KR100725579B1

KR100725579B1 - 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판을 이용한마이코박테리아 유전자형 검출용 ｐｎａ 칩 및 그를 이용한마이코박테리아 유전자형 검출 방법

Info

Publication number: KR100725579B1
Application number: KR1020050124918A
Authority: KR
Inventors: 김인수; 박영석; 정기훈; 강진석
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2005-02-16
Filing date: 2005-12-17
Publication date: 2007-06-08
Also published as: KR20060091708A

Abstract

본 발명은 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판 위에 서열번호 5 내지 서열번호 28의 DNA 염기서열을 포함하는 탐침 PNA(peptide nucleic acid)가 고정화된 것을 특징으로 하는 마이코박테리아 유전자형 검출용 PNA 칩 및 상기 PNA 칩을 이용하여 마이코박테리아의 유전자형을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PNA 칩 및 방법을 이용하면 결핵과 호흡기 질환의 원인균인 마이코박테리아의 유전자형 분석을 단시간내에 우수한 민감도 및 특이도로 수행할 수 있으므로, 검체내 마이코박테리아의 존재 여부, 존재하는 경우 그 마이코박테리아가 결핵균 종인지 여부 및 그의 구체적인 종을 신속하고 정확하게 확인할 수 있다.

마이코박테리아, 유전자형, 플라스틱 기판, PNA 칩

Description

에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판을 이용한 마이코박테리아 유전자형 검출용 ＰＮＡ 칩 및 그를 이용한 마이코박테리아 유전자형 검출 방법 {PNA chip for genotyping mycobacteria species using plastic substrate coated with polymer having epoxy groups and method for genotyping mycobacteria species using the PNA chip}

도 1은 DNA와 PNA의 기본 구조 차이를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 PNA 칩의 단면도의 한 예를 도시한 것이다.

도 3은 마이코박테리아 속 특이적 프라이머를 이용한 PCR 반응에 의해 증폭된 DNA를 나타내는 전기영동사진이다.

도 4는 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판 위에 탐침 PNA가 고정화되어 있는 본 발명에 따른 마이코박테리아 유전자형 검출용 PNA 칩의 탐침 배열 형태의 한 예를 도시한 것이다.

도 5는 본 발명에 따른 마이코박테리아 PNA 칩을 이용하여 결핵균(M. tuberculosis)으로부터 증폭한 PCR 산물을 적용하여 검출한 형광 사진이다.

도 6은 본 발명에 따른 마이코박테리아 PNA 칩을 이용하여 비결핵균의 하나인 마이코박테리움 조결핵균군(M. avium-intracellulare)으로부터 증폭한 PCR 산물을 적용하여 검출한 형광 사진이다.

도 7은 본 발명에 따른 마이코박테리아 PNA 칩을 이용하여 비결핵균의 하나인 마이코박테리움 케로네(M. chelonae)로부터 증폭한 PCR 산물을 적용하여 검출한 형광 사진이다.

본 발명은 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판을 이용한 마이코박테리아 유전자형 검출용 ＰＮＡ 칩 및 그를 이용한 마이코박테리아 유전자형 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판 위에 서열번호 5 내지 서열번호 28의 DNA 염기서열을 포함하는 탐침 PNA(peptide nucleic acid)가 고정화된 것을 특징으로 하는 마이코박테리아 유전자형 검출용 PNA 칩 및 상기 PNA 칩을 이용하여 마이코박테리아의 유전자형을 검출하는 방법에 관한 것이다.

결핵은 인류 역사상 가장 많은 생명을 앗아간 전염병으로 굵기 0.2-0.5㎛ 및 길이 1-4㎛ 크기의 막대모양을 한 마이코박테리아 속(Mycobacteria genus)의 결핵균에 의해서 발병한다. 상기 마이코박테리아 속에는 사람과 동물에 감염되어 결핵 등의 호흡기 질환 및 나병 등의 질병을 일으키는 종들이 다수 포함되며, 지금까지 약 100여종 이상이 알려져 있다(Shinnick TM and Good RC., Mycobacterial taxonomy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1994;13(11):884-901). 사람에게 결핵을 일으키는 가장 중요한 원인 균으로 알려져 있는 것은 인형 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 드물게 나타나는 우형 결핵균(Mycobacterium bovis) 등이 있으며, 마이코박테리움 레프리(Mycobacterium leprae)는 나병을 일으키는 것으로 알려져 있다(Hughes AL. Contrasting evolutionary rates in the duplicate chaperonin genes of Mycobacterium tuberculosis and M. leprae. Mol Biol Evol. 1993;10(6):1343-59).

