CN104862406B - 一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物与探针及其试剂盒 - Google Patents

一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物与探针及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物与探针及其试剂盒，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示。其是一种特异、灵敏、简易、快速的现场检测结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、坎纳分支杆菌)的RPA‑LFD引物与探针以及含有该引物与探针的试剂盒。

Description

一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物与探针及 其试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及应用重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测技术(Recombinase Polymerase Amplification and Lateral Flow Dipstick，RPA-LFD)鉴定结核分枝杆菌复合群的方法和相关引物与探针以及检测试剂盒。
背景技术
结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTC)中能引起人和动物的结核病的致病菌包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、坎纳分支杆菌(M.canettii)等。结核病是一种严重危害人和动物健康的人畜共患传染病，全球每年因结核病死亡人数约为200万～300万。根据世界卫生组织的统计，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一。目前我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病的14.3％，仅次于印度位居全球第2位。在结核病人中，约有1％的人通过饮用未经消毒的牛奶等方式感染了牛分支杆菌(牛型菌)；在亚洲、非洲国家和地区，4.7％～30.8％的结核阳性牛感染的是结核分枝杆菌(人型菌)，人结核病感染越为严重的国家，牛感染人型菌的比例也就相应地越高。因此，结核病的防控关系到国家的公共卫生安全，而控制结核病传播的关键就是早期准确诊断。
目前结核病的诊断主要依赖于对病原体的检查，常用方法为涂片染色镜检、分离培养、免疫学诊断和分子生物学诊断等。其中，分离培养法是目前诊断结核的金标准，但培养需要4～8周的时间，延误临床诊断与治疗。涂片染色镜检法操作简单，快速，但该法灵敏度低、特异性差。免疫学诊断则由于现有的抗原或抗体与其它微生物存在交叉，导致其特异性较差、假阳性率高。分子生物学诊断快速、灵敏，且利用特异性的DNA片段可以区分结核分枝杆菌复合体内菌种，但是以PCR技术为代表的分子生物学方法对仪器设备和技术人员要求较高，不能在结核病现场进行快速诊断。虽然恒等温扩增技术(LAMP)可用于现场检测，但是其反应时间一般在1h，对结果的判定存在人肉眼的误差等问题。因此，亟需建立一种可应用于现场、简易、快速检测技术。
RPA技术通过三种酶的混合物，即能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右，整个过程一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量级(trace levels)的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。目前，RPA反应可以通过琼脂糖凝胶电泳，荧光扩增曲线和LFD试纸条三种不同方式检测结果，这三种方式的引物与探针反应原理是不同的。凝胶电泳和荧光扩增曲线法仍然依赖实验室和特殊仪器设备，而LFD是一种无需特殊仪器可用于现场的方法。
RPA-nfo反应的引物与探针的设计没有具体的规则，只能经过RPA反应后应用侧流层析试纸条(LFD)检测，才能筛选获得可用于临床检测的引物与探针组合。在RPA-nfo正反向引物的扩增靶序列中设计一条带FAM标记的特异探针，同时反向引物用生物素标记，生物素标记的RPA产物与FAM标记的特异探针杂交、FAM标记的特异探针与抗FAM抗体的金标物结合后，将该免疫复合物滴加到试纸条上，免疫复合物通过层析膜扩散，扩散到检测线时，生物素标记的扩增产物被生物素配体捕获，形成具有颜色的检测线，即检测条带。不被捕获的免疫复合物继续扩散到质控线被特异性抗体所捕获，形成具有颜色的质控线，即对照条带。当RPA技术与侧流层析技术结合后，即RPA-LFD技术，可以通过侧流层析试纸条(LFD)读取结果，本方法既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，仅仅使用侧流层析试纸就可以通过肉眼观察结果。因此，RPA-LFD技术在结核病的现场诊断方面具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异、灵敏、简易、快速的现场检测结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、坎纳分支杆菌)的RPA-LFD引物与探针以及含有该引物与探针的试剂盒。
