GCAACTGAAACAACAGAAGC；
外引物B3(序列8)：TTTTGTGTTGGGCGAGC；
内引物FIP(序列9)：TCACGGATACCTGTACCAGCATCTCTATGGTCCGAGACCGCAATT；
内引物BIP(序列10)：GGAACATTTGGATATGAAGCGAGACTGCCATCTTGATTTGTCGTTAC；
环引物LF(序列11)：TTTCACATACTTAGGTGTTTTGT；
环引物LB(序列12)：CCAAGTGAAACAAATGCATACAAC。
用于检测无乳链球菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列13)：TGGATTTGAAAACCAATCAAGTT；
外引物B3(序列14)：AGCTGGTGATACCTGTTCA；
内引物FIP(序列15)：CGTTGTTGCTGCTTCTGGTGTCGTTGCAGACCAAAAAGTTTCTCT；
内引物BIP(序列16)：ATGAAGACATATTCTTCTGCGCCTTGACTAACAGCTTGCTCTTG；
环引物LF(序列17)：ATACCTTCCGAAATTGTATTG；
环引物LB(序列18)：TTTGAAATCAAAAGAAGTATTAGCA。
用于检测酿脓链球菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列19)：GTTGTTAATGCTTTATCAACACA；
外引物B3(序列20)：GCGCTTATCTGTAATGGAAAT；
内引物FIP(序列21)：CAGTGGTTCCAATGACCTCAAGATTCATTACCAAGAATTTAAACGCG；
内引物BIP(序列22)：ACACCCGATCCAGAAATTTTTACCAAAGGCTAACTCTTGAATACGT；
环引物LF(序列23)：TCTGCTACAACAGCCC；
环引物LB(序列24)：AAACGACTCAGTTTGATTACAGT。
用于检测牛棒状杆菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列25)：TGTAGGGGAGACTGGAATT；
外引物B3(序列26)：TACGGCACGGAAATCGT；
内引物FIP(序列27)：GTCAGTTACTGCCCAAGAGACCAAATGCGCAGATATCAGGAG；
内引物BIP(序列28)：GAGCGAAAGCATGGGTAGCGAACAAGATCCCCACACCTAGC；
环引物LF(序列29)：GCCTTCGCCATCGGTGTTC；
环引物LB(序列30)：CCCTGGTAGTCCATGCCGTAA。
用于检测表皮葡萄球菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列31)：ATTGAGATAGCGGGGGA；
外引物B3(序列32)：ACAACAAAGTAACAGTACCATG；
内引物FIP(序列33)：GCGTCATGCCTTTATTTGAAGAAAATGTACAGTCATAGCTAGTGGA；
内引物BIP(序列34)：ACAGGAGTAAATTCAGTGATTGCAATTCCGCAACTTACAAAACATG；
环引物LF(序列35)：TTATATGTATGTGCCCAAATCACA；
环引物LB(序列36)：CCAATTGATTGGAAAGGATTTGATC。
用于检测牛支原体的引物组命名为引物组Ⅰ。用于检测金黄色葡萄球菌的引物组命名为引物组Ⅱ。用于检测无乳链球菌的引物组命名为引物组Ⅲ。用于检测酿脓链球菌的引物组命名为引物组Ⅳ。用于检测牛棒状杆菌的引物组命名为引物组Ⅴ。用于检测表皮葡萄球菌的引物组命名为引物组Ⅵ。
实施例2、特异性
待测样本1：牛支原体(25523TM)。
待测样本2：金黄色葡萄球菌(CVCC 545)。
待测样本3：无乳链球菌(CVCC 586)。
待测样本4：酿脓链球菌(CGMCC1.8868)。
待测样本5：牛棒状杆菌(CVCC CAU0107)。
待测样本6：表皮葡萄球菌(12228TM)。
各个待测样本分别进行如下步骤：
1、提取待测样本的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组进行环介导等温扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL模板DNA(5pg-50pg)，补水至10μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
采用引物组Ⅰ的结果见图1。只有当待测样本为牛支原体的时候显示阳性扩增曲线。当待测样本为待测样本2、3、4、5、6的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅱ的结果见图2。只有当待测样本为金黄色葡萄球菌的时候显示阳性扩增曲线。当待测样本为待测样本1、3、4、5、6的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅲ的结果见图3。只有当待测样本为无乳链球菌的时候显示阳性扩增曲线。当待测样本为待测样本1、2、4、5、6的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅳ的结果见图4。只有当待测样本为酿脓链球菌的时候显示阳性扩增曲线。当待测样本为待测样本1、2、3、5、6的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅴ的结果见图5。只有当待测样本为牛棒状杆菌的时候显示阳性扩增曲线。当待测样本为待测样本1、2、3、4、6的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅵ的结果见图6。只有当待测样本为表皮葡萄球菌的时候显示阳性扩增曲线。当待测样本为待测样本1、2、3、4、5的时候均不显示阳性扩增曲线。
以上结果表明，本发明提供的六个引物组分别对其靶标菌具有很高的特异性。
实施例3、灵敏度
待测样本1：牛支原体(25523TM)。
待测样本2：金黄色葡萄球菌(CVCC 545)。
待测样本3：无乳链球菌(CVCC 586)。
待测样本4：酿脓链球菌(CGMCC1.8868)。
待测样本5：牛棒状杆菌(CVCC CAU0107)。
待测样本6：表皮葡萄球菌(12228TM)。
1、提取待测样本的基因组DNA，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。
2、以步骤1得到的稀释液为模板，分别采用实施例1制备的引物组进行环介导等温扩增。
待测样本为待测样本1时，采用引物组Ⅰ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本2时，采用引物组Ⅱ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本3时，采用引物组Ⅲ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本4时，采用引物组Ⅳ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本5时，采用引物组Ⅴ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本6时，采用引物组Ⅵ进行环介导等温扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数分别为103、102或101)，补水至10μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
如果在50min内出现阳性扩增曲线，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
引物组Ⅰ检测靶标菌的灵敏度为102个拷贝数/反应体系，引物组Ⅱ检测靶标菌的灵敏度为103个拷贝数/反应体系，引物组Ⅲ检测靶标菌的灵敏度为103个拷贝数/反应体系，引物组Ⅳ检测靶标菌的灵敏度为102个拷贝数/反应体系，引物组Ⅴ检测靶标菌的灵敏度为102个拷贝数/反应体系，引物组Ⅵ检测靶标菌的灵敏度为103个拷贝数/反应体系。
