TWI746897B - 檢測分枝桿菌的方法及其套組 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種檢測分枝桿菌的方法，包含下列步驟:提供樣本；提供引子對，其係選自於由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、與SEQ ID NO:1具約45%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO:2具約60%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:1之互補股以及SEQ ID NO:2之互補股所組成的群組；提供探針，其係選自於由SEQ ID NO:3、與SEQ ID NO:3具約70%至約99%相似度的序列及SEQ ID NO:3之互補股所組成之群組；利用引子對、探針與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物；以及分析產物以偵測分枝桿菌的存在。本發明亦提供一種檢測分枝桿菌的套組，包含前述所提之引子對與探針。

Description

檢測分枝桿菌的方法及其套組
本發明係關於一種檢測方法及其套組，特別是一種檢測分枝桿菌的方法及其套組。
分枝桿菌可分為結核分枝桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)和非結核分枝桿菌群。結核病的一些致病原係屬於結核分枝桿菌群(MTBC)的細菌，例如M. africanum 、M. bovis 、M. caprae 、M. canettii 、M. microti 、M. pinnipedii 以及M. tuberculosis 。這些致病原會造成人類或動物的結核病，其中又以M. africanum 、M. bovis 以及M. tuberculosis 為臨床上人類肺結核病的主要菌種。
結核病可發生在任何器官或組織，例如肺臟、淋巴結、腦膜、胸膜、腎臟、骨骼、皮膚、消化道及泌尿生殖道等等。若於早期給予適當的抗結核藥物治療，結核病幾乎可以百分之百痊癒。但若沒有在早期時予以治療，在三年內約有一半的致死率。所以目前極需一種檢測方法能夠於臨床上早期檢測出是否受到結核分枝桿菌群之病原的感染，其對於疾病治癒率的提升非常重要。
本發明之一實施例為一種檢測分枝桿菌的方法，包含下列步驟:提供一樣本；提供一引子對，引子對選自於由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、與SEQ ID NO:1具約45%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO:2具約60%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:1之互補股以及SEQ ID NO:2之互補股所組成的群組；提供一探針，探針選自於由SEQ ID NO:3、與SEQ ID NO:3具約70%至約99%相似度的序列及SEQ ID NO:3之互補股所組成之群組。利用引子對、探針與樣本進行聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction, PCR)以獲得產物。最後，分析產物以偵測分枝桿菌的存在。
根據本發明的一些實施方式，步驟「提供樣本」包含:提供檢體包含結核分枝桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)。
根據本發明的一些實施方式，檢體為血液、痰液、支氣管肺泡沖洗液、尿液、糞便或其組合。
根據本發明的一些實施方式，利用引子對、探針與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物步驟，包含進行聚合酶連鎖反應使得引子對增幅結核分枝桿菌群中IS6110序列的部分序列以獲得產物，其中此部分序列為SEQ ID NO:4。
根據本發明的一些實施方式，利用引子對、探針與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物步驟，聚合酶連鎖反應為即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)。
本發明之另一實施例為一種檢測分枝桿菌的套組，包含引子對與探針。上述引子對選自於由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、與SEQ ID NO:1具約45%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO:2具約60%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:1之互補股以及SEQ ID NO:2之互補股所組成的群組。探針選自於由SEQ ID NO:3、與SEQ ID NO:3具約70%至約99%相似度的序列及SEQ ID NO:3之互補股所組成之群組。
根據本發明的一些實施方式，引子對為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。
根據本發明的一些實施方式，探針為SEQ ID NO:3。
根據本發明的一些實施方式，檢測分枝桿菌的套組更包含檢體，其中檢體為血液、痰液、支氣管肺泡沖洗液、尿液、糞便或其組合。
