CN102471806A - 检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的组合物以及使用该组合物用多重实时pcr同时检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的方法 - Google Patents

检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的组合物以及使用该组合物用多重实时pcr同时检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测结核性分枝杆菌(M.tuberculosis)和分枝杆菌属的组合物，其包含：(i)靶向结核性分枝杆菌特异性基因(IS6110)的引物和/或探针；和(ii)靶向分枝杆菌属特异性基因(内部转录间隔区(ITS))的引物和/或探针；和非必需地，(iii)靶向作为内对照的源自植物的基因的引物和/或探针。当使用所述组合物进行实时多重聚合酶链式反应时，可以通过单个反应检测非结核性分枝杆菌和分枝杆菌属，因此可以以高可靠性快速且容易地实现临床诊断。

Description

检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的组合物以及使用该组合物用多重实时PCR同时检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的方法
技术领域
本发明涉及一种可区别地检测结核性分枝杆菌复合群(M.tuberculosiscomplex)和分枝杆菌属(mycobacteria genus)的组合物以及使用该组合物通过实时多重聚合酶链式反应(RT PCR)同时分析结核性分枝杆菌(M.tuberculosis)和分枝杆菌属。更具体而言，本发明涉及一种检测结核性分枝杆菌和分枝杆菌属的组合物，其包含：(i)靶向结核性分枝杆菌特异性基因(IS6110)的引物和/或探针；和(ii)靶向分枝杆菌属特异性基因(内部转录间隔区(ITS))的引物和/或探针；和非必需地，(iii)靶向作为内对照的源自植物的基因的引物和/或探针。
背景技术
结核病是一种在人类历史中呈现出最高死亡率的传染病，其是由0.2～0.5μm厚、1～4μm长且杆状的分枝杆菌属菌株引起的。
分枝杆菌属包括感染人和许多种动物并导致如结核病的呼吸系统疾病和如麻风病的疾病的各种分枝杆菌菌株，并且迄今已知大约100个物种(Shinnick TM等人，Mycobacterial taxonomy.Eur.J.Clin.Microbiol.Infect Dis.1994；13(11)：884-901)。
尽管已知结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)为引起人患结核病的最重要的分枝杆菌，但是有结核分枝杆菌、很少出现的牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)等。已知麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)引起麻风病(Shinnick，T.M.和Good，R.C.Mycobacterial taxonomy.Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.1994；13(11)：884-901)。
在不发达国家中结核病是一种流行的疾病，在韩国，每年遇到120,000例结核分枝杆菌新增病例，2003年报道和计数的新结核病感染为30,687例(相当于每十万人64例)，并且在30个OECD成员国中，韩国的结核病死亡数目耻辱地位居首位(2004年国家统计局(National Statistical Office)的统计数据)。
近来，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者和其他免疫缺陷综合征患者、具有较弱免疫系统的婴儿等正在遭受非结核性分枝杆菌(nontuberculousmycobacteria(NTM))的感染，而且表现出与结核性分枝杆菌感染相关症状相似的临床症状的非典型性结核病患者正在增加。
NTM的实例包括多种非结核性分枝杆菌(non-tuberculosismycobacteria)，如鸟分枝杆菌(mycobacterium avium)(胞内鸟分枝杆菌(M.avium-intracellulare)或鸟分枝杆菌复合群(M.avium complex))、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、戈登氏分枝杆菌(M.gordonae)、斯氏分枝杆菌(M.szulagai)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、日内瓦分枝杆菌(M.genavense)(Barnes，P.F.等人，Tuberculosis in patients with humanimmunodeficiency virus infection.N.Engl.J.Med.1991；324(23)：1644-1650)。
这些NTM中的许多种类表现出对结核性分枝杆菌药物的多药耐药性并且难以治疗(Kam，K.M.等人，Trends in Multidrug-Resistant Mycobacteriumtuberculosis in Relation to Sputum Smear Positivity in Hong Kong，1989-1999.Clin.Infect.Dis.2002；34(3)：324-329)。