일반적으로, 정상적인 사람에게 결핵을 일으키지는 않지만 후천성면역결핍증환자(AIDS) 및 기타 면역결핍증 환자에게 유사결핵증을 일으키는 마이코박테리아 속의 균들로는 조결핵균군(M. avium-intracellulare 또는 M. avium complex), 마이코박테리움 포투이툼(M. fortuitum), 마이코박테리움 케로네(M. chelonae), 마이코박테리움 고르도네(M. gordonae), 마이코박테리움 스줄가이(M. szulgai), 마이코박테리움 칸사시이(M. kansasii), 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum), 마이코박테리움 제나벤스(M. genavense) 등의 비결핵 마이코박테리아(비결핵균; nontuberculous mycobacteria; NTM) 등이 존재한다(Barnes PF et al., Tuberculosis in patients with human immunodeficiency virus infection. N Engl J Med. 1991;324(23):1644-1650).

상술한 균들의 감염에 의해 발생하는 결핵은 후진국 질병 중의 하나로 아직도 우리나라에서 매년 12만명의 신규 결핵균 감염자가 발생하며, 2003년도에 신고 집계된 결핵신환자 수가 30,687명(인구 10만명당 64명)에 달하며, OECD가입 30개국 중 결핵사망률 1위의 오명을 나타내고 있다(2004년 통계청 통계자료).

최근에는 비결핵균(NTM)이 후천성 면역결핍증(AIDS) 및 기타 면역결핍증 환자나 면역력이 약화된 유아 등에 감염되어 결핵균 감염증상과 유사한 임상증상을 나타내는 경우가 크게 증가하고 있는데, 이들 중 많은 종 들이 결핵균 치료 약제들에 대한 다중 내성을 갖는 것들이 있어 치료에 어려움을 주고 있다(Kam KM et al., Trends in Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis in Relation to Sputum Smear Positivity in Hong Kong, 1989-1999. Clin Infect Dis. 2002;34(3):324-329).

따라서, 이들 각각에 대응하여 적합한 치료를 수행하기 위해서는, 결핵균과 비결핵균을 조기에 감별 진단하는 것이 필수적으로 요망되고 있다.

결핵을 진단하는 일반적인 방법으로는 환자의 임상증상, 튜버쿨린 피부반응 검사, X-선 사진 촬영 및 결핵균 검사 등이 있다. 가장 간단한 방법인 튜버쿨린 검사는 간단하게 실시할 수 있으나 중증결핵, 홍역 및 면역억제로 인한 무감각(anergy)시에는 종종 위음성을 나타내며, X-선 사진은 판독자의 능력에 따라서 25% 가량의 차이가 나타나므로 이에 의한 진단은 판독자가 이상 음영을 찾아내는 능력과 그 이상 음영을 정확하게 판단하는 능력에 달려있다. 결핵균 검출은 결핵을 진단할 수 있는 확실한 방법으로 도말검사, 배양검사 및 분자진단 검사 등이 있다.

도말검사는 지일-닐센(Ziehl-Neelsen) 염색에 의해 항산성을 조사하는 염색법이 보편적으로 사용되고 있으나, 이 방법에 의하면 그 결과는 간단하고 신속하게 얻을 수 있지만, 결핵균과 비결핵균을 구분할 수 없을 뿐만 아니라 민감도 또한 떨어진다.

배양 검사법은 검체 1 ml에 균이 10마리 정도만 있어도 균 검출이 가능할 정도로 민감도가 높고 결핵균을 분리할 수 있어 정확한 진단이 가능하나, 잘 훈련된 요원에 의해서 약 4-8주간 배양하여 관찰하여야 하는 등 기간이 매우 오래 걸려 치료하는데 적절치 못한 단점이 있다. 새로운 배양법으로 개발된 BACTEC법(Becton Dickinson사, 미국)은 C¹⁴ 팔미테이트(palmitate)를 첨가한 액체배지에 균을 접종하고 균의 대사로 생긴 ¹⁴CO₂량을 방사성동위원소를 이용하여 발육지수로 나타내어 판정하는 기법인데, 결과를 평균 16일 정도면 얻을 수 있으나 방사선 동위원소를 취급할 수 있는 시설과 전문 인력을 갖추어야 하는 문제점이 있다.

중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 방법은 특정 유전자 부위를 2-3 시간 만에 증폭시켜 결핵균의 존재 여부를 신속하고 정확하게 확인할 수 있는 방법이다. 이를 이용하면 하루 안에 95% 이상의 민감도와 특이도로 임상 검체로부터 결핵균을 검출할 수가 있어 유용하게 사용할 수 있으나(Wilson SM et al., Progress toward a simplified polymerase chain reaction and its application to diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol. 1993; 31(4):776-78), 오염 (carry-over contamination)이 발생되기 쉬우며 전문 인력이 필요한 문제점 등을 지니고 있다(Noordhoek GT et al., Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis: a blind comparison study among seven laboratories. J Clin Microbiol. 1994;32(2):277-284).