为实现本发明目的，采用如下技术方案：
一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物对和探针组合，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示。
优选的是，所述的核分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、坎纳分支杆菌。
优选的是，所述正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示：
SEQIDNo.1：
5'-GGTTCGACCAGGGAACGCGGGATGTGATCG-3'
SEQIDNo.2：
5'-(Biotin)-GAGTCTTGCCCCCCACCCAACCATCCCTGCCAT-3'
SEQIDNo.3：
5'FAM-CCGCAAGGGAGACAGGGTGGCGCAACCGCG(dSpacer)
CGCTTCGATGGATTC-C3-Spacer3'
本发明还提供了一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的的试剂盒，该试剂盒包含上述的引物对和探针组合。
本发明还提供了一种现场快速检测结核分枝杆菌复合群的方法，包括如下步骤：
(1)检测样本DNA的提取或检测样本裂解处理；
(2)以步骤(1)中处理的样本为模板，进行RPA扩增；
(3)用侧流层析试纸条检测上述RPA扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含有结核分枝杆菌复合群。
优选的是，所述RPA扩增体系为：RPA反应体系为50μL：其中包括10μM的上游引物2.1μL，10μM的下游引物2.1μL，10μM的探针0.6μL，rehydration缓冲液29.5μL，待测样本DNA或粗裂解产物和ddH2O 13.2μL；将上述47.5μL混合物加入TwistAmp nfo反应管，充分溶解，然后加入2.5μL醋酸镁溶液，进行扩增。扩增程序为：恒温水浴锅38摄氏度反应25分钟。
优选的是，步骤(3)的具体步骤为：取2μL RPA扩增产物与98μL的LFD检测缓冲液混合，将LFD垂直浸入观察结果，在5分钟内，若同时出现检测条带和对照条带，则该样本结核分枝杆菌复合群感染阳性，仅出现对照条带则说明该样本中不含结核分枝杆菌复合群细菌，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。
本发明还提供含有上述引物与探针组合的用于检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒。该试剂盒中还包括大肠杆菌来源的recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、rehydration缓冲液、280mM醋酸镁(MgAc)溶液、侧流层析试纸条(特异性检测生物素与FAM标记基因扩增产物)、PBST试纸条检测缓冲液(1×PBS+0.1％吐温20)、灭菌去离子双蒸水(ddH2O)，TE缓冲液、10％(w/v)SDS、2％(w/v)蛋白酶K、牛分支杆菌基因组DNA标准阳性模板的一种或多种。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供的RPA-LFD引物与探针组合或试剂盒灵敏性高、特异性强。最低可以检测8.0×100cfu的结核分枝杆菌复合群，与副结核分支杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等细菌均无交叉反应。
(2)本发明提供的RPA-LFD引物与探针组合或试剂盒不仅可用于结核分枝杆菌复合群菌株检测，还可用于临床样本的检测。临床样本主要包括组织样本、痰液、血液、气溶胶样本等。
(3)本发明提供的RPA-LFD检测方法使用方便，无需特殊设备，仅仅在38℃下，25min就能对待测样本的粗裂解物进行结核分枝杆菌复合群的灵敏、特异、简易地检测，适合现场或基层结核病的检疫工作。
附图说明
图1结核分枝杆菌复合群RPA-LFD引物与探针的筛选，Control Primer/Probe Mix扩增组为TwistAmp nfo kit提供的对照引物、探针与模板的RPA扩增结果；MTC-RPA-LFD组为本发明筛选出的特异性检测结核分枝杆菌复合群的引物与探针的扩增结果；NTC是以ddH2O代替模板的阴性对照。
图2结核分枝杆菌复合群RPA-LFD灵敏性检测，模板分别为8.0×107cfu-8.0×10- 1cfu牛分支杆菌基因组DNA，NTC是以ddH2O代替模板的阴性对照。