已知NTM中最常见的鸟分枝杆菌复合群(MAC)对原发性结核药物表现出比结核性分枝杆菌低10～100倍的效能，并且美国胸科学会(AmericanThoracic Society(ATS))提出了关于由各种非结核性分枝杆菌菌种引起的疾病的诊断和治疗的指导方针(American Thoracic Society，Diagnosis and treatmentof disease caused by nontuberculous mycobacteria.Am J Respir Crit Care Med.1997；156(2)：S1-S25)。
因此，非结核性分枝杆菌具有与结核性分枝杆菌非常相似的症状，但是就治疗药物而言它们可不同于结核性分枝杆菌。为了分别适宜地治疗结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌，需要准确地区分结核性分枝杆菌与非结核性分枝杆菌并且对其早期检测和诊断。
诊断结核病的一般方法包括患者的临床症状测试、结核菌素皮肤反应测试、X射线显像、结核性分枝杆菌测试等。结核菌素测试是最容易的方法，简单易行，但是在由严重的结核病、麻疹和免疫抑制引起的无反应性的情况下常常表现假阴性。大约25％的X射线显像会根据检测者的能力而有所不同，因此使用X射线显像的诊断取决于检测者发现异常阴影的能力和检测者准确地判断该异常阴影的能力。
结核性分枝杆菌检测是最准确的诊断结核病的方法并且包括涂片测试、培养测试、分子诊断测试等。
涂片测试主要使用染色法，其中通过Ziehl-Neelsen染色确定耐酸性。此方法确保简单和快速地获得结果，但是不能区分结核性分枝杆菌与非结核性分枝杆菌，而且具有低灵敏性。
培养测试在一定程度上具有高灵敏性，即，即使在1ml样品中只有大约10个细菌存在也可检出细菌，并且培养测试能够分离和准确诊断结核性分枝杆菌。此方法需要长的时间周期，例如，受过良好训练的研究人员进行培养和观察需要4～8周，因此对于治疗是不利、不适合的。
BACTEC(Becton Dickinson，US)是一种新开发的培养方法，其中将杆菌接种到含有C14棕榈酸盐的液体培养基中，并且从使用放射性同位素计算的生长商数估计杆菌代谢产生的14CO2的量。此方法平均起来能够在16天之后获得结果，但是不利地是需要设备和专业人员来处理放射性同位素。
聚合酶链式反应(PCR)接着电泳是一种在2～3小时内通过扩增特异性基因位点而快速和准确地确定结核性分枝杆菌存在的方法。此方法能够在一天内以95％以上的灵敏性和特异性从临床样品中检测结核性分枝杆菌，因此是有用的(Wilson，S.M.等人，Progress toward a simplified polymerase chainreaction and its application to diagnosis of tuberculosis.J.Clin.Microbiol.1993；31(4)：776-78)。
然而，此方法的不利之处在于，具有携带污染的高风险并且需要专业人员(Noordhoek，G.T.等人，Sensitivity and specificity of PCR for detection ofMycobacterium tuberculosis：a blind comparison study among seven laboratories.J.Clin.Microbiol.1994；32(2)：277-284)。
同时，在结核病诊断中，PCR测试在涂片阳性样品中具有相当高的灵敏性和特异性，并且应当考虑，耐酸细菌涂片阳性和PCR阴性样品可被认为是被NTM感染的事实。
NTM肺病高发的美国建议，当确定是否存在PCR抑制剂以及被试者再次测试为阴性时，耐酸细菌涂片阳性和PCR阳性被试者暂时地诊断为结核病，耐酸细菌涂片阳性和PCR阴性被试者暂时地诊断为NTM。完成最终的NTM感染诊断花费4～8周的培养时间(疾病控制和预防中心(Centers forDisease Control and Prevention(CDC)).Update：Nucleic acid amplification testsfor tuberculosis.MMWR Morb.Mortal.Wkly.Rep.2000；49：593-4)。近来，可以根据这些指导方针检测NTM感染，但是，如可能，NTM的直接检测将在临床上更有用。
在韩国，结核病的发病率高而NTM疾病低发。因此，一般认为耐酸细菌涂片阳性被试者是感染了结核病，并且通常进行抗结核病药物治疗。然而，近来，在韩国，NTM和NTM疾病的识别率提高了，NTM可以在免疫功能弱的那些人中引起疾病，不易诊断，由于高耐药性比例而难以治疗，并且具有高复发率(Scientific committee in Korean academy of tuberculosis andrespiratory disease.National survey of mycobacterial diseases other thantuberculosis in Korea.Tuberc.Respir.Dis.1995；42：277-94.)。因此，日益需要可区别地诊断NTM的方法。
最近的检测NTM的方法包括AFB染色，通常用于使用分子生物学方法(包括使用限制性内切酶的PCR-RFLP和使用特异性探针的PCR杂交)区分分枝杆菌种类的方法。
所有这些方法的灵敏性都低，并且不利地需要在先培养或者牵涉复杂的实验步骤，因此不适合用于早期快速检测结核性分枝杆菌和分枝杆菌属。
发明内容
技术问题
因此，本发明致力于解决上述问题和其他的仍然有待解决的技术问题。
本发明的一个目的是提供一种对IS6110(结核性分枝杆菌特异性基因位点)具有优异的灵敏性的引物和/或探针，从而准确地诊断结核性分枝杆菌。