根據本發明的一些實施方式，檢測分枝桿菌的套組更包含目標基因，其中目標基因為結核分枝桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)的IS6110序列。
根據本發明的一些實施方式，檢測分枝桿菌的套組更包含模板，具有約100個鹼基對至約250個鹼基對的長度。
根據本發明的一些實施方式，模板為SEQ ID NO:4。
為使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對本發明的實施態樣與具體實施例提出說明性的描述，但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。以下所揭露的各實施例，在有益的情形下可相互組合或取代，也可在一實施例中附加其他的實施例，而無須進一步的記載或說明。在以下描述中，將詳細敘述許多特定細節，以使讀者能夠充分理解以下的實施例。然而，亦可在無此等特定細節之情況下實踐本發明之實施例。
於本文中，除非內文中對於冠詞有所特別限定，否則『一』與『該』可泛指單一個或多個。將進一步理解的是，本文中所使用之『包含』、『包括』、『具有』及相似詞彙，指明其所記載的特徵、區域、整數、步驟、操作、元件與/或組件，但不排除其它的特徵、區域、整數、步驟、操作、元件、組件，與/或其中之群組。
本發明之實施例提供一種檢測分枝桿菌的方法，包含下列步驟:提供樣本、提供引子對及提供探針。引子對選自於由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、與SEQ ID NO:1具約45%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO:2具約60%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:1之互補股以及SEQ ID NO:2之互補股所組成的群組。探針選自於由SEQ ID NO:3、與SEQ ID NO:3具約70%至約99%相似度的序列及SEQ ID NO:3之互補股所組成之群組。接著，利用前述引子對、探針與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物。最後，分析產物以偵測分枝桿菌的存在。
樣本可包含各種不同來源的檢體，例如血液、痰液、支氣管肺泡沖洗液、尿液、糞便或其組合。在一些實施方式中，檢測分枝桿菌的方法中所提供的檢體包含結核分枝桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)。
引子對的選擇如前文所述，並不限於本文所揭露的SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。引子對在選擇上除了可包含SEQ ID NO:1的互補股及SEQ ID NO:2的互補股之外，SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示的序列亦可容許某種程度的變異。也就是說，與SEQ ID NO:1具約45%至約99%相似度的序列以及與SEQ ID NO:2具約60%至約99%相似度的序列應用於本實施方式中亦有相同的功效。舉例而言，引子對的選擇可包含SEQ ID NO:1之簡併序列及SEQ ID NO:2之簡併序列。此處所述之「簡併序列」係指本文所揭露的寡核苷酸序列中部分核苷酸為其他核苷酸所取代。換言之，SEQ ID NO:1之簡併序列意味著在SEQ ID NO:1序列長度不變的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約55%的變異程度。而SEQ ID NO:2之簡併序列意味著在SEQ ID NO:2序列長度不變的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約40%的變異程度。在另一些實施例中，引子對的選擇亦可包含SEQ ID NO:1之衍生序列及SEQ ID NO:2之衍生序列。此處所述「衍生序列」係指本文所揭露的寡核苷酸序列中在3’端或5’端可進行修飾，並且仍保留部分或全部序列。換言之，SEQ ID NO:1之衍生序列意味著在SEQ ID NO:1序列長度可進行增減的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約55%的變異程度。而SEQ ID NO:2之衍生序列意味著在SEQ ID NO:2序列長度可進行增減的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約40%的變異程度。在另一些實施方式中，引子對選自與SEQ ID NO:1具約80%至約99%相似度的序列以及與SEQ ID NO:2具約80%至約99%相似度的序列所組成的群組。
探針的選擇如前文所述，並不限於本文所揭露的SEQ ID NO:3。探針在選擇上除了可包含SEQ ID NO:3的互補股之外，SEQ ID NO:3所示的序列亦可容許某種程度的變異。也就是說，與SEQ ID NO:3具約70%至約99%相似度的序列應用於本實施方式中亦有相同的功效。舉例而言，探針的選擇可包含SEQ ID NO:3之簡併序列。SEQ ID NO:3之簡併序列意味著在SEQ ID NO:3序列長度不變的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約30%的變異程度。在另一些實施例中，探針的選擇亦可包含SEQ ID NO:3之衍生序列。SEQ ID NO:3之衍生序列意味著在SEQ ID NO:3序列長度在3’端或5’端進行增減的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約30%的變異程度。在另一些實施方式中，探針選自與SEQ ID NO:3具約80%至約99%相似度的序列。