图3结核分枝杆菌复合群RPA-LFD特异性检测，M.bovis、M.tuberculosis、M.africanum、M.paratuberculosis、E.coli O157、S.aureus、S.pneumoniae模板分别为牛分支杆菌、结核分枝杆菌、非洲分支杆菌、副结核分支杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌基因组DNA；NTC是以ddH2O代替模板的阴性对照。
图4结核分枝杆菌复合群临床样本RPA-LFD检测，+：模板为牛分支杆菌基因组DNA，－：以ddH2O代替模板的阴性对照，1-8：临床上确诊为牛结核病肺脏样本DNA，9：临床上确诊的牛分支杆菌阳性血液样本DNA，10：临床上确诊的牛场气溶胶牛结核分枝杆菌阳性样本DNA，11-20：临床上确诊人结核病痰液样本DNA，21：牛结核病阴性肺脏组织DNA，22：人结核病阴性痰液样本DNA。
具体实施方式
下述实施例用于进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例均按照常规试验条件与方法进行，或者按照制造厂商所建议的试验条件。
1.试验材料
结核分枝杆菌(M.tuberculosis H37Rv株)、牛分支杆菌(M.bovis ATCC 19210)、非洲分支杆菌(M.africanum)、副结核分支杆菌、大肠杆菌O157、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌，临床上确诊为牛结核病肺脏组织、血液和气溶胶样本DNA等均由山东省农业科学院奶牛研究中心疾病研究室保存。人结核病痰液样本DNA提取物由济南市传染病医院提供。
引物与探针由上海生工生物有限公司合成。TwistAmp DNA Amplification nfoKits购自TwistDX公司，侧流层析试纸条(HybriDetect Dipsticks)购自Milenia公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
2.实验仪器
恒温水浴锅，离心机，掌上离心机，涡旋仪等。
实施例一、引物与探针的设计和筛选
目前，RPA-LFD引物与探针的设计没有具体的规则，必须经过RPA反应后应用侧流层析试纸条(LFD)检测，才能筛选获得可用于临床检测的引物与探针。
RPA引物的长度一般为30-35nt，引物过短会严重影响重组酶的活性。长引物并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性。LF探针长度一般在46-52nt，nfo核酶距离探针5’端30个碱基左右，距离3’端16-22个碱基左右。
实验中需要从靶标序列两端设计多对引物与探针进行优化、筛选，个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响。但是还是有一些注意点：(1)5’端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，能促引物与扩增靶基因的结合。对于3’末端的3个核苷酸来说，鸟嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的稳定结合，可以提升引物的扩增性能。(2)引物中最好不要出现特殊序列，比如长串的聚嘌呤或聚嘧啶。GC含量过高(>70％)或过低(<30％)都不利于RPA扩增。(3)此外，引物与探针设计时应当尽量避免容易形成二级结构、引物-探针互作、发夹结构的序列，减少二聚体的形成。
本实验中根据结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分支杆菌保守的recA基因(GengBank No.X58485、AF2122/97、FR878060)设计了2条特异性探针，在探针的两侧设计了4条正向引物和4条反向引物。以牛分支杆菌DNA为模板对8种不同引物组合进行了检测筛选，最终选出一组扩增效率高，特异性强的引物与探针组合，用于结核病RPA-LFD检测，引物和探针序列分别见SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3(表1)。
表1
注：Biotin：生物素标记；FAM：羧基荧光素标记；dSpacer：核苷酸碱基类似物，是nfo核酸酶切割位点；C3-Spacer：聚合酶延伸阻断物。
实施例二、结核分枝杆菌复合群RPA-LFD检测方法的建立
1.实验步骤
(1)细菌基因组DNA的提取
取1mL菌液，按照天根生化科技(北京)有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)说明书进行细菌总DNA的提取。
(2)结核分枝杆菌复合群RPA-LFD反应体系的建立
RPA反应体系为50μL：
待测样本DNA或粗裂解产物和ddH2O 13.2μL
将上述混合物加入TwistAmp nfo反应管，充分溶解，然后加入2.5μL醋酸镁溶液，将反应管置于38℃水浴锅，处理25min。反应结束后取2μL与98μL的LFD检测缓冲液混合，将LFD置入5min内观察结果，若同时出现检测条带和对照条带，则该样品结核分枝杆菌复合群感染阳性，仅出现对照条带则说明该样品中不含结核分枝杆菌复合群细菌，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。
