JP5783383B2 - M.ツベルクローシス(m.tuberculosis)群、およびマイコバクテリア(mycobacteria)属を検出するための組成物と、同組成物を用いたマルチプレックスリアルタイムpcrによりm.ツベルクローシス(m.tuberculosis)群、およびマイコバクテリア(mycobacteria)属を同時に検出する方法 - Google Patents
M.ツベルクローシス(m.tuberculosis)群、およびマイコバクテリア(mycobacteria)属を検出するための組成物と、同組成物を用いたマルチプレックスリアルタイムpcrによりm.ツベルクローシス(m.tuberculosis)群、およびマイコバクテリア(mycobacteria)属を同時に検出する方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、結核性マイコバクテリア(tuberculosis mycobacteria)、および非結核性マイコバクテリア(mycobacteria)を識別可能に検出するための組成物であって、配列番号1の塩基配列、および配列番号2の塩基配列の1つまたは複数を含むプライマー;並びに配列番号3〜11の塩基配列の1つまたは複数を含むプライマーを含む、組成物に関する。
別の態様では、本発明は、M.ツベルクローシス(M.tuberculosis)またはマイコバクテリア(mycobacteria)属を検出するための組成物であって、配列番号12の塩基配列を含むプローブ;配列番号13の塩基配列を含むプローブ;および配列番号14の塩基配列を含むプローブからなる群から選択される1つまたは2つ以上を含む、組成物を提供する。
本発明は、リアルタイムPCRアッセイを用いてM.ツベルクローシス(M.tuberculosis)およびマイコバクテリア(mycobacteria)属の識別、検出および解析を行うための組成物であって、配列番号1の塩基配列および配列番号2の塩基配列の1つまたは2つ以上を含むプライマー;配列番号3〜11の塩基配列の1つまたは2つ以上を含むプライマー;並びに配列番号12〜14の塩基配列の1つまたは2つ以上を含むプローブを含む、組成物を提供する。
(i)配列番号1の塩基配列を含むセンスプライマーおよび配列番号2の塩基配列を含むアンチセンスプライマー;並びに配列番号12の塩基配列を含むプローブを含む、M.ツベルクローシス(M.tuberculosis)のIS6110遺伝子に特異的なプライマーとプローブとの混合物;
(ii)配列番号3〜9の塩基配列を含むセンスプライマーおよび配列番号10〜11の塩基配列を含むアンチセンスプライマー;並びに配列番号13の塩基配列を含むプローブおよび/または配列番号14の塩基配列を含むプローブを含む、マイコバクテリア(mycobacteria)属のITS遺伝子に特異的なプライマーとプローブとの混合物;
(iii)配列番号15の塩基配列を含むセンスプライマーおよび配列番号16の塩基配列を含むアンチセンスプライマー;並びに配列番号17の塩基配列を含むプローブを含む、内部対照遺伝子に特異的なプライマーとプローブとの混合物;並びに
(iv)緩衝液、DNAポリメラーゼ、dNTPおよび滅菌蒸留水を含む、PCR反応混合物
を含む。
解析のための本発明による組成物は、M.ツベルクローシス(M.tuberculosis)またはマイコバクテリア属(mycobacteria genus)の存在を確認する定性解析に使用しても、その定量解析に使用してもよい。即ち、本発明は、解析用組成物を用いてM.ツベルクローシス(M.tuberculosis)若しくは非結核性マイコバクテリア(nontuberculosis mycobacteria)を定量解析または定性解析する方法を提供する。
(1)サンプルから抽出された細菌のDNAと解析用組成物を混合して遺伝子解析用のサンプルを調製するステップ;
(2)遺伝子解析用のサンプルをリアルタイムPCRに供してPCR産物を得るステップ;
(3)PCR産物を定量して定量曲線を得るステップ;並びに
(4)サンプルから抽出された細菌のDNAに存在するIS6110特異的遺伝子、ITS特異的遺伝子および内部対照特異的遺伝子を、定量曲線を用いて定量するステップ。