최근에 급속히 증가하는 면역 결핍증 환자나 면역력이 떨어진 소아 등에게 비결핵균(NTM)에 의한 유사 결핵 환자가 꾸준히 증가하고 있다. 이들의 증상은 결핵과 매우 유사한데 반해, 치료에 있어서는 사용 약제가 전혀 다를 수가 있으므로 정확한 균의 동정이 필수적이다. 특히 비결핵균(NTM)에서 가장 많이 발견되는 조결핵균군(MAC)의 경우 1차 결핵 약제에 대한 효과는 결핵균에 비해 10-100배나 적은 것으로 알려져 있는 바, 미국흉부학회에서는 비결핵균의 종에 따른 각각의 진단과 치료에 대한 가이드라인을 제시하고 있다(American Thoracic Society, Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 1997;156(2):S1-S25).

현재 분자생물학적 방법을 이용하여 마이코박테리아의 종을 구분하기 위하여 일반적으로 사용하는 방법으로 제한효소를 사용하는 PCR-RFLP법과 특이 탐침를 사용하는 PCR-혼성화법이 있다. PCR-RFLP법은 PCR로 증폭한 후에는 간단하고 쉽게 결과를 얻을 수 있는 장점이 있으나 사용하는 제한 효소가 변이부분을 인식하지 못하면 분석하지 못하며, 다양한 유전자형을 분석하기에는 적합하지 않은 단점이 있다 (Lee H et al., Species identification of mycobacteria by PCR-restriction fragment length polymorphism of the rpoB gene. J Clin Microbiol. 2000;38(8):2966-71). PCR-혼성화법을 사용하여 상품화된 대표적인 것이 INNOGENETICS사의 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2(www.innogenetics.com, 벨기에)가 있다. 이는 유전적 다형성을 나타내는 영역의 염기배열에 상보적인 탐침을 합성하고 탐침과 PCR 증폭산물과의 혼성화 여부로서 분석하는 방법인데, 탐침의 종류에 따라 정확한 결과를 얻을 수 있으나 필터를 사용함에 따라서 많은 수의 탐침를 찍는데 한계가 있으며, 하나의 필터에서 하나의 타입만을 분석해야 하기 때문에 많은 검체를 처리하고 분석하는데 있어 시간과 노동력이 많이 소모가 된다.

최근에 개발된 DNA 마이크로어레이(DNA 칩) 기술을 이용한 마이코박테리아 유전자형 분석키트(대한민국 특허 제10-0343606호)는 유리 슬라이드상에 다양한 종특이 DNA 탐침를 결합시키고 PCR로 증폭된 산물과 결합시켜 나타나는 반응을 마이크로어레이 스캐너로 분석하는 것이다. 이는 INNOGENETICS사 제품에 비해 하나의 유리 슬라이드에 2명의 샘플을 동시에 분석이 가능하고, 스캐너를 이용하여 분석함으로서 좀더 객관적으로 결과를 수치화할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 여기서 사용한 DNA 탐침는 대기 중의 물분자와 쉽게 반응을 하며, 생물학적 및 화학적으로 DNA 염기자체의 불안정 때문에 보존기간에 따라서 DNA가 변질되거나 반응력이 떨어질 수가 있다. 또한, 유리 슬라이드와 커버 글라스를 사용해야 하므로 사용 시에 유리의 균열 및 안전사고가 쉽게 발생할 가능성이 있으며, 사용자의 편리성에 따른 다양한 구조로의 변경에도 어려움이 있다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 연구를 계속하던 중, 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판 위에 마이코박테리아 종 특이적인 탐침 PNA(peptide nucleic acid)들이 고정화된 PNA을 이용하면 마이코박테리아 유전자형의 검출을 통해 검체내 마이코박테리아의 존재 여부, 존재하는 경우 그 마이코박테리아가 결핵균 종인지 여부 및 그의 구체적인 종을 신속하고 정확하게 검출할 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 우수한 마이코박테리아의 유전자형 검출 효과를 갖는 PNA 칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 PNA 칩을 이용하여 마이코박테리아의 유전자형을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판 위에 서열번호 5 내지 서열번호 28의 DNA 염기서열을 포함하는 탐침 PNA(peptide nucleic acid)가 고정화된 것을 특징으로 하는 마이코박테리아 유전자형 검출용 PNA 칩을 제공한다.

본 발명에 있어서, 플라스틱 기판은 폴리메틸메타아크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리노보낸(polynorbonene), COC(Cyclic olefin Copolymer), 불소화 폴리이미드, 폴리스틸렌(PS), SBC(styrene-butadiene copolymer), ABS(acrylonitrile butadiene styrene), SAN((styrene acrylonitrile) 및 폴리 술폰으로 구성된 군에서 선택된 재질로 만들어진 투명한 플라스틱 기판인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 에폭시기를 갖는 중합체는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 에폭시기를 갖지 않는 아크릴레이트 모노머의 공중합체인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 에폭시기를 갖는 중합체는 하기 화학식 1을 가지는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 점성이 큰 아크릴레이트 모노머의 공중합체일 수 있다:

<화학식 1>

－［ＣＲ^３Ｒ^３－ＣＲ^１Ｒ^３－Ｘ］_ｎ－

상기 식에서,　Ｒ^１은　에폭시기를　가지는　에스터이고, Ｒ^３는　수소　또는　알킬기이고, Ｘ는　점성이 큰 아크릴레이트계　화합물이다.