本发明的另一个目的是提供一种检测在分枝杆菌属中普遍存在的ITS基因的高度特异性基因位点并因此具有优异的灵敏性的引物和/或探针，从而确定分枝杆菌属(非结核性分枝杆菌)的存在。
本发明的又一个目的是提供一种使用所述引物和/或探针通过实时多重聚合酶链式反应同时检测结核性分枝杆菌复合群和非结核性分枝杆菌的方法。
技术方案
1.检测结核性分枝杆菌或分枝杆菌属的引物
本发明涉及一种可区别地检测结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的组合物，其包含：含有Seq.No.1碱基序列和Seq.No.2碱基序列中的一种或多种的引物；和含有Seq.No.3碱基序列～Seq.No.11碱基序列中的一种或多种的引物。
优选地，本发明涉及一种可区别地检测结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的组合物，其包含：含有Seq.No.1碱基序列的引物和含有Seq.No.2碱基序列的引物；或者含有Seq.No.3碱基序列～Seq.No.9碱基序列中的一种或两种或更多种的引物和含有Seq.No.10碱基序列～Seq.No.11碱基序列中的一种或两种或更多种的引物两者。
更优选地，本发明涉及一种可区别地检测结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的组合物，其包含：含有Seq.No.1碱基序列的引物；含有Seq.No.3碱基序列～Seq.No.9碱基序列中的一种或两种或更多种的引物；和含有Seq.No.10碱基序列～Seq.No.11碱基序列中的一种或两种或更多种的引物。
本文所用术语“含有Seq.No.x碱基序列的引物”包括具有95％以上的序列相同性的碱基序列。例如，在引物是20bp的情况下，当20bp中的2或更多bp不同的情况下，解链温度的下降5度以上，因此得到不好的结果，而在其只有1bp不同的情况下，当PCR过程中在稍微下降的退火温度下进行试验时，可以得到同一结果。
在本说明书中，以下，为了更好地说明，“含有Seq.No.x碱基序列的引物”将简称为“Seq.No.x引物”。
在本说明书中，Seq.No.1引物和Seq.No.2引物是靶向IS6110基因位点(结核性分枝杆菌复合群特异性基因位点)的引物。
通常，“结核性分枝杆菌”狭义地指结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)。本发明中，“结核性分枝杆菌”广义地指结核分枝杆菌以及牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌(mycobacterium microti)和非洲分枝杆菌(mycobacterium africanum)。在一些情况下，将其称为“结核性分枝杆菌复合群”或“TB复合群”。
IS6110基因是在结核性分枝杆菌复合群(如结核分枝杆菌和牛分枝杆菌)中发现的插入序列。已知结核性分枝杆菌复合群包含10～12个拷贝的IS6110(IS6110广泛用于结核病的PCR诊断)(Thierry D.等人，J.Clin.Microbiol.1990；28(12)：2668-2673)。然而，据Kent等人报道，取决于引物位置的选择，IS6110表现出不同的假阳性风险比率(J.Clin.Microbiol.1995；33(9)：2290-2293)。
因此，本发明的发明人通过碱基序列分析研究了具有低假阳性风险的位点。结果，从下列实施例中可以看出，Seq.No.1引物和Seq.No.2引物是只扩增结核性分枝杆菌复合群的IS6110基因并且在结核性分枝杆菌复合群的IS6110基因位点中表现出97％以上的相当高的灵敏性和99％以上的阳性预测率(这说明假阳性的风险非常低)的引物碱基序列。这样表现出高灵敏性和阳性预测率的引物迄今还未发现过。
因此，当使用Seq.No.1引物、Seq.No.2引物或其组合时，可以高度可靠地检测结核性分枝杆菌复合群。
为了确定非结核性分枝杆菌的存在与否，分枝杆菌的识别是重要的。关于这一点，在分枝杆菌属中rpoB基因是共有的，因此众所周知，rpoB的存在可以用于识别分枝杆菌物种(Lee，Hye-Young，等人，韩国专利公开No.10-2001-0038701)。
然而，该专利使用PCR-RFLP，因此问题在于，例如，由于低灵敏性而必需进行在先培养并且实验步骤复杂，因此不适合用于早期快速检测结核性分枝杆菌复合群和分枝杆菌属。
因此，为了解决这些问题，本发明人开发了一种新的特异性针对rpoB基因位点的引物，该引物形成适合用于实时PCR的100bp以下的PCR扩增产物(Kang Jin Seok等人，韩国专利申请No.2008-0090156)。
然而，rpoB是编码RNA聚合酶β亚单位的基因，并且从该申请的特异性测试结果可以看出，许多种微生物都没有表现出阳性，但是表现出与结核病相似的肺炎症状的诺卡氏菌属(Nocardia genus)微生物和与分枝杆菌属相似的红球菌属(rhodococcus genus)表现出阳性，这是由于在一些微生物中存在执行共同功能的相似碱基序列。
同时，为了确定非结核性分枝杆菌的存在，分枝杆菌属的识别是重要的。众所周知，ITS基因以及rpoB基因包含在分枝杆菌属中，因此用于识别细菌种类(Kim In Soo等人，韩国专利No.0725579)。
然而，该专利使用的引物为了用于PCR反向杂交而形成大小为约250～450bp的PCR产物，因此不利地不适合用于快速检测的实时PCR。
因此，本发明人开发了形成大小适合用于ITS位点的实时PCR的扩增产物的引物。也就是说，Seq.No.3～11引物是靶向ITS基因位点(分枝杆菌属特异性基因位点)的引物。这些引物形成大小为100bp以下的PCR扩增产物。因此，这些引物有利地确保分枝杆菌属被相当可靠地且快速地检测并表现出比以往更高的特异性，这是因为它们不会与诺卡氏菌属微生物和红球菌属微生物反应。