实施例4、应用
待测样本为如下样本一、样本二或样本三：
样本一：已通过细菌培养鉴定确认含有牛支原体的牛奶；
样本二：已通过细菌培养鉴定确认含有金黄色葡萄球菌的牛奶；
样本三：已通过细菌培养鉴定确认含有牛棒状杆菌的牛奶。
1、提取待测样本的总DNA。
2、以步骤1提取的总DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组进行环介导等温扩增。
反应体系与反应条件均同实施例2。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
样本一的结果见图7。只有采用引物组Ⅰ的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅰ以外的其它五个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线。
样本二的结果见图8。只有采用引物组Ⅱ的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅱ以外的其它五个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线。
样本三的结果见图9。只有采用引物组Ⅴ的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅴ以外的其它五个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线。
以上结果表明，利用本发明提供的引物组合进行奶牛乳房炎6种传染性病原体的检测，结果准确可靠。
Claims (8)
1.引物组合，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ、引物组Ⅴ和引物组Ⅵ组成；
(a2)由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ、所述引物组Ⅴ和所述引物组Ⅵ中的任意两个、任意三个、任意四个或任意五个组成；
(a3)所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ、所述引物组Ⅴ或所述引物组Ⅵ；
所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；
所述引物Ⅰ-F3为如下(b1)或(b2)；
(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-B3为如下(b3)或(b4)；
(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-FIP为如下(b5)或(b6)；
(b5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-BIP为如下(b7)或(b8)；
(b7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(b8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-LF为如下(b9)或(b10)；
(b9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(b10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-LB为如下(b11)或(b12)；
(b11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(b12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB组成；
所述引物Ⅱ-F3为如下(c1)或(c2)；
(c1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(c2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-B3为如下(c3)或(c4)；
(c3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(c4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-FIP为如下(c5)或(c6)；
(c5)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(c6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-BIP为如下(c7)或(c8)；
(c7)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(c8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-LF为如下(c9)或(c10)；
(c9)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(c10)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-LB为如下(c11)或(c12)；
(c11)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(c12)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅲ由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB组成；
所述引物Ⅲ-F3为如下(d1)或(d2)；
(d1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
(d2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-B3为如下(d3)或(d4)；
(d3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
(d4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-FIP为如下(d5)或(d6)；
(d5)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
(d6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-BIP为如下(d7)或(d8)；
(d7)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
(d8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-LF为如下(d9)或(d10)；
(d9)序列表的序列17所示的单链DNA分子；
(d10)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-LB为如下(d11)或(d12)；
(d11)序列表的序列18所示的单链DNA分子；
(d12)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅳ由引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB组成；
所述引物Ⅳ-F3为如下(e1)或(e2)；
(e1)序列表的序列19所示的单链DNA分子；
(e2)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-B3为如下(e3)或(e4)；
(e3)序列表的序列20所示的单链DNA分子；
(e4)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-FIP为如下(e5)或(e6)；
(e5)序列表的序列21所示的单链DNA分子；
(e6)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-BIP为如下(e7)或(e8)；