在一實施方式中，利用引子對、探針與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物，包含進行聚合酶連鎖反應使得引子對增幅結核分枝桿菌群中IS6110序列的部分序列以獲得產物，其中此部分序列為SEQ ID NO:4。聚合酶連鎖反應為一種分子生物學技術。利用具有寡核苷酸序列之引子對擴增特定的去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)片段。應理解的是，本文所揭露的序列可用於各種以聚合酶連鎖反應為基礎的技術。在一實施例中，聚合酶連鎖反應可包含但不限於即時定量聚合酶連鎖反應(real-time PCR)。在一實施例中，若採用的即時聚合酶連鎖反應為探針型的螢光系統，利用引子對與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物之前，更包含使用探針對樣本進行雜合反應(hybridization)，使得探針黏合到目標序列上。亦即，引子對、探針與樣本一同進行一聚合酶連鎖反應以獲得一產物。
本發明之實施例亦提供一種檢測分枝桿菌的套組(kit)，包含一引子對與一探針。上述引子對選自於由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、與SEQ ID NO:1具約45%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO:2具約60%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:1之互補股以及SEQ ID NO:2之互補股所組成的群組。在一些實施方式中，引子對為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。在一些實施方式中，引子對為與SEQ ID NO:1具約45%至約99%相似度的序列及與SEQ ID NO:2具約60%至約99%相似度的序列。在一些實施方式中，引子對為SEQ ID NO:1之互補股及SEQ ID NO:2之互補股。上述探針選自於由SEQ ID NO:3、與SEQ ID NO:3具約70%至約99%相似度的序列及SEQ ID NO:3之互補股所組成之群組。在一些實施方式中，探針為SEQ ID NO:3。在一些實施方式中，探針為與SEQ ID NO:3具約70%至約99%相似度的序列。在一些實施方式中，引子對為SEQ ID NO:3之互補股。
在某些實施方式中，檢測分枝桿菌的套組可進一步包含檢體。檢體的來源可為血液、痰液、支氣管肺泡沖洗液、尿液、糞便或其組合。舉例來說，此檢測分枝桿菌的套組可應用於各醫療單位，藉由採集個體(例如：人)的體液或排泄物進行檢測。
在一些實施方式中，檢測分枝桿菌的套組可進一步包含目標基因，並且此目標基因係指結核分枝桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)的IS6110序列。尚有一些實施方式，檢測分枝桿菌的套組可進一步包含模板，具有約100個鹼基對至約250個鹼基對的長度。舉例來說，此模板可為IS6110序列中的部分序列，例如SEQ ID NO:4所示的序列，具有141個鹼基對的長度。但在另一些實施方式中，模板不包含SEQ ID NO:4所示的序列，且為具有約100個鹼基對至約250個鹼基對之長度的人工合成序列，其亦可與本實施方式中的引子對黏合從而被增幅。在一些實施方式中，可直接將SEQ ID NO:4所示的序列構築至不同載體中，並且，以此帶有SEQ ID NO:4的載體作為模板進行擴增時，專一性高且檢測效能極佳。
為進一步證實本發明之各種實施方式可用於檢測分枝桿菌的存在，遂進行以下試驗。應注意的是，下述實施例僅提供作為示範目的，而非限制本發明。
引子及探針 設計
結核分枝桿菌群其IS6110序列具高度保留性。故本試驗利用線上設計程式如primer 3及GenScript Real-time PCR Primer Design針對結核分枝桿菌群的IS6110序列(GenBank: LC005482)進行引子及探針的設計。
根據基因銀行(GenBank)資料庫提供關於Acession No. LC005482的資訊，第1圖繪示IS6110序列的部分正股序列。本試驗中引子對為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。SEQ ID NO:1所示之核苷酸序列係針對第929-949個鹼基對的位置進行設計(如右箭號方框所示)。SEQ ID NO:2所示之核苷酸序列係針對第1048-1069個鹼基對的位置進行設計(如左箭號方框所示)。而探針為SEQ ID NO:3。SEQ ID NO:3所示之核苷酸序列係針對位於第929個鹼基對與第1069個鹼基對之間的片段進行設計(如虛線方框所示)。據此，利用引子對SEQ ID NO:1-2可增幅的產物具有141鹼基對的長度。
引子對之靈敏度分析
根據前述GenBank資料庫編號LC005482所示的序列，將其選殖於pUC57載體(Protech CO., Ltd, GenBank: Y14837.1)，以獲得帶有IS6110序列的標準質體(以下簡稱為IS6110標準質體)。