根据本发明的检测结核性分枝杆菌或分枝杆菌属的组合物可以进一步有选择地包含内对照引物。该内对照用于确定是否发生了假阴性问题，也就是说，PCR反应正常进行。无论样本中是否存在结核性分枝杆菌或分枝杆菌，可以随机地选择正常表达的基因。
在优选的实施方式中，所述内对照引物可为加入到所有样本中的源自植物的基因特异性引物。
该源自植物的基因优选为凝集素，并且凝集素基因特异性引物可为含有Seq.No.15碱基序列的引物或者含有Seq.No.16碱基序列的引物。
在本发明中，在下表1中给出Seq.No.1～11引物、Seq.No.15引物和Seq.No.16引物的碱基序列。
[表1]引物的碱基序列
Figure BDA0000135643270000091
上述序列中，“R”和“Y”分别为组合的碱基序列并且显示“R＝A+G”和“Y＝C+T”。
如上所述，本发明提供了一种检测结核性分枝杆菌的组合物，其包含含有Seq.No.1碱基序列的正义引物和含有Seq.No.2碱基序列的反义引物中的一种或两种或更多种，作为特异性针对结核性分枝杆菌IS6110基因的新引物。
另外，本发明提供了一种检测分枝杆菌属的组合物，其包含：含有Seq.No.3碱基序列～Seq.No.9碱基序列的正义引物中的一种或两种或更多种；含有Seq.No.10碱基序列～Seq.No.11碱基序列的反义引物中的一种或两种或更多种；或其组合，作为特异性针对分枝杆菌ITS基因的引物。
该特异性针对分枝杆菌属ITS基因的引物形成适合用于实时PCR的长度为100bp以下的PCR扩增产物。
在优选的实施方式中，所述分枝杆菌可为结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。通过分析结核性分枝杆菌复合群IS6110基因与ITS基因，可以进一步提高结核性分枝杆菌的检测可靠性。
在优选的实施方式中，所述分枝杆菌可为非结核性分枝杆菌(NTM)。在这种情况下，通过ITS基因的碱基序列分析，可以有利地确定非结核性分枝杆菌而不是结核性分枝杆菌复合群的存在和类型。
另外，本发明人证实了含有Seq.No.3碱基序列～Seq.No.11碱基序列的引物有效地识别了下列42种分枝杆菌并且具有高特异性。
Figure BDA0000135643270000101
Figure BDA0000135643270000111
2.检测结核性分枝杆菌或分枝杆菌属的探针
另一个方面，本发明提供了一种检测结核性分枝杆菌或分枝杆菌属的组合物，其包含选自含有Seq.No.12碱基序列的探针、含有Seq.No.13碱基序列的探针和含有Seq.No.14碱基序列的探针中的一种或两种或更多种。
所述组合物可以非必需地进一步包含内对照探针，以及所述内对照探针优选为特异性针对源自植物的基因(凝集素)的探针，并且含有Seq.No.17碱基序列。
在本发明中，术语“含有Seq.No.x碱基序列的探针”包括具有95％以上的序列相同性的碱基序列。在本说明书中，以下，为了更好地说明，“含有Seq.No.x碱基序列的探针”将简称为“Seq.No.x探针”。
Seq.No.12探针特异性地与IS6110基因位点反应，并且Seq.No.13探针和Seq.No.14探针是通常与可检测的所有分枝杆菌属的ITS基因反应的探针。
同样地，通过特异性针对IS6110和ITS基因的探针，可以更加准确地检测样本中分枝杆菌是否是结核性分枝杆菌，而且可以通过确定ITS基因的存在来确定分枝杆菌的存在。
特别地，根据本发明的特异性针对IS6110或ITS基因的探针有效地用于使用taqman测定或分子指示标测定(molecular beacon assay)的定量PCR测定法。
因此，在优选的实施方式中，所述探针用荧光物质在其5’和3’末端标记，并且在5’末端标记的荧光物质(报道分子)和在3’末端标记的荧光物质(猝灭物)可以相互干扰。因此，当探针与样本中存在的IS6110或ITS基因结合时，探针的显色受限，而当进行聚合酶链式反应时，所述探针被分解并且在其5’末端标记的荧光物质被猝灭，而在3’末端上标记的荧光物质发生显色。
在所述探针的5’末端标记的荧光物质没有特别限制，并且，例如，所述荧光物质可以选自6-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、四氯-6-羧基荧光素和花青-5(Cy5)中，并且不限于此。
另外，在3’末端标记的荧光物质可为6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)或黑洞猝灭剂-1，2，3(BHQ-1，2，3)，但是不限于此。
在本发明中，在下表2中给出Seq.No.12～Seq.No.14探针和Seq.No.17探针的碱基序列。
[表2]探针的碱基序列
Figure BDA0000135643270000121
3.用于实时PCR测定的组合物和试剂盒
本发明提供了一种使用实时PCR测定区分、检测和分析结核性分枝杆菌和分枝杆菌属的组合物，其包含：含有Seq.No.1碱基序列和Seq.No.2碱基序列中的一种或两种或更多种的引物；含有Seq.No.3碱基序列～Seq.No.11碱基序列中的一种或两种或更多种的引物；和含有Seq.No.12碱基序列～Seq.No.14碱基序列中的一种或两种或更多种的探针。
所述组合物可以进一步包含内对照引物和内对照探针以防止假阴性。
所述内对照引物可为含有Seq.No.15碱基序列的正义引物或者含有Seq.No.16碱基序列的反义引物，并且所述内对照探针可为含有Seq.No.17碱基序列的探针。