日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社製のDNAsisを用いて塩基配列を決定し、BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用いて塩基配列を解析し、米国国立衛生研究所(NIH)の関連機関NCBIが管理するGenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)に受託番号NC000962で寄託された塩基配列を解析することにより、本発明に使用するIS6110特異的プライマーおよびプローブは、M.ツベルクローシス(M.tuberculosis)群のみを増幅できるプライマー塩基配列であることが確認された。
実施例1で解析したプライマーは、Molecular Cloning 3rd ed.の段落10.42に記載された「オリゴヌクレオチド合成」法を用いてMetabion Corporation(Germany)が合成した(Sambrook and Rusell,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA,2001)。
結核と思われる患者の痰または標準株培養基の1〜2ml、および1〜2mlの4N NaOHを15mlのチューブに入れ、続いて十分に撹拌し、4,000rpmで20分間遠心分離した。上清を除去し、得られた沈殿物に10mlのPBS緩衝液(137mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa2HPO4、2mMのKH2PO4)を加え、続いて十分に撹拌し、4,000rpmで20分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿物を1.5mlのチューブに移し、これに1mlのPBS緩衝液を加え、続いて撹拌し、13,000rpmで5分間遠心分離した。再び上清を捨て、得られた沈殿物に50〜100uiの5%(w/v)Chelex 100樹脂(Bio−Rad Corp.)を加え、この混合物を100℃で20分間加熱し、13,000rpmで3分間遠心分離し、分離したDNAの上清をPCRの鋳型DNAとして使用した。
以下の表3に示すPCR反応組成物の処方に従いPCR反応組成物を調製し、以下の表4に示す反応条件下、SLANリアルタイムPCR検出系(LG Life Sciences Ltd.,Korea)を用いてPCR反応を行った。
従来の培養方法(MGIT,BD Corp.,US)と本発明のキットとの間でM.ツベルクローシス(M.tuberculosis)およびマイコバクテリア属(mycobacteria genus)の診断効果を比較した。
結核に類似した症状を呈するノカルジア(nocardia)属微生物と、ロドコッカス(rhodococcus)属微生物とについて、韓国特許出願第2008−0090156号明細書によるキットを使用して得られた結果を、本発明によるキットを用いたRT−PCRにより得られた結果と比較した。それらの結果を表6に示す。
実施例3および4の方法に従い42菌種のマイコバクテリア(mycobacteria)をRT−PCRに供した。その結果を以下の表7に示す。
Claims (17)
- 結核性マイコバクテリア(tuberculosis mycobacteria)および非結核性マイコバクテリア(nontuberculosis mycobacteria)を識別可能に検出するための組成物であって、
配列番号1の塩基配列および配列番号2の塩基配列の1つまたは複数を含むプライマー;および
配列番号3〜11の塩基配列の1つまたは複数を含むプライマー
を含む組成物。 - 前記組成物は、
配列番号1の塩基配列を含むプライマー;および
配列番号2の塩基配列を含むプライマー
の両者を含むことを特徴とする請求項1に記載の組成物。 - 前記組成物は、
配列番号3〜9の塩基配列の1つ若しくは2つ以上を含むプライマー;および
配列番号10〜11の塩基配列の1つ若しくは2つ以上を含むプライマー
の両者を含むことを特徴とする請求項1に記載の組成物。 - 前記組成物は、
配列番号1の塩基配列を含むプライマー;
配列番号2の塩基配列を含むプライマー;
配列番号3〜9の塩基配列の1つ若しくは2つ以上を含むプライマー;および
配列番号10〜11の塩基配列の1つ若しくは2つ以上を含むプライマー
を含むことを特徴とする請求項1に記載の組成物。 - 内部対照プライマーを更に含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の組成物。