본 발명에 있어서, 점성이 큰 아크릴레이트 모노머는 DPHA(dipentaerythrithol hydroxy pentaacrylate), 9-EGDA(9-ethyleneglycol diacrylate), PETA(pentaerythritol tri,tetraacrylate), 폴리에틸렌글리콜 400 디아크릴레이트(polyethyleneglycol 400 diacrylate), 트리프로필렌글리콜 디아크릴레이트(tripropyleneglycol diacrylate), 트리메틸올 프로판 트리아크릴레이트(trimethylol propane triacrylate) 및 디펜타에리스리톨 헥사크릴레이트(dipentaerythritol hexacrylate)로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 에폭시기를 갖는 중합체는 하기 화학식 2를 가지는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 플라스틱 기질과 접착(adhesion)가능한 아크릴레이트 유도체의 공중합체일 수 있다:

<화학식 2>

－［ＣＲ^３Ｒ^３－ＣＲ^１Ｒ^３－ＣＲ^３Ｒ^３－ＣＲ^２Ｒ^３］_ｎ－

상기식에서,　Ｒ^１은　에폭시기를　가지는　에스터이고, Ｒ^２는 알킬에스터이고, Ｒ^３는　수소　또는　알킬기이다.

상기 플라스틱 기질과 접착가능한 아크릴레이트 유도체는 메틸메타아크릴레이트(MMA), 에틸아크릴레이트, 에틸메타아크릴레이트(EMA), n-프로필아크릴레이트, n-프로필메타아크릴레이트, 아이소프로필아크릴레이트 및 아이소프로필메타아크릴레이트로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 에폭시기를 갖는 중합체에서 에폭시기의 함량은 20~30%인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 PNA 칩에서 탐침 PNA의 아민 말단에 아민 작용기를 가지며 에테르가 있거나 없는 탄소수 5-8개의 카르복실산이 링커로 추가된 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 PNA 칩에 표적 DNA를 포함한 반응 시료를 적용하는 단계, b) 탐침 PNA와 표적 DNA를 혼성화(Hybridization) 반응시키는 단계, c) 비특이적 반응을 제거하기 위해 세척하는 단계, 및 d) PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 형광 시그널을 검출하는 단계를 포함하는 마이코박테리아의 유전자형을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 표적 DNA는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 DNA 염기서열을 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 증폭된 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 프라이머는 바이오틴 또는 로다민이 부착된 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일면은 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판 위에 서열번호 5 내지 서열번호 28의 DNA 염기서열을 포함하는 탐침 PNA(peptide nucleic acid)가 고정화된 것을 특징으로 하는 마이코박테리아 유전자형 검출용 PNA 칩에 관한 것이다.

본 발명에 따른 PNA 칩에 사용되는 기판은 일반적인 실리콘 웨이퍼 및 유리가 아닌 플라스틱, 바람직하게 투명한 플라스틱으로부터 제조된다. 기존의 칩 기판은 주로 잘 가공된 비싼 유리를 사용하여 왔으나 본 발명에서는 싸고 다루기 쉬운 일반적인 플라스틱 기판을 사용하여 유리 기판이 지니는 단점을 극복할 수 있었다. 일반적으로 투명한 플라스틱이라 함은 폴리메틸메타아크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리노보낸(polynorbonene), COC(Cyclic olefin Copolymer), 불소화 폴리이미드, 폴리스틸렌(PS), SBC(styrene-butadiene copolymer), ABS(acrylonitrile butadiene styrene), SAN(styrene acrylonitrile) 또는 폴리 술폰 등을 포함한 기판을 포함한다.

본 발명에 따른 PNA 칩에 사용되는 에폭시기를 갖는 중합체의 한 구체예는 하기 화학식 1을 가지는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 점성이 큰 아크릴레이트 모노머의 공중합체이다:

<화학식 1>

－［ＣＲ^３Ｒ^３－ＣＲ^１Ｒ^３－Ｘ］_ｎ－

상기 식에서,　Ｒ^１은　에폭시기를　가지는　C3-12의 에스터이고，Ｒ^３는　수소　또는　C1-16의 알킬기이고, Ｘ는　점성이 큰 아크릴레이트계　화합물이며, n은 10~2000이다.