也就是说，根据本发明的用于定量分析的组合物包含：用于检测结核性分枝杆菌或非结核性分枝杆菌的引物，或者用于检测非结核性分枝杆菌的探针，以及非必需地内对照引物和探针。
使用根据本发明的组合物可以进行实时PCR测定，在实时PCR测定中，在单管中将两种或三种基因连同从临床样本中提取的DNA一起扩增并且将所得产物实时分析和检测。
在优选的实施方式中，所述组合物包含：
(i)特异性针对结核性分枝杆菌IS6110基因的引物和探针混合物，其包含：含有Seq.No.1碱基序列的正义引物和含有Seq.No.2碱基序列的反义引物；以及含有Seq.No.12碱基序列的探针；
(ii)特异性针对分枝杆菌属ITS基因的引物和探针混合物，其包含：含有Seq.No.3碱基序列～Seq.No.9碱基序列的正义引物和含有Seq.No.10碱基序列～Seq.No.11碱基序列的反义引物；以及含有Seq.No.13碱基序列的探针和/或含有Seq.No.14碱基序列的探针；
(iii)特异性针对内对照基因的引物和探针混合物，其包含：含有Seq.No.15碱基序列的正义引物和含有Seq.No.16碱基序列的反义引物；以及含有Seq.No.17碱基序列的探针；和
(iv)PCR反应混合物，其包含缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和无菌蒸馏水。
用于分析的组合物包含引物组和三个探针组。本发明的发明人使用所述组合物进行实时多重PCR。结果，发明人证实了可以在基本上完全排除假阳性风险的情况下检测和诊断样品中的结核性分枝杆菌和分枝杆菌属。
具体地，所述混合物(i)能够只扩增结核性分枝杆菌复合群，并且包含表现出对IS6110基因位点的97％以上的相当高的灵敏性以及对其的阳性预测率99％以上的引物，和与使用所述引物扩增的IS6110基因位点特异性结合的探针。
所述混合物(ii)能够扩增分枝杆菌属特异性基因，ITS基因，并且包含形成具有适合于使用实时PCR分析的长度的ITS基因位点的引物，和与使用所述引物扩增的ITS基因位点特异性连接的探针。
此时，所述探针与可检测的所有分枝杆菌属的ITS基因结合，因此，可以通过该结合确定分枝杆菌的存在。
如必要，所述组合物可以进一步包含一种或多种包含从不同种分枝杆菌中提取的具有不同碱基序列的ITS基因位点的探针。在这种情况下，可以确定各种分枝杆菌的种类。
因此，当使用包含所述组合物的分析试剂盒时，可以以简单和准确的方式定量分析结核病的特异性基因，可以确定非结核性分枝杆菌的存在，因此所述分析试剂盒可以广泛地用于结核病的准确诊断。在一些情况下，分别分析各混合物并且可以作为组合进行判断。
可以使用市售的实时PCR仪器进行这种实时PCR测定，并且实时PCR仪器的实例包括，但不限于，SLAN实时PCR检测系统(株式会社LG生命科学，韩国)、LightCyclerTM(罗氏，德国)、ABI PRISMTM 7000/7700(AppliedBiosystems，美国)、iCyclerTM(Bio-Rad，美国)、Rotor-GeneTM(Corbett，澳大利亚)、OpticonTM(PharmaTech，美国)等。
4.分析结核性分枝杆菌或分枝杆菌属的方法
根据本发明的用于分析的组合物可以用于定性分析以确定结核性分枝杆菌或分枝杆菌属的存在以及用于其定量分析。也就是说，本发明提供了一种使用所述用于分析的组合物定量或定性分析结核性分枝杆菌或非结核性分枝杆菌的方法。
通过使用所述用于分析的组合物进行实时PCR以及确定观察峰的点，可以进行确定结核性分枝杆菌或分枝杆菌属的存在的定性分析。
另外，通过与标准曲线做比较，可以进行定量分析。在优选的实施方式中，使用所述用于分析的组合物，通过下列步骤，可以进行定量分析：
(1)将用于分析的组合物与从样本中提取的细菌DNA混合以制备用于基因分析的样本；
(2)使所述用于基因分析的样本进行实时PCR以得到PCR产物；
(3)定量PCR产物以得到定量曲线；和
(4)使用所述定量曲线定量在所述从样本中提取的细菌DNA中存在的IS6110特异性基因、ITS特异性基因和内对照特异性基因。
也就是说，当将从样本中提取的细菌DNA加入到所述用于定量分析的组合物(包含引物组和三个探针组，即，特异性针对结核性分枝杆菌基因IS6110的引物对和探针、特异性针对分枝杆菌属ITS基因的引物对和探针以及特异性针对内对照基因(如凝集素基因)的引物对和探针)中并且进行实时PCR时，特异性针对IS6110基因、ITS基因和内对照基因(如凝集素基因)的各个引物对和探针与DNA结合并且扩增PCR产物。
在使用taqman分析作为分析PCR产物的方法时，可以通过利用与IS6110、ITS和凝集素基因结合的探针被分解和发光的现象确定基因扩增来分析IS6110特异性基因、ITS特异性基因和内对照特异性基因。
有益效果
由前述描述可以显而易见的是，与常规方法相比，当使用根据本发明的用于分析的组合物进行实时PCR时，可以实现在短时间内以高灵敏性和特异性检测结核性分枝杆菌和分枝杆菌属。
附图说明
结合附图，从下列详细描述的说明中将更加清楚地理解本发明的以上和其他目的、特点和其他优点，其中：
图1为显示使用根据本发明的用于分析的组合物的结核性分枝杆菌复合群阳性样本的实时多重PCR结果的图；
图2为显示使用根据本发明的用于分析的组合物的分枝杆菌属阳性样本的实时多重PCR结果的图；以及
图3为显示使用根据本发明的用于分析的组合物的阴性样本的实时多重PCR结果的图。
具体实施方式
现将参照下列实施例更加详细地说明本发明。这些实施例不应理解为对本发明的范围和实质的限制。
实施例1：引物和探针的产生