依據市售即時定量聚合酶連鎖反應套組(QuantiNova Probe PCR Kit, Qiagen)操作說明書，反應混合液包含模板(IS6110標準質體)、15 μL的即時定量聚合酶連鎖反應試劑(QuantiNova probe master mix)、濃度為1000 nM的引子對(667 nM的SEQ ID NO:1及333 nM的SEQ ID NO:2)以及27 nM的探針(SEQ ID NO:3)，配置成總體積為30 μL的反應混合液。即時定量聚合酶連鎖反應條件為95°C變性(denature) 5秒，60°C黏合/擴增(annealing/amplification) 10秒，並將反應混合液於即時定量聚合酶連鎖反應器(CFX-96, BioRad)進行45個循環反應。
應說明的是，在此試驗中是以不同的模板量進行即時定量聚合酶連鎖反應，以測試引子對SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的靈敏度。依前述反應混合液的配方，製備八組不同模板量的反應混合液，分別帶有101 、102 、103 、104 、105 、106 、107 及108 拷貝數(copies)的IS6110標準質體。先針對102 、103 、104 、105 、106 、107 及108 拷貝數的組別進行如上述的即時定量聚合酶連鎖反應，每組重複試驗三次。參照第2圖至第3圖，其分別為即時定量聚合酶連鎖反應後所得之增幅曲線圖及標準曲線圖。如第2圖所示，橫軸為反應循環數(cycles)，縱軸為螢光強度(ΔRn)。由此增幅曲線圖可知，102 至108 拷貝數的螢光值皆呈現上升的正趨勢。如下表1所示，102 、103 、104 、105 、106 、107 及108 拷貝數的Cq值(quantification cycle)分別為33.19、30.08、26.75、23.35、19.99、16.72及13.88。
表1
Figure 107137692-A0304-0001
繼續參照第3圖，即以第2圖所增幅的結果數值做成標準曲線圖。橫軸為模板拷貝數。縱軸為門檻循環數，即為Cq值。依據即時定量聚合酶連鎖反應器(CFX-96, BioRad)所繪製的標準曲線，其具有可信度的動態範圍(dynamic range)為相關係數(R2 )大於0.98；增幅效率(E)介於90%至110%。前述增幅效率若低於90%，可能表示引子設計不良造成黏合效果差，故增幅效率較差。增幅效率若高於110%，可能表示引子有過多非專一性的黏合產生，造成增幅效率過高。如第3圖所示，根據前述102 至108 拷貝數之模板量在2圖中的結果數值，可做出斜率為-3.265的直線，其相關係數為0.999以及增幅效率為102.414%。故引子對SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的靈敏度符合動態範圍。
為了測試引子對與探針的組合之靈敏度檢測極限，進一步選取101 拷貝數以及5拷貝數的模板量進行即時定量聚合酶連鎖反應，以引子對(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)與探針(SEQ ID NO:3)進行即時定量聚合酶連鎖反應，分別重複20次試驗。101 拷貝數模板量的數據如第4圖所示，為即時定量聚合酶連鎖反應後所得之增幅曲線圖。橫軸為反應循環數(cycles)，縱軸為相對螢光單位(relative fluorescence unit,RFU)。由此增幅曲線圖可知，101拷貝數的螢光值皆呈現上升的正趨勢。101拷貝數以及5拷貝數的增幅結果，將其數值彙整於下表2。
Figure 107137692-A0305-02-0015-1
由表2可知，當模板量為101拷貝數時，門檻閾值設定為40循環數(cut off=40)，重複次數20次中皆被檢測出來，故陽性率為100%。而檢測出來的20組重複組別其Cq值範圍在34.85至36.99間，平均為36.23。當模板量為5拷貝數時，門檻閾值設定為40循環數(cut off=40)，重複次數20次中僅有一次未被檢測出來(NA)，故陽性率為約95%。其餘檢測出來的19組重複組別其Cq值範圍在34至37.7間，平均為35.64。陽性率95%以上為信賴區間，故可知使用本試驗的引子對與探針的組合，模板量的最低檢測極限可達5拷貝數。
此外，為更進一步測試SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2的專一性。本試驗以SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示的序列為基礎，設計出相似的引子對。具體來說，此相似的引子對的正向引子為50%相似於SEQ ID NO：1，而反向引子為66%相似於SEQ ID NO：2。接著，以此相似的引子對進行即時定量聚合酶連鎖反應。檢測方式如前述所提，在此不多做贅述。參照第5圖，為利用相似引子對進行即時定量聚合酶連鎖反應的增幅曲線圖。由此增幅曲線圖可知，102 至108 拷貝數的螢光值皆呈現上升的正趨勢。根據第5圖的增幅結果，將其數值彙整於下表3。
表3
Figure 107137692-A0304-0003
由表3可知，即使SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2具有某種程度的變異，當模板量低至102 拷貝數時，Cq值仍保持在40循環數以下(即35.85)，僅略高於SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2檢測相同模板量時所得的33.19。也就是說，在檢測的靈敏度上並無太大差異。