상기 점성이 큰 아크릴레이트 모노머는 DPHA(dipentaerythrithol hydroxy pentaacrylate), 9-EGDA(9-ethyleneglycol diacrylate), PETA(pentaerythritol tri,tetraacrylate), 폴리에틸렌글리콜 400 디아크릴레이트(polyethyleneglycol 400 diacrylate), 트리프로필렌글리콜 디아크릴레이트(tripropyleneglycol diacrylate), 트리메틸올 프로판 트리아크릴레이트(trimethylol propane triacrylate) 및 디펜타에리스리톨 헥사크릴레이트(dipentaerythritol hexacrylate)로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 PNA 칩에 사용되는 에폭시기를 갖는 중합체의 다른 구체예는 하기 화학식 2를 가지는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 플라스틱 기질과 접착(adhesion)가능한 아크릴레이트 유도체의 공중합체이다:

<화학식 2>

상기 식에서,　Ｒ^１은　에폭시기를　가지는　C3-12의 에스터이고，Ｒ^２는 C2-16의 알킬에스터이고，Ｒ^３는　수소　또는　C1-16의 알킬기이고, Ｘ는　점성이 큰 아크릴레이트계　화합물이며, n은 10~2000이다.

상기 에폭시기를 갖는 중합체는 아크릴레이트계 화합물을 사용하여 자외선 경화법(T. Jaworek, Macromol Symp., 159, 197, 2000; Cliff Roffey, 'Photogeneration of Reactive Species for UV Curing', 1997 참조) 또는 라디칼중합법(Bevington, J.C., in 'Comprehensive Polymer Science', Vol 3, 65 1989; Tedder, J.M., Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 21, 401, 1982 참조)과 공지의 방법을 이용하여 제조될 수 있다.

상기 공중합법을 이용한 에폭시기를 갖는 중합체 합성에서는 에폭시기를 가지는 아크릴레이트와 다른 아크릴레이트의 중량 비를 0.1:99.9에서 100:0으로 제조할 수 있고 생체물질을 고정하기위한 에폭시기를 가지는 아크릴레이트의 중량 비는 10%이상이 바람직하다. 바람직하게, 에폭시기를 갖는 중합체에서 에폭시기의 함량은 20~30%인 것이 바람직하다. 공중합시 반응온도는 에폭시기의 고리 열림을 방지하기 위하여 90℃이하에서 공중합을 수행시키는 것이 바람직하다.

상기 에폭시기를 갖는 중합체를 상기 플라스틱 기판에 코팅하는 방법은 디핑법, 스프레이법 및 프린팅법 등 통상적인 코팅방법 중 어느 하나의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 PNA 칩에 사용되는 탐침 PNA의 서열은 서열번호 5 내지 서열 번호 28의 DNA 염기서열을 기초로 작성된 것이다. 서열번호 5는 모든 종의 마이코박테리아와 혼성화 반응을 하는 탐침 서열이고(양성 대조구), 서열번호 6은 모든 종의 마이코박테리아와 혼성화 반응을 하지 않는 탐침 서열이며(음성 대조구), 서열번호 7 내지 서열번호 28은 각각 한 종에만 특이적으로 혼성화 반응을 하는 마이코박테리아의 ITS 부분의 염기서열을 근거로 한 종 특이적 탐침 서열이다.

일반적으로, PNA(peptide nucleic acid)는 1991년에 개발된 것으로 도 1과 같이 데옥시리보스 포스페이트 뼈대(deoxyribose phosphate backbone)를 지닌 DNA와는 달리 N-(2-아미노에틸) 글리신을 기본단위로 한 펩티드 뼈대(peptide backbone)로 구성된 올리고뉴클레오티드 유사체이다. PNA는 DNA-DNA 결합에 비해 특이도 및 강도가 높은 PNA-DNA 결합을 나타내며 생물학적, 화학적으로 안정된 구조를 지닌 장점이 있다(Hyrup B and Nielsen PE, Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. Bioorg Med Chem. 1996;4(1):5-23).

본 발명에 따른 탐침 PNA를 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판 위에 고정화는 통상적인 DNA 고정화 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 예컨대, 마이크로로봇이 3차원적으로 움직이면서 원하는 위치에 선택적으로 생화학물질을 떨어뜨리는 스폿팅(Spotting)방식, 만년필 촉과 같은 형태의 핀(pin)을 이용하여 어레이하는 마이크로 어레이 방식, 원하는 위치에 선택적으로 빛을 쪼임으로써 표면을 변화시켜 표면과 생체분자와의 결합 반응이 특정 위치만 일어나게 하는 포토리소그래피(photolithography) 방식, 미소전극 어레이(microelectrode array)의 전극 전압을 조절하여 생체분자가 특정 전극에만 고정되도록 하는 전자 어드레싱(electronic addressing)방식을 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 일면은 상기 본 발명에 따른 PNA 칩을 이용하여 마이코박테리아의 유전자형을 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 유전자형을 검출하는 방법은 a) 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 PNA 칩에 표적 DNA를 포함한 반응 시료를 적용하는 단계, b) 탐침 PNA와 표적 DNA를 혼성화(Hybridization) 반응시키는 단계, c) 비특이적 반응을 제거하기 위해 세척하는 단계, 및 d) PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 형광 시그널을 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, 표적 DNA는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 DNA 염기서열을 프라이머로 사용하고 마이코박테리아 감염이 의심되는 환자의 객담, 체액 및 뇨로부터 분리한 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭된 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 PNA 칩을 이용하여 마이코박테리아의 유전자형을 검출하는 방법에 의하면, 결핵과 호흡기 질환의 원인균인 마이코박테리아의 유전자형 분석을 단시간내에 우수한 민감도 및 특이도로 수행할 수 있으므로, 검체내 마이코박테리아의 존재 여부, 존재하는 경우 그 마이코박테리아가 결핵균 종인지 여부 및 그의 구체적인 종을 신속하고 정확하게 확인할 수 있다. 상기에서 특정 종이 확인되면, 그에 따라 치료의 처방도 결정될 수 있다. 그 뿐만 아니라 임상 및 역학적으로 전염성 환자의 발견, 전염경로 조사, 결핵균 감시체계 구축, 치료 반응의 판정, 백신 및 치료제의 개발 등에도 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 표적 DNA의 제조를 위한 프라이머 합성