(3)结核分枝杆菌复合群RPA-FLD灵敏性检测
利用平板计数法计算牛分支杆菌菌液浓度，分别以10倍倍比稀释成8.0×107-8.0×10-1cfu/mL菌液，取相应稀释倍数的菌液各1mL，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取各稀释倍数的菌液基因组DNA，用100μL TE溶解，取2μL基因组DNA为模板进行RPA扩增，同时以ddH2O为阴性对照，检验本方法的灵敏性。
(4)结核分枝杆菌复合群RPA-FLD特异性检测
以本发明提供的RPA-FLD试剂盒对牛分支杆菌、结核分枝杆菌、非洲分支杆菌、副结核分支杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌基因组DNA进行扩增，同时以ddH2O为阴性对照，检验本方法的特异性。
2.试验结果
对8种引物与探针组合进行RPA-LFD检测，筛选出1种最优的引物和探针组合，结果如图1所示。以10倍倍比稀释的9个梯度的牛分支杆菌基因组DNA为模板进行检测，结果如图2所示，50μL体系的RPA-LFD的检测限为8.0×100cfu。对3株结核分枝杆菌复合群细菌和4株其他细菌作为对照菌株，分别进行RPA-LFD扩增，结果如图3所示，3株结核分枝杆菌复合群反应管在侧流层析试纸条的检测线处均出现条带，均为阳性结果，而其他4株细菌菌株和ddH2O对照均未出现检测条带，均有对照条带，说明RPA-LFD扩增结果呈阴性。
实施例三、临床上确诊为结核病样本的检测
1.试验方法
将临床肺脏组织样本用200μL TE缓冲液(1.0M Tris-HCl(pH8.0)10mL，0.5MNa2EDTA·2H2O(pH8.0)2mL，加蒸馏水至1000mL)重悬，然后加入30μL 10％(w/v)SDS和3μL2％(w/v)蛋白酶K，混合后37℃温育1h。
以上述方法制备的临床上确诊为牛结核病的8份肺脏组织样本、1份血液样本和1份气溶胶样本、10份确诊人结核病痰液提取物DNA样本以及1份牛结核病阴性肺脏组织DNA和1份人结核性阴性痰液DNA为模板，同时以牛分支杆菌DNA和ddH2O为阳性和阴性对照，分别进行RPA-LFD扩增检测。
2.检测结果
对临床确诊的10份牛结核病肺脏组织DNA和10份人结核病痰液样本DNA和2份阴性对照样本进行了RPA-LFD检测，结果如图4和表2所示。以上结果充分说明用本发明提供的RPA-LFD引物、探针以及试剂盒检测结核分枝杆菌复合群具有较高的灵敏度和特异性，最重要的是可以对临床样本直接进行现场快速的诊断。
表2
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (4)

1.一种用于现场快速特异性检测核分枝杆菌复合群的引物和探针组合物，其特征在于：其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示；
其中，核分枝杆菌复合群由结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、坎纳分支杆菌组成。
2.如权利要求1所述的引物对和探针组合，其特征在于，所述正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示：
SEQIDNo.1：
5'-GGTTCGACCAGGGAACGCGGGATGTGATCG-3'
SEQIDNo.2：
5'-（Biotin）-GAGTCTTGCCCCCCACCCAACCATCCCTGCCAT-3'
SEQIDNo.3：
5'FAM-CCGCAAGGGAGACAGGGTGGCGCAACCGCG（dSpacer）CGCTTCGATGGATTC-C3-Spacer3'。
3.一种用于现场快速特异性检测结核分枝杆菌、牛分支杆菌和非洲分支杆菌的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求1所述的引物对和探针组合。
4.权利要求1所述的引物和探针组合物在制备结核分枝杆菌复合群的致病性病原菌的RPA-LFD特异性检测试剂盒中的应用，其中，所述结核分枝杆菌为结核分枝杆菌、牛分支杆菌和非洲分支杆菌。
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Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis by Recombinase Polymerase Amplification;David S. Boyle et al.;《PLOS ONE》;20140813;第9卷(第8期);第1-9页 *

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CN104862406A (zh) 2015-08-26

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