通过使用日立软件工程有限公司(Hitachi Software Engineering Co.，Ltd.)制造的DNAsis分析存放于NCBI(国立卫生研究院(National institutes of Health(NIH))附属组织)管理的GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中的登录号NC000962下的碱基序列、确定碱基序列以及使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析碱基序列，证实了用于本发明的IS6110特异性引物和探针是可只扩增结核性分枝杆菌复合群的引物碱基序列的事实。
另外，通过从Genebank Entrez中获得分枝杆菌ITS基因、使用群X(clustalX)分析保守位点、确定碱基序列和使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析碱基序列，证实了用于本发明的ITS特异性引物和探针是可只扩增分枝杆菌属的引物碱基序列。
从本领域公布的专利中获得源自植物的基因特异性引物和探针的碱基序列。
实施例2：引物的合成
使用如在第3版分子克隆(Sambrook和Rusell，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，USA，2001)10.42段中描述的“寡核苷酸合成”的方法由Metabion公司(德国)合成实施例1中分析的引物。
实施例3：从临床样品或标准菌株培养基中分离分枝杆菌DNA
将1～2ml的疑似结核病患者的痰或标准菌株培养基和1～2ml 4NNaOH置于15ml管中，接着充分搅拌并且以4,000rpm离心20分钟。移除上清液并且将10ml PBS缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4)加入到所得沉淀物中，接着充分搅拌并且以4,000rpm离心20分钟。丢弃上清液并且将所得沉淀物转移到1.5ml管中并向其中加入1mlPBS缓冲液，接着搅拌并且以13,000rpm离心5分钟。再次丢弃上清液并且将50-100ui的5％(w/v)Chelex 100树脂(Bio-Rad公司)加入到所得沉淀物中，将混合物在100℃加热20分钟并且以13,000rpm离心3分钟，并且将分离的DNA上清液用作PCR用的模板DNA。
实施例4：使用引物和探针的实时多重PCR反应分析
根据在下表3中显示的PCR反应组合物配方制备PCR反应组合物，并且在下表4中显示的反应条件下在SLAN实时PCR检测系统(株式会社LG生命科学，韩国)中进行PCR反应。
实时测量反应产物并且在反应完成后使用SLAN 7.0程序分析结果。
确定如下：图1：结核性分枝杆菌复合群阳性，图2：分枝杆菌属阳性，以及图3：阴性。
[表3]实时多重PCR反应组合物配方
Figure BDA0000135643270000181
Figure BDA0000135643270000191
[表4]实时PCR反应条件
  温度/时间   重复数
  50℃/2min   1
  95℃/10min   1
  95℃/10sec，62℃/40sec   35
实施例6：使用常规培养方法(MGIT，BD公司，美国)和本发明的试剂盒的结 核性分枝杆菌和分枝杆菌属的诊断效果的比较试验
比较常规培养方法(MGIT，BD公司，美国)和本发明的试剂盒之间的结核性分枝杆菌和分枝杆菌属的诊断效果。
按照制造商的技术说明书进行用于比较的培养方法并且使用amplicorMTB试剂盒(罗氏诊断，美国)和碱基序列分析确定培养的阳性样品的种类。结果示于表5中。
[表5]试验结果比较
(1)结果表
Figure BDA0000135643270000201
*TB：结核性分枝杆菌复合群/NTM：非结核性分枝杆菌
(2)灵敏性和特异性
Figure BDA0000135643270000202
本文所用术语“灵敏性”指的是测试结果是阳性的患病的人的比例，即，遭受疾病的人被判断患有疾病的比例。本文所用术语“特异性”指的是健康的人被检测为阴性的比例，即，正常的人被判断为正常的比例。术语“阳性预测率”指的是通过诊断方法被认为是阳性的人患有相应的疾病的概率。术语“阴性预测率”指的是通过诊断方法被检测为阳性的人没有患有相应的疾病的概率。
根据上表5的结果，当使用根据本发明的组合物进行RT-PCR时，可以清楚地证实的是，与目前测定结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的具有最高可靠性的培养方法相比，得到了基本上旗鼓相当的可靠性。特别是，对结核性分枝杆菌的灵敏性为97％以上并且特异性为99％，这说明结核性分枝杆菌可被准确地识别。
实施例7：表现出与结核病相似的肺炎症状的诺卡氏菌属微生物和与分 枝杆菌属相似的红球菌属微生物之间的诊断效果的比较试验
关于可表现出与结核病相似的症状的诺卡氏菌属微生物和红球菌属微生物，将使用根据韩国专利申请No.2008-0090156的试剂盒得到的结果与使用根据本发明的试剂盒通过RT-PCR得到的结果做比较，并且上述结果示于表6中。
[表6]
<韩国专利申请No.2008-0090156的试验结果>
  种名   TB   分枝杆菌属   IC   结果
  红球菌(Rhodococcus sp.)   无Ct   28.68   27.1   阳性
  诺卡氏菌(Nocardia sp.)   无Ct   20.18   27.05   阳性
  星状诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)   无Ct   21.24   27.01   阳性
  马红球菌(Rhodococcus equi)   无Ct   23.29   27.17   阳性
  豚鼠耳炎诺卡氏菌(Nocardia otitidiscaviarμm)   无Ct   20.8   27.04   阳性
  皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)   无Ct   19.08   27.08   阳性
  赤红球菌(Rhodococcus ruber)   无Ct   无Ct   27.3   阴性
  新星诺卡氏菌(Nocardia nova)   无Ct   19.06   27.82   阳性
  紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)   无Ct   32.24   27.13   阳性
  Rhodococcus baikonurensis   无Ct   无Ct   27   阴性
  红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)   无Ct   无Ct   27.28   阴性
  嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)   无Ct   32.48   27.18   阳性
  佐氏红球菌(Rhodococcus zopfii)   无Ct   37.19   27.13   阴性
<本发明的试验结果>
  种名   TB   分枝杆菌属   IC   结果
  红球菌(Rhodococcus sp.)   无Ct   无Ct   26.39   阴性
  诺卡氏菌(Nocardia sp.)   无Ct   无Ct   26.5   阴性
  星状诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)   无Ct   无Ct   26.37   阴性
  马红球菌(Rhodococcus equi)   无Ct   无Ct   26.37   阴性
  豚鼠耳炎诺卡氏菌(Nocardia otitidiscaviarμM)   无Ct   无Ct   26.33   阴性
  皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)   无Ct   无Ct   26.21   阴性
  赤红球菌(Rhodococcus ruber)   无Ct   无Ct   26.41   阴性
  新星诺卡氏菌(Nocardia nova)   无Ct   无Ct   26.33   阴性
  紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)   无Ct   无Ct   26.31   阴性
  Rhodococcus baikonurensis   无Ct   无Ct   26.27   阴性
  红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)   无Ct   无Ct   26.34   阴性
  嗜吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)   无Ct   无Ct   26.24   阴性
  佐氏红球菌(Rhodococcus zopfii)   无Ct   无Ct   26.23   阴性
从表6中可以看出，本发明完全排除了常规的专利组合物伴随的假阳性概率。
从上述结果可以看出，与相关领域中的专利相比，通过使用本发明的组合物可以以相当高特异性地检测NTM。
实施例8：本发明对各种分枝杆菌的RT-PCR结果
将42种分枝杆菌按照实施例3和4的方法进行RT-PCR，并且结果示于下表7中。
[表7]
Figure BDA0000135643270000231
Figure BDA0000135643270000241
(表7中，当分枝杆菌的值低于35时，分枝杆菌被确定为“阳性”以及IC表示内对照。另外，Ct是阈值循环，表示作为RT-PCR的结果经过临界值的循环数，以及无Ct表示没有阈值循环。)
从表7中可以看出，作为根据本发明的RT-PCR的结果，属于结核性分枝杆菌复合群的结核分枝杆菌H37Rv(M.Tuberculosis H37Rv)、牛分枝杆菌(M.bovis)、牛分枝杆菌BCG(M.bovis BCG)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)都测试为结核性分枝杆菌阳性，而余下的分枝杆菌测试为分枝杆菌阳性。因此，使用根据本发明的分析组合物的RT-PCR可用于检测结核性分枝杆菌和分枝杆菌属。
尽管已经出于说明的目的公开了本发明的优选实施方式，但是本领域技术人员将理解的是，在没有偏离如所附权利要求中所公开的本发明的范围和实质的情况下，可以进行各种修改、添加或置换。
Figure IDA0000135643320000011
Figure IDA0000135643320000021
Figure IDA0000135643320000041

Claims (20)

1.一种可区别地检测结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的组合物，其包含：
含有Seq.No.1碱基序列和Seq.No.2碱基序列中的一种或多种的引物；和
含有Seq.No.3碱基序列～Seq.No.11碱基序列中的一种或多种的引物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含：含有Seq.No.1碱基序列的引物；和含有Seq.No.2碱基序列的引物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含：含有Seq.No.3碱基序列～Seq.No.9碱基序列中的一种或两种或更多种的引物；和含有Seq.No.10碱基序列～Seq.No.11碱基序列中的一种或两种或更多种的引物。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含：