본 발명에 따른 표적 DNA의 제조를 위해, 먼저 PCR에 사용하기 위한 프라이머를 합성하였다. 프라이머 서열은 표 1에 나타난 것과 같이 25 종의 마이코박테리아의 16S rDNA, ITS (Inter Transcribed Spacer) 및 23S rDNA 유전자 부위에서 공통적으로 반응할 수 있는 부위를 분석하여 표 2와 같이 선택하여 사용하였다.

PCR에 사용하는 프라이머는 혼성화 반응 후에 형광반응을 확인하기 위한 것으로, 5' 말단에 로다민 또는 바이오틴이 부착되어 혼성화 과정 후에 스트렙타비딘-시아닌3(Streptavidin-Cyanine3)과 결합하도록 제작하여 사용하였다. 본 실시예에서는 Molecular cloning 3판(Sambrook과 Rusell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 올리고뉴클레오티드 합성과 같은 방법을 사용하여 메타비온 사(Metabion, 독일)에 의뢰하여 프라이머를 합성하였다.

<표 1>

번호	마이코박테리아 종류 (기탁번호)
1	M. avium (ATCC 25291)
2	M. bovis (ATCC 19210)
3	M. chelonae (ATCC 35749)
4	M. fortuitum (ATCC 6841)
5	M. gastri (ATCC 15754)
6	M. gordonae (ATCC 14470)
7	M. intracellulare (ATCC 13950)
8	M. kansasii (ATCC 12478)
9	M. malmoense (ATCC 29571)
10	M. microti (ATCC 19422)
11	M. scrofulaceum (ATCC 19981)
12	M. simiae (ATCC 25275)
13	M. smegmatis (ATCC 19420)
14	M. terrae (ATCC 15755)
15	M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294)
16	M. tuberculosis (ATCC 35804)
17	M. vaccae (ATCC 15483)
18	M. africanum (ATCC 25420)
19	M. genavense (ATCC 51233)
20	M. marinum (ATCC 927)
21	M. xenopi (ATCC 19250)
22	M. szulgai (ATCC 35799)
23	M. flavescens (ATCC 14474)
24	M. lentiflavum (ATCC 51985)
25	M. abscessus (ATCC 19977)

<표 2>

프라이머 염기서열 (5' → 3')			비고
1차	센스 (서열번호 1)	CCC GAA GCC RGT GGC CTA ACC	R=G+A
	안티센스 (서열번호 2)	CCA AGG CAT CCA CCA TGC GCC C
2차	센스 (서열번호 3)	CTT TCT AAG GAG CAC CA	1차 PCR로 증폭이 충분치 않을시 사용
	안티센스 (서열번호 4)	GAT GCT CGC AAC CAC TA

실시예 2: PCR 반응을 이용한 표적 DNA 제조

1) 결핵이 의심되는 환자의 객담 2-5ml과 동량의 4N NaOH를 15ml 튜브에 넣고 충분히 교반시킨 후 4,000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 10 ml의 PBS 버퍼(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄)를 넣어 잘 교반시킨 후, 4,000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 다시 상층액을 제거하고 침전물을 1.5 ml 튜브로 옮긴 후 PBS 버퍼 1 ml을 넣고 교반시킨 후 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 또 다시 상층액을 제거하고 침전물에 5%(w/v) Chelex 100 resin(Bio-Rad 사)을 50-100 ul를 넣고 100℃에서 20분간 가열한 후, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 분리된 DNA 상층액을 PCR의 주형 DNA로 사용하였다.

2) 표 3과 같은 PCR 반응 조건으로 PCR 반응 조성물을 제조하고, PCR 반응을 PTC200 thermal cycler(MJ Research 사, 미국)에서 시행하였다.