再者，為更進一步測試探針SEQ ID NO:3的專一性。本試驗以SEQ ID NO:3所示的序列為基礎，設計出相似的探針。具體來說，此相似的探針為SEQ ID NO:5、且具有75%相似於SEQ ID NO:3。接著，以此相似的探針(SEQ ID NO:5)與引子對(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)、以及以探針(SEQ ID NO:3)與引子對(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)進行即時定量聚合酶連鎖反應。檢測方式如前述所提，在此不多做贅述。檢測結果如下表4。
表4
Figure 107137692-A0304-0004
由表4可知，當模板量為10拷貝數時，無論是探針(SEQ ID NO:3)或是相似的探針(SEQ ID NO:5)，門檻閥值設定為40循環數(cut off = 40)，重複次數8次中皆被檢測出來，故陽性率為100%。因此，即使探針具有某種程度的變異，當模板量低至10拷貝數時，相似的探針辨識到標的基因(SEQ ID NO:4的部分序列)的陽性率仍保持在100%。也就是說，在檢測的靈敏度上並無差異。
臨床測試 (A)
本試驗進一步用於臨床上檢測。臨床檢體為肺結核確診病患的痰液。萃取結核病患的痰液的DNA。依據市售聚合酶連鎖反應套組(Dr. Q Taq DNA polymerase, BioFuture)操作說明書，以0.2 μM的SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2為引子，結核病患的痰液DNA作為模板進行聚合酶連鎖反應。PCR條件為95°C作用2分鐘後，95°C變性5秒，60°C黏合/擴增10秒，進行25個循環反應。接著將聚合酶連鎖反應後所得的產物以膠體電泳進行分析。如第6圖所示，欄1為分子量標示欄(marker ladder)。欄2顯示前述確診病患之痰液DNA經聚合酶連鎖反應後所獲得的增幅產物。欄3至欄5為對照組，顯示未感染結核病之個體的痰液DNA經聚合酶連鎖反應後所獲得的產物。根據前述引子設計可知，增幅產物大小預期為141bp，而欄2的增幅產物為單一條帶，並且大小位於200 bp與100 bp之間。也就是說，SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2未有其他非專一的增幅產物產生，並且增幅產物大小也符合預期，可應用於臨床檢測上。
臨床測試 (B)
經前述驗證SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2可應用臨床檢體之後，遂將SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2與市售的引子對套組進行比較。換言之，在此測試中，實施例為利用本實施方式之SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2進行即時定量聚合酶連鎖反應，而比較例為利用市售的引子對套組進行即時定量聚合酶連鎖反應。如下表5所示，檢體1、檢體2以及檢體3分別來自三個不同的結核病病患，而在Cq值方面，實施例為33.21至34.90，比較例為42.70至45.3。也就是說，利用實施例進行檢測所需的循環數可少於比較例約7.8至12.09個循環。在相同模板量的情形下，實施例的靈敏度明顯優於比較例。
表5
Figure 107137692-A0304-0005
前文概述數個實施例之特徵以使得熟習該項技術者可更好地理解本揭露之態樣。熟習該項技術者應瞭解，可容易地將本揭露內容用作設計或修改用於實現相同目的及/或達成本文引入之實施例的相同優點之其他製程及結構之基礎。熟習該項技術者亦應認識到，此類等效物構造不違背本揭露內容之精神及範疇，且可在不違背本揭露內容之精神及範疇之情況下於此作出各種變化、替代以及變更。
無
請結合附圖閱讀以下詳細描述，將可更容易理解本揭露內容之態樣。但須注意依照本產業的標準做法，各種特徵未按照比例繪製。事實上，各種特徵的尺寸為了清楚的討論而可被任意放大或縮小。 第1圖係根據本發明一些實施方式，顯示IS6110序列的部分片段、引子對及探針設計的位置。 第2圖係根據本發明一些實施方式，測試在不同模板量的情形下，以引子對SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2進行即時定量聚合酶連鎖反應之增幅曲線圖。 第3圖係依據第2圖，顯示其不同模板起始量的標準曲線圖。 第4圖係根據本發明一些實施方式，在模板量為10拷貝數時，以引子對SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2進行即時定量聚合酶連鎖反應之增幅曲線圖。 第5圖係根據本發明一些實施方式，在SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的基礎上而衍生的相似引子對，其進行即時定量聚合酶連鎖反應之增幅曲線圖。 第6圖係根據本發明一些實施方式，以引子對SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2進行檢測之電泳結果圖。
<110> 台達電子工業股份有限公司
<120> 檢測分枝桿菌的方法及其套組
<130> NP-23313-TW
<150> US 62/715,809