含有Seq.No.1碱基序列的引物；
含有Seq.No.2碱基序列的引物；
含有Seq.No.3碱基序列～Seq.No.9碱基序列中的一种或两种或更多种的引物；和
含有Seq.No.10碱基序列～Seq.No.11碱基序列中的一种或两种或更多种的引物。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其进一步包含内对照引物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述内对照引物是源自植物的基因特异性引物。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述源自植物的基因是凝集素，并且所述源自植物的基因特异性引物包括含有Seq.No.15碱基序列的引物和含有Seq.No.16碱基序列的引物中的一种或两种或更多种。
8.一种检测结核性分枝杆菌(M.tuberculosis)的组合物，其包含：含有Seq.No.1碱基序列的正义引物和含有Seq.No.2碱基序列的反义引物中的一种或两种或更多种，作为特异性针对结核性分枝杆菌的IS6110基因的引物。
9.一种检测分枝杆菌属的组合物，其包含：含有Seq.No.3碱基序列～Seq.No.9碱基序列的正义引物中的一种或两种或更多种；含有Seq.No.10碱基序列～Seq.No.11碱基序列的反义引物中的一种或两种或更多种引物；或其组合，作为特异性针对分枝杆菌属ITS基因的引物。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述特异性针对分枝杆菌属ITS基因的引物形成长度为100bp以下的PCR扩增产物。
11.一种检测结核性分枝杆菌或分枝杆菌属的组合物，其包含选自含有Seq.No.12碱基序列的探针、含有Seq.No.13碱基序列的探针和含有Seq.No.14碱基序列的探针中的一种或两种或更多种。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述探针用荧光物质在其5’末端和3’末端标记，并且在5’末端标记的荧光物质(报道分子)和在3’末端标记的荧光物质(猝灭物)相互干扰。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述在5’末端标记的荧光物质选自6-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、四氯-6-羧基荧光素和花青-5(Cy5)中，而所述在3’末端标记的荧光物质为6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)或黑洞猝灭剂-1，2，3(BHQ-1，2，3)。
14.一种使用实时PCR测定区分、检测和分析结核性分枝杆菌和分枝杆菌属的组合物，其包含：
含有Seq.No.1碱基序列和Seq.No.2碱基序列中的一种或两种或更多种的引物；
含有Seq.No.3碱基序列～Seq.No.11碱基序列中的一种或两种或更多种的引物；和
含有Seq.No.12碱基序列～Seq.No.14碱基序列中的一种或两种或更多种的探针。
15.根据权利要求14所述的组合物，其进一步包含：
内对照引物；和
内对照探针。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中，所述内对照引物为含有Seq.No.15碱基序列的正义引物或者含有Seq.No.16碱基序列的反义引物，并且所述内对照探针为含有Seq.No.17碱基序列的探针。
17.根据权利要求14所述的组合物，其中，所述组合物包含：
(i)特异性针对结核性分枝杆菌IS6110基因的引物和探针混合物，其包含：含有Seq.No.1碱基序列的正义引物和含有Seq.No.2碱基序列的反义引物；以及含有Seq.No.12碱基序列的探针；
(ii)特异性针对分枝杆菌属ITS基因的引物和探针混合物，其包含：含有Seq.No.3碱基序列～Seq.No.9碱基序列的正义引物和含有Seq.No.10碱基序列～Seq.No.11碱基序列的反义引物；以及含有Seq.No.13碱基序列的探针和/或含有Seq.No.14碱基序列的探针；
(iii)特异性针对内对照基因的引物和探针混合物，其包含：含有Seq.No.15碱基序列的正义引物和含有Seq.No.16碱基序列的反义引物；以及含有Seq.No.17碱基序列的探针；和
(iv)PCR反应混合物，其包含缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和无菌蒸馏水。
18.一种结核性分枝杆菌分析试剂盒，其包含根据权利要求17所述的用于分析的组合物。
19.一种使用根据权利要求17所述的组合物分析结核性分枝杆菌或分枝杆菌属的方法，其包括：
(1)将用于分析的组合物与从样本中提取的细菌DNA混合以制备用于基因分析的样本；
(2)使所述用于基因分析的样本进行实时PCR以得到PCR产物；
(3)定量PCR产物以得到定量曲线；和
(4)使用所述定量曲线定量在所述从样本中提取的细菌DNA中存在的IS6110特异性基因、ITS特异性基因和内对照特异性基因。
20.一种ITS基因特异性引物，其包含Seq.No.3碱基序列～Seq.No.11碱基序列中的一种。
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