3) 반응이 끝난 PCR 산물 5 ul에 젤 로딩 버퍼(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll 400) 1 μl를 넣고 1 μg/ml EtBr(ethidium bromide)가 함유된 2% 아가로스 젤에서 전기영동한 후 UV 트랜스일루미네이터(transilluminator)가 부착된 영상 분석기(Image analyzer; Bio Rad 사, 미국)에서 PCR 밴드를 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

4) 증폭된 PCR 산물이 충분하지 않을 시에는 1차 PCR 산물 2μl를 주형으로 하여 표 4와 같은 제 2차 PCR 반응 조건으로 재 증폭시킨 후에 3)과 동일한 방법으로 결과를 확인하였다.

<표 3>

반응 조성물 조건		반응 온도 조건
멸균 증류수	10.0	95℃, 5.0 분	1 회
10X buffer	2.0
2mM dNTP	1.0	94℃, 1.0 분 60℃, 1.0 분 72℃, 1.0 분	35 회
2-10pmol 1차 센스 프라이머	1.0
2-10pmol 1차 앤티센스 프라이머	1.0
1U Taq	0.5
추출된 DNA	4.5
합계	20μl	72℃, 5.0 분	1 회

<표 4>

반응 조성물 조건		반응 온도 조건
멸균 증류수	12.5	95℃, 5.0 분	1 회
10X buffer	2.0
2mM dNTP	1.0	94℃, 0.5 분 62℃, 0.5 분 72℃, 1.0 분	30 회
2-10pmol 1차 센스 프라이머	1.0
2-10pmol 1차 앤티센스 프라이머	1.0
1U Taq	0.5
1차 PCR 산물	2.0
합계	20 μl	72℃, 5.0 분	1 회

실시예 3: 탐침 PNA 제작

표 5에 나타낸 바와 같이 모든 마이코박테리아에서 혼성화 반응을 실시하는 속 균주 감별 프로브 및 해당 종에만 특이적으로 혼성화 반응을 하는 종 특이 프로브를 마이코박테리아의 ITS 부분의 염기서열을 근거로 하여 표 2에 기술한 마이코박테리아 25종을 분석하여 22종의 PNA 프로브를 결정하였다. 이때 합성할 프로브의 5' 말단에 링커를 붙이고 프로브의 크기는 최소 11 bp에서 최대 18 bp의 크기로 하여, Tm 값과 GC%를 고려하여 58-62℃를 전후하여 합성하였다. 이때 합성한 PNA 프로브는 아민 작용기를 가지고 있는 레진을 지지체로 사용하고, 환형 Bts 모노머(cyclic Bts monomer)를 이용하여 고정상에서 합성을 수행하고, 레진으로부터 절단 및 탈보호(deprotection), HPLC 정제, MALDI-MS 확인 과정을 거치는 방법을 사용하 여 합성하였다.

<표 5>

탐침 이름	염 기 서 열^*	반응 유전자형
Myco 01 (서열번호 5)	AAA　CAC　CAC　ACC　CC	모든종에 반응(양성 대조구)
Myco 02 (서열번호 6)	AAA　CAC　TGG　ACC　CC	모든종에 무반응(음성 대조구)
Myco 03 (서열번호 7)	CAC CTG GAA CAA GT	M. tuberculosis complex
Myco 04 (서열번호 8)	GAC CGA GTG TTG TCT	MAC complex
Myco 05 (서열번호 9)	CAC　CCG　CAA　CCG	M. fortuitum
Myco 06 (서열번호 10)	AGC GAG TAA CCA CT	M. chelonae
Myco 07 (서열번호 11)	CCA CTA CAG ATG CCT A	M. abscessus
Myco 08 (서열번호 12)	CAC TTG TTG GGA TGC	M. kansasii
Myco 09 (서열번호 13)	GAC AGC ACC CGA	M. gordonae
Myco 10 (서열번호 14)	ACC　ACT　CAG　AAC　GA	M. scrofulaceum
Myco 11 (서열번호 15)	ACA　ACA　GCT　CTG　GC	M. szulgai
Myco 12 (서열번호 16)	TGA　TTT　CCC　TCG　CCG	M. vaccae
Myco 13 (서열번호 17)	GCG GTT ACT GCC TGC TG	M. xenopi
Myco 14 (서열번호 18)	GAA ACC CCC AAG G	M. terrae
Myco 15 (서열번호 19)	TTC CTC AAA GCA GTG	M. flavescens
Myco 16 (서열번호 20)	CAG TCC ATC GAA ACA	M. smegmatis
Myco 17 (서열번호 21)	CAC GCG GAC TGG CC	M. malmoense
Myco 18 (서열번호 22)	ACC ACT TCA ACC GA	M. simiae
Myco 19 (서열번호 23)	TCC　CGA　AAC　CAA　CA	M. marinum- ulcerance
Myco 20 (서열번호 24)	CAA CAC TCT TGG ACG	M. gastri
Myco 21 (서열번호 25)	CAC GGA CGG ACC	M. avium
Myco 22 (서열번호 26)	ACA CGG ATC GAC C	M. intracellulae
Myco 23 (서열번호 27)	CAC GTC GAC CTC AG	M. genavense
Myco 24 (서열번호 28)	CAC GTC GAC CAA A	M. lentiflavum

^* PNA 염기서열에 대한 표기는 DNA 염기서열에 대한 표기를 사용하였음.