<151> 2018-08-08
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引子(forward primer)
<400> 1
Figure 107137692-A0305-02-0020-2
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引子(reverse primer)
<400> 2
Figure 107137692-A0305-02-0020-3
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探針(probe)
<400> 3
Figure 107137692-A0305-02-0020-5
<210> 4
<211> 141
<212> DNA
<213> 結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 4
Figure 107137692-A0305-02-0021-8
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探針(probe)
<400> 5
Figure 107137692-A0305-02-0021-6

Claims (12)

  1. 一種檢測分枝桿菌的方法，包含下列步驟：提供一樣本；提供一引子對，該引子對係選自於由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：1之互補股以及SEQ ID NO：2之互補股所組成的群組；提供一探針，該探針係選自於由SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：3之互補股所組成之群組；利用該引子對、該探針與該樣本進行一聚合酶連鎖反應以獲得一產物；以及分析該產物以偵測分枝桿菌的存在。
  2. 如請求項1所述之檢測分枝桿菌的方法，其中提供該樣本步驟，包含提供一檢體包含結核分枝桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)。
  3. 如請求項2所述之檢測分枝桿菌的方法，其中該檢體為血液、痰液、支氣管肺泡沖洗液、尿液、糞便或其組合。
  4. 如請求項2所述之檢測分枝桿菌的方法，其中利用該引子對、該探針與該樣本進行該聚合酶連鎖反應以獲得該產物步驟，包含進行聚合酶連鎖反應使得該引子對增幅該結核分枝桿菌群中IS6110序列的一部分序列以獲得該產物，其中該部分序列為SEQ ID NO：4。
  5. 如請求項1所述之檢測分枝桿菌的方法，其中利用該引子對、該探針與該樣本進行該聚合酶連鎖反應以獲得該產物步驟，該聚合酶連鎖反應為即時定量聚合酶連鎖反應。
  6. 一種檢測分枝桿菌的套組，包含一引子對與一探針，該引子對係選自於由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：1之互補股以及SEQ ID NO：2之互補股所組成的群組；該探針係選自於由SEQ ID NO：3、及SEQ ID NO：3之互補股所組成之群組。
  7. 如請求項6所述之檢測分枝桿菌的套組，其中該引子對為SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2。
  8. 如請求項6所述之檢測分枝桿菌的套組，其中該探針為SEQ ID NO：3。
  9. 如請求項6所述之檢測分枝桿菌的套組，更包含一檢體，其中該檢體為血液、痰液、支氣管肺泡沖洗液、尿液、糞便或其組合。
  10. 如請求項6所述之檢測分枝桿菌的套組，更包含一目標基因，其中該目標基因為結核分枝桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)的 IS6110序列。
  11. 如請求項6所述之檢測分枝桿菌的套組，更包含一模板，具有約100個鹼基對至約250個鹼基對的長度。
  12. 如請求項11所述之檢測分枝桿菌的套組，其中該模板為SEQ ID NO：4。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113444782A (zh) * 2020-03-26 2021-09-28 台达电子工业股份有限公司 检测非结核分枝杆菌的方法、引物组及其试剂盒
US11965217B2 (en) * 2020-07-21 2024-04-23 Delta Electronics, Inc. Method and kit for detecting Mycobacterium tuberculosis

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080241826A1 (en) * 2004-04-26 2008-10-02 Wako Pure Chemical Probe And Primer For Tubercle Bacillus Detection, And Method Of Detecting Human Tubercle Bacillus Therewith
TW201102436A (en) * 2009-07-07 2011-01-16 Inst Biotechnology And Medicine Industry Probe for identification of mycobacterium tuberculosis and mycobacterium tuberculosis complex and method using the same
