CN108103213A - 一组检测牛棒状杆菌的引物及其试剂盒 - Google Patents

一组检测牛棒状杆菌的引物及其试剂盒 Download PDF

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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Abstract

本发明涉及一组检测牛棒状杆菌的引物及其试剂盒，属于微生物检测技术领域。本发明提供的用于检测牛棒状杆菌的引物，包括外引物对、内引物对和环引物；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述环引物的序列如SEQ ID NO.5所示。本发明提供的特异性引物，特异性好，灵敏度高，能够实现牛棒状杆菌的快速检测。

Description

一组检测牛棒状杆菌的引物及其试剂盒
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一组检测牛棒状杆菌的引物及其试剂盒。
背景技术
牛棒状杆菌(Corynebacterium bovis，C.bovis)是一种革兰氏阳性杆菌，条件性致病，世界范围内广泛分布，可感染多种动物，可导致裸小鼠表皮角化过度，俗称“鳞皮病”，也是引起奶牛乳房炎的常见病原菌之一。无毛和免疫缺陷鼠一旦感染，几乎终身携带。具有免疫活性的大鼠、小鼠一般不会长期携带。感染小鼠表现鳞屑状皮炎，SCID小鼠则出现脱毛、形成秃块等症状。通常呈一过性感染，感染后7～10天出现“鳞屑”，14～20天内自行消失，但感染至少要持续30天左右。组织学检查可出现棘皮症、角化过度，真皮层可观察到单核细胞浸润。动物感染通常伴随体重减轻、结膜充血、摄水量增加、异种移植物生长缓慢等现象。感染牛棒状杆菌引起角化过度和体重减轻的小鼠，被认为不适用于科学实验。牛棒状杆菌感染可影响肿瘤生长、干扰异种移植、改变自然杀伤(NK)细胞活性等。C.bovis已被全球众多实验动物机构列为实验大鼠、小鼠，尤其是裸鼠、免疫缺陷鼠的重点监测病原体之一，以确保实验动物质量。牛棒状杆菌可通过培养法和分子生物学方法进行检测。
牛棒状杆菌为革兰氏阳性菌，菌体短小、一端或两端膨大呈棒状，无鞭毛、无荚膜、无芽孢，兼性厌氧。分离培养时生长缓慢，分离困难，效率低，常造成漏检，不适用于大样本调查。直接从皮肤组织取样进行细菌分离培养，往往会因动物皮肤表面携带的其他微生物生长速度快，出现杂菌阻碍牛棒状杆菌生长甚至将其覆盖的现象，从而会造成漏检。PCR具备高效快速、操作简便等优势，近年来应用十分广泛，尤其在生长缓慢及苛养菌的检测中非常适用。但由于需要昂贵的扩增仪，且容易发生污染导致假阳性结果的出现等原因限制了该方法在一线现场的推广应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一组检测牛棒状杆菌的引物及其试剂盒。本发明提供的特异性引物，特异性好，灵敏度高，能够实现牛棒状杆菌的快速检测。
本发明提供了一组用于检测牛棒状杆菌的引物，包括外引物对、内引物对和环引物；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述内引物对的序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述环引物的序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括：2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光染料和权利要求1所述引物。
优选的是，所述外引物的浓度分别为5μmol/L。
优选的是，所述内引物的浓度分别为40μmol/L。
优选的是，所述环引物的浓度分别为20μmol/L。
优选的是，每25μL反应体系的试剂盒包括2×反应缓冲液12.5μL，权利要求1所述引物各1μL；Bst DNA聚合酶1μL，荧光染料1μL。
本发明提供了一组用于检测牛棒状杆菌的引物。本发明所述引物能够利用具有链置换活性的DNA聚合酶和引物特异性地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下保温几十分钟，即可完成核酸的扩增。本发明所述特异性引物特异性好，灵敏度高，对后续检测过程使用的仪器设备要求低，能够实现牛棒状杆菌的快速检测，适宜推广应用。试验结果表明，本发明所述引物用于检测牛棒状杆菌时最低检测线是118fg，在60min内即可完成牛棒状杆菌的检测。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的扩增温度优化结果图；
图2为本发明实施例3提供的特异性试验LAMP扩增图；
图3为本发明实施例3提供的特异性试验可视化检测结果图；
图4为本发明实施例3提供的特异性试验电泳检测结果图；
图5为本发明实施例4提供的敏感性试验可视化检测结果图；
图6为本发明实施例4提供的敏感性试验电泳检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了一组用于检测牛棒状杆菌的引物，包括外引物对、内引物对和环引物；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述内引物对的序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述环引物的序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明中，用于检测牛棒状杆菌的引物，根据GenBank公布的牛棒状杆菌16SrRNA序列设计，包括两条外引物、两条内引物和一条环引物。在本发明中，所述外引物的核苷酸序列具体为：
F3正向外引物：5’-CTTTTGTGACGGTACCTGCA-3’(SEQ ID NO.1)；