실시예 4: PNA 칩의 제작

1) PNA 올리고뉴크레오티드 칩을 제작하기 위하여, 기판으로서 폴리스틸렌(polystylene) 플라스틱 위에 에폭시기(epoxy group)가 붙어있는 AGE(allyl glycidyl ether)를 공유결합 시켜 제작한 에폭시 플라스틱 슬라이드를 사용하였다. 100 pmole의 아미노기가 붙어있는 PNA 탐침과 동량의 스폿팅버퍼 (3XSSC, 0.01%SDS)와 잘 혼합하여 피에조레이 마이크로어레이 시스템(piezorray microarraying system; Perkin Elmer사, 미국)을 이용하여 도 4와 같은 형태로 플 라스틱 슬라이드 위에 스폿팅하고, 온습도가 조절되는 챔버내에서 60℃, 70% 습도 조건으로 16시간동안 방치하였다.

2) 50℃의 50mM Tris-HCl(pH9.0) 용액에 상기 기판을 담근 후 30분간 반응시킨 다음, 0.2% SDS로 2분간 2회 세척하고 증류수로 2분간 2회 세척한 후 1,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 건조시켰다. 이와 같이 완성된 PNA 올리고뉴크레오티드 칩은 사용 전 까지 실온의 암소에서 보관하였다.

실시예 5: 마이코박테리아 유전자형 검출

1) 로다민 또는 바이오틴으로 결합된 PCR 산물을 하이브리다이제이션 용액(3X SSC, 0.001% SDS)과 l:20의 비율로 혼합하였다. 형광반응을 일으키기 위하여 바이오틴을 사용한 경우에는 스트렙타비딘3(Streptavidin-Cyanine3)을 1 ug/ml 농도로 혼성화 용액에 첨가하여 반응시켰다.

2) 플라스틱 슬라이드의 챔버를 덮은 채로 챔버위의 구멍에 90ul의 혼성화 혼합액을 챔버에 채우고, 55℃에서 30-60분 동안 반응시켰다.

3) 반응 후 1X SSC로 실온에서 5분간 챔버를 세척하고 0.1X SSC로 2분간 세척한 후에 실온에서 건조시켰다.

4) 결과 확인

Scanner(GenePiX4000B, Axon instruments, 미국)를 사용하여 형광을 나타내는 프로브를 당사에서 개발한 타이핑 프로그램을 이용하여 유전자형을 분석하였다. 그 일례를 도 5 내지 도 7에 나타내었다. 도 5는 결핵균(M. tuberculosis)으로부터 증폭한 PCR 산물을 적용하여 검출한 형광 사진이다. 도 6은 비결핵균의 하나인 마이코박테리움 조결핵균군(M. avium - intracellulare)으로부터 증폭한 PCR 산물을 적용하여 검출한 형광 사진이다. 도 7은 마이코박테리움 케로네(M. chelonae)으로부터 증폭한 PCR 산물을 적용하여 검출한 형광 사진이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 PNA 칩 및 방법을 이용하면 결핵과 호흡기 질환의 원인균인 마이코박테리아의 유전자형 분석을 단시간내에 우수한 민감도 및 특이도로 수행할 수 있으므로, 검체내 마이코박테리아의 존재 여부, 존재하는 경우 그 마이코박테리아가 결핵균 종인지 여부 및 그의 구체적인 종을 신속하고 정확하게 확인할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판 위에 서열번호 5 내지 서열번호 28의 DNA 염기서열을 포함하는 탐침 PNA(peptide nucleic acid)가 고정화된 것을 특징으로 하는 마이코박테리아 유전자형 검출용 PNA 칩.
제 1항에 있어서, 상기 플라스틱 기판은 폴리메틸메타아크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리노보낸(polynorbonene), COC(Cyclic olefin Copolymer), 불소화 폴리이미드, 폴리스틸렌(PS), SBC(styrene-butadiene copolymer), ABS(acrylonitrile butadiene styrene), SAN((styrene acrylonitrile) 및 폴리 술폰으로 구성된 군에서 선택된 재질로 만들어진 투명한 플라스틱 기판인 것을 특징을 하는 PNA 칩.
제 1항에 있어서, 상기 에폭시기를 갖는 중합체는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 에폭시기를 갖지 않는 아크릴레이트 모노머의 공중합체인 것을 특징으로 하는 PNA 칩.
제 3항에 있어서, 상기 에폭시기를 갖는 중합체는 하기 화학식 1을 가지는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 아크릴레이트 모노머의 공중합체인 것을 특징으로 하는 PNA 칩:

<화학식 1>

－［ＣＲ^３Ｒ^３－ＣＲ^１Ｒ^３－Ｘ］_ｎ－

상기 식에서,　Ｒ^１