CN102471806A (zh) * 2009-08-26 2012-05-23 株式会社Lg生命科学 检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的组合物以及使用该组合物用多重实时pcr同时检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的方法
TW201408779A (zh) * 2012-08-30 2014-03-01 Yeastern Biotech Co Ltd 檢測結核菌的方法及套組

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731150A (en) * 1995-11-01 1998-03-24 Chiron Diagnostic Corporation IS6110 based molecular detection of mycobacterium tuberculosis
JPWO2008075520A1 (ja) * 2006-12-18 2010-04-08 和光純薬工業株式会社 マイコバクテリウム・アビウム検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・アビウムの検出方法
CN100580091C (zh) * 2007-11-06 2010-01-13 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 人与动物共患结核病荧光pcr快速诊断试剂盒
CN101676405A (zh) * 2008-09-19 2010-03-24 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 结核分枝杆菌荧光定量pcr检测方法及其试剂盒
KR101498705B1 (ko) * 2010-07-02 2015-03-06 (주)바이오니아 결핵 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 결핵 진단 방법
CN102373273B (zh) * 2010-08-26 2013-07-03 杭州优思达生物技术有限公司 一种结核分枝杆菌核酸的检测试剂盒
CN101974630A (zh) * 2010-10-28 2011-02-16 复旦大学 一种结核分枝杆菌复合群的荧光定量rt-pcr检测方法
CN102533959A (zh) * 2010-12-30 2012-07-04 华中农业大学 一种鉴别结核分枝杆菌的多重pcr试剂盒
CN102559905A (zh) * 2012-02-02 2012-07-11 广州海力特生物科技有限公司 一组用于结核分枝杆菌实时荧光pcr检测的引物探针及其使用方法
CN102808031B (zh) * 2012-08-24 2013-11-20 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC引物和方法
CN104862406B (zh) * 2015-06-01 2018-02-23 山东省农业科学院奶牛研究中心 一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物与探针及其试剂盒
WO2017077999A1 (ja) * 2015-11-06 2017-05-11 公立大学法人横浜市立大学 結核菌群由来ｄｎａの検出方法
CN106811529A (zh) * 2017-02-27 2017-06-09 苏州百源基因技术有限公司 结核分枝杆菌的荧光定量pcr检测试剂盒及引物、探针

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080241826A1 (en) * 2004-04-26 2008-10-02 Wako Pure Chemical Probe And Primer For Tubercle Bacillus Detection, And Method Of Detecting Human Tubercle Bacillus Therewith
TW201102436A (en) * 2009-07-07 2011-01-16 Inst Biotechnology And Medicine Industry Probe for identification of mycobacterium tuberculosis and mycobacterium tuberculosis complex and method using the same
CN102471806A (zh) * 2009-08-26 2012-05-23 株式会社Lg生命科学 检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的组合物以及使用该组合物用多重实时pcr同时检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的方法
TW201408779A (zh) * 2012-08-30 2014-03-01 Yeastern Biotech Co Ltd 檢測結核菌的方法及套組

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