(e7)序列表的序列22所示的单链DNA分子；
(e8)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-LF为如下(e9)或(e10)；
(e9)序列表的序列23所示的单链DNA分子；
(e10)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-LB为如下(e11)或(e12)；
(e11)序列表的序列24所示的单链DNA分子；
(e12)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅴ由引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB组成；
所述引物Ⅴ-F3为如下(f1)或(f2)；
(f1)序列表的序列25所示的单链DNA分子；
(f2)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-B3为如下(f3)或(f4)；
(f3)序列表的序列26所示的单链DNA分子；
(f4)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-FIP为如下(f5)或(f6)；
(f5)序列表的序列27所示的单链DNA分子；
(f6)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-BIP为如下(f7)或(f8)；
(f7)序列表的序列28所示的单链DNA分子；
(f8)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-LF为如下(f9)或(f10)；
(f9)序列表的序列29所示的单链DNA分子；
(f10)将序列29经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列29具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-LB为如下(f11)或(f12)；
(f11)序列表的序列30所示的单链DNA分子；
(f12)将序列30经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列30具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅵ由引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB组成；
所述引物Ⅵ-F3为如下(g1)或(g2)；
(g1)序列表的序列31所示的单链DNA分子；
(g2)将序列31经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列31具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅵ-B3为如下(g3)或(g4)；
(g3)序列表的序列32所示的单链DNA分子；
(g4)将序列32经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列32具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅵ-FIP为如下(g5)或(g6)；
(g5)序列表的序列33所示的单链DNA分子；
(g6)将序列33经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列33具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅵ-BIP为如下(g7)或(g8)；
(g7)序列表的序列34所示的单链DNA分子；
(g8)将序列34经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列34具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅵ-LF为如下(g9)或(g10)；
(g9)序列表的序列35所示的单链DNA分子；
(g10)将序列35经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列35具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅵ-LB为如下(g11)或(g12)；
(g11)序列表的序列36所示的单链DNA分子；
(g12)将序列36经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列36具有相同功能的DNA分子。
2.权利要求1所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(h1)或(h2)：
(h1)鉴定牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌；
(h2)用于检测待测样本中是否含有牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌。
3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(j1)或(j2)：
(j1)鉴定牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌；
(j2)用于检测待测样本中是否含有牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种检测待测菌是否为牛支原体、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、牛棒状杆菌或表皮葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测菌的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为牛支原体；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为金黄色葡萄球菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为无乳链球菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为酿脓链球菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为牛棒状杆菌；
如果采用所述引物组Ⅵ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为表皮葡萄球菌。
6.一种检测待测样本中是否含有牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有牛支原体；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有金黄色葡萄球菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有无乳链球菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有酿脓链球菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有牛棒状杆菌；
如果采用所述引物组Ⅵ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有表皮葡萄球菌。
7.权利要求1所述引物组合在检测待测菌是否为牛支原体、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、牛棒状杆菌或表皮葡萄球菌中的应用。
8.权利要求1所述引物组合在检测待测样本中是否含有牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌中的应用。
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