B3反向外引物：5’-GCATTTCACCGCTACACCAG-3’(SEQ ID NO.2)。
在本发明中，所述内引物的核苷酸序列具体为：
FIP正向内引物：
5’-GGACAACGCTCGCACCCTACGAAGCACCGGCTAACTACG-3’(SEQ ID NO.3)；
BIP反向内引物：
5’-CGTCTGTGAAATCCCGGGGCCAGTCTCCCCTACAGCACT-3’(SEQ ID NO.4)。
在本发明中，所述环引物的核苷酸序列具体为：
LB反向环引物：5’-GCAGGCGATACGGGCAT-3’(SEQ ID NO.5)。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括：2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光染料和上述技术方案所述引物。
在本发明中，所述反应缓冲液优选包括40mM的Tris-HCl(pH 8.8)，20mM的KCl，16mM的MgSO4，20mM的(NH4)2SO4，0.2％(体积百分含量)的Tween20，1.6M的甜菜碱和2.8mM的dNTPs。在本发明中，所述荧光染料包括钙黄绿素、氯化锰。在本发明中，所述高黄绿素的浓度优选为0.5mM，所述氯化锰的浓度优选为10mM。
在本发明中，所述外引物的浓度分别为5μmol/L。在本发明中，所述内引物的浓度分别为40μmol/L。在本发明中，所述环引物的浓度分别为20μmol/L。
在本发明中，每25μL反应体系的试剂盒包括2×反应缓冲液12.5μL，上述技术方案所述引物各1μL；Bst DNA聚合酶1μL，荧光染料1μL。在本发明中，所述反应体系在具体检测时，优选添加1μL的检测样品，水用于补足。本发明对所述水的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规PCR用水即可。在本发明中，25μLLAMP反应体系具体如表1所示：
表1 25μL LAMP反应体系
组分 浓度 体积
F3 5μmol/L 1μL
B3 5μmol/L 1μL
FIP 40μmol/L 1μL
BIP 40μmol/L 1μL
LB 20μmol/L 1μL
2×反应缓冲液 - 12.5μL
BstDNA聚合酶 8U 1μL
荧光染料 - 1μL
水 - 补足
检测样品 - 1μL
本发明所述试剂盒在使用时，优选按照上述配比将各组分混合后进行LAMP扩增。本发明所述试剂盒在用于牛棒状杆菌的检测时，所述检测的扩增程序优选为在60～65℃恒温下反应30～75min，更优选为在64℃恒温下反应60min。在本发明中，所述反应优选在等温扩增仪中进行。在本发明中，所述待测样品优选来自动物组织、分泌物或分离的菌种所提取的DNA。
得到扩增产物后，本发明将所述扩增产物进行荧光染料目测观察或经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测分析。在本发明中，所述荧光染料目测观察法为：在LAMP反应结束后，显色结果观察到绿色荧光则判断为阳性，橙色则判断为阴性。在本发明中，所述琼脂糖凝胶电泳法为：取2μL扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，若出现LAMP特征性的梯形带则判断为阳性，未出现扩增条带则判断为阴性。
下面结合具体实施例对本发明所述的一组检测牛棒状杆菌的引物及其试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
下述实施例中的方法，若无特殊说明，均为本领域常规方法。
本发明实施例使用的菌株信息如下：牛棒状杆菌ATCC 7715、嗜肺巴斯德杆菌ATCC35149、支气管鲍特杆菌ATCC14065、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、绿脓杆菌ATCC 27853、啮齿柠檬酸杆菌ATCC 51116购自美国标准生物品收藏中心；鼠伤寒沙门菌CMCC50115、福氏志贺菌CMCC 51572、肺炎克雷伯杆菌CMCC 46117购自中国医学细菌保藏管理中心。
实施例1
牛棒状杆菌LAMP检测引物设计
针对GenBank中登录的牛棒状杆菌16S rRNA基因序列保守区域设计特异性LAMP引物，序列如下：
F3正向外引物：5’-CTTTTGTGACGGTACCTGCA-3’(SEQ ID NO.1)
B3反向外引物：5’-GCATTTCACCGCTACACCAG-3’(SEQ ID NO.2)
FIP正向内引物：
5’-GGACAACGCTCGCACCCTACGAAGCACCGGCTAACTACG-3’(SEQ ID NO.3)
BIP反向内引物：
5’-CGTCTGTGAAATCCCGGGGCCAGTCTCCCCTACAGCACT-3’(SEQ ID NO.4)
LB反向环引物：5’-GCAGGCGATACGGGCAT-3’(SEQ ID NO.5)
实施例2
基因组DNA提取、LAMP扩增体系建立
利用TIANGEN细菌基因组DNA抽提试剂盒提取牛棒状杆菌基因组DNA，紫外分光光度计测定OD260/280在1.6-2.0范围内，-20℃保存备用。
LAMP反应体系如下所示：
扩增温度的优化，优化结果如图1所示：
其中BlockA中 CH1为60℃ 牛棒状杆菌DNA
CH2为60℃ 水
BlockB中 CH1为62℃ 牛棒状杆菌DNA
CH2为62℃ 水
BlockC中 CH1为64℃ 牛棒状杆菌DNA
CH2为64℃ 水
BlockD中 CH1为66℃ 牛棒状杆菌DNA
CH2为66℃ 水
选取60℃、62℃、64℃和66℃作为扩增温度，对引物的扩增温度进行优化。结果显示，水均未扩增，60℃反应时，水在47min左右起峰；62℃反应时，水近60min左右起峰；64℃和66℃，水在60min内均未起峰，64℃阳性核酸起峰时间稍早，故选择64℃作为最佳反应温度。