- 前記内部対照プライマーは、植物由来の遺伝子特異的プライマーであることを特徴とする請求項5に記載の組成物。
- 前記植物由来の遺伝子は、レクチンであり、
前記植物由来の遺伝子特異的プライマーは、配列番号15の塩基配列を含むプライマーおよび配列番号16の塩基配列を含むプライマーの1つまたは2つ以上を含む
ことを特徴とする請求項6に記載の組成物。 - M.ツベルクローシス(M.tuberculosis)のIS6110遺伝子に特異的なプライマーとしての、配列番号1の塩基配列を含むセンスプライマー、および
配列番号2の塩基配列を含むアンチセンスプライマー
の1つまたは2つ以上を含むM.ツベルクローシス(M.tuberculosis)を検出するための組成物。 - 前記配列番号3〜11の塩基配列の1つまたは複数を含むプライマーは、長さ100bp以下のPCR増幅産物を形成することを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- (1)配列番号12の塩基配列を含むプローブ;並びに、
(2)配列番号13の塩基配列を含むプローブおよび配列番号14の塩基配列を含むプローブからなる群から選択される1つ以上
を含むM.ツベルクローシス(M.tuberculosis)またはマイコバクテリア(mycobacteria)属を検出するための組成物。 - 前記プローブは、その5’末端および3’末端で蛍光材料を用いて標識され、
5’末端で標識される前記蛍光材料(レポーター)および3’末端に標識される前記蛍光材料(クエンチャー)は相互に干渉する
ことを特徴とする請求項10に記載の組成物。 - 5’末端に標識される前記蛍光材料は、6−カルボキシフルオレセイン(FAM)、ヘキサクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(HEX)、テトラクロロ−6−カルボキシフルオレセインおよびシアニン−5(Cy5)からなる群から選択され、
3’末端に標識される前記蛍光材料は、6−カルボキシテトラメチル−ローダミン(TAMRA)またはブラックホールクエンチャー−1,2,3(BHQ−1,2,3)である
ことを特徴とする請求項11に記載の組成物。 - リアルタイムPCRアッセイを用いてM.ツベルクローシス(M.tuberculosis)およびマイコバクテリア(mycobacteria)属の識別、検出および解析を行うための組成物であって、
配列番号1の塩基配列および配列番号2の塩基配列の1つまたは2つ以上を含むプライマー;
配列番号3〜11の塩基配列の1つまたは2つ以上を含むプライマー;並びに
配列番号12〜14の塩基配列の1つまたは2つ以上を含むプローブ
を含む組成物。 - 内部対照プライマー;および
内部対照プローブ
を更に含むことを特徴とする請求項13に記載の組成物。 - 前記内部対照プライマーは、配列番号15の塩基配列を含むセンスプライマー、または配列番号16の塩基配列を含むアンチセンスプライマーであり、
前記内部対照プローブは、配列番号17の塩基配列を含むプローブである
ことを特徴とする請求項14に記載の組成物。 - 前記組成物は、
(i)M.ツベルクローシス(M.tuberculosis)のIS6110遺伝子に特異的なプライマーとプローブの混合物であって、
配列番号1の塩基配列を含むセンスプライマーおよび配列番号2の塩基配列を含むアンチセンスプライマー;並びに
配列番号12の塩基配列を含むプローブ
を含む混合物;
(ii)マイコバクテリア(mycobacteria)属のITS遺伝子に特異的なプライマーとプローブの混合物であって、
配列番号3〜9の塩基配列を含むセンスプライマーおよび配列番号10〜11の塩基配列を含むアンチセンスプライマー;並びに
配列番号13の塩基配列を含むプローブおよび/または配列番号14の塩基配列を含むプローブ
を含む混合物;
(iii)内部対照遺伝子に特異的なプライマーとプローブの混合物であって、
配列番号15の塩基配列を含むセンスプライマーおよび配列番号16の塩基配列を含むアンチセンスプライマー;並びに
配列番号17の塩基配列を含むプローブ
を含む混合物;並びに
(iv)緩衝液、DNAポリメラーゼ、dNTPおよび滅菌蒸留水を含む、PCR反応混合物
を含むことを特徴とする請求項13に記載の組成物。 - 請求項16に記載の解析用組成物を含む、M.ツベルクローシス(M.tuberculosis)解析キット。
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