将建立的LAMP扩增体系放入等温扩增仪中，64℃反应60min。扩增结果进行目测或经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测分析。目测观察到绿色荧光则判断为阳性，橙色则判断为阴性。琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特异性的梯形带判断为阳性。
实施例3
LAMP特异性分析
以牛棒状杆菌基因组DNA为阳性对照模板，灭菌双蒸水为阴性对照模板，嗜肺巴斯德杆菌、支气管鲍特杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门菌、福氏志贺菌、啮齿柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯杆菌的基因组DNA为实验对象，利用本发明建立的LAMP扩增方法分别进行检测，以评价该方法的特异性。结果如图2、图3和图4所示，图2为特异性试验LAMP扩增图；图3为特异性试验可视化检测结果图，其中，1为牛棒状杆菌，2为水，3为嗜肺巴斯德杆菌、4为支气管鲍特杆菌，5为金黄色葡萄球菌，6为绿脓杆菌，7为鼠伤寒沙门氏菌，8为福氏志贺菌，9为啮齿柠檬酸杆菌，10为肺炎克雷伯杆菌；图4为特异性试验电泳检测结果图，其中，1为牛棒状杆菌，2为水，3为嗜肺巴斯德杆菌，4为支气管鲍特杆菌，5为金黄色葡萄球菌，6为绿脓杆菌，7为鼠伤寒沙门氏菌，8为福氏志贺菌，9为啮齿柠檬酸杆菌，10为肺炎克雷伯杆菌，M为DL 2000DNAMarker。仅牛棒状杆菌出现特异性扩增，其他模板均未出现扩增，表明本发明建立的LAMP检测方法特异性良好。
实施例4
LAMP敏感性分析
对实施例2所提取的牛棒状杆菌基因组DNA按10倍系列稀释成11.8ng/μL、1.18ng/μL、118pg/μL、11.8pg/μL、1.18pg/μL、118fg/μL、11.8fg/μL、1.18fg/μL共8个稀释度作为模板，采用本发明建立的LAMP检测方法进行扩增，以验证本发明建立的LAMP体系的敏感性。
结果如图5和图6所示，图5为敏感性试验可视化检测结果图，其中，1为11.8ng/μL，2为1.18ng/μL，3为118pg/μL，4为11.8pg/μL，5为1.18pg/μL，6为118fg/μL，7为11.8fg/μL，8为1.18fg/μL；图6为敏感性试验电泳检测结果图，其中，1为11.8ng/μL，2为1.18ng/μL，3为118pg/μL，4为11.8pg/μL，5为1.18pg/μL，6为118fg/μL，7为11.8fg/μL，8为1.18fg/μL，M为DL2000DNAMarker。本发明所建立的LAMP检测方法的最低检测限为118fg。
实施例5
本发明LAMP方法的临床应用
为测试本发明在实际样品检测中的效果。采集55份小鼠回盲部内容物样品提取细菌DNA，用本发明所建立的LAMP方法进行扩增。以牛棒状杆菌基因组DNA为阳性对照模板，灭菌双蒸水为阴性对照模板。模板制备方法、扩增反应体系和扩增条件同实施例2。结果显示阴性对照未出现扩增，阳性对照出现特异性扩增，55份样品中有12份出现特异性扩增。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海实验动物研究中心
<120> 一组检测牛棒状杆菌的引物及其试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttttgtgac ggtacctgca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatttcacc gctacaccag 20
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggacaacgct cgcaccctac gaagcaccgg ctaactacg 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtctgtgaa atcccggggc cagtctcccc tacagcact 39
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaggcgata cgggcat 17

Claims (6)

1.一组用于检测牛棒状杆菌的引物，其特征在于，包括外引物对、内引物对和环引物；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述内引物对的序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示；所述环引物的序列如SEQ ID NO.5所示。
2.一种基于权利要求1所述引物的试剂盒，包括：2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光染料和权利要求1所述引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述外引物的浓度分别为5μmol/L。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述内引物的浓度分别为40μmol/L。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述环引物的浓度分别为20μmol/L。
6.根据权利要求2～5任意一项所述的试剂盒，其特征在于，每25μL反应体系包括2×反应缓冲液12.5μL，权利要求1所述引物各1μL；BstDNA聚合酶1μL，荧光染料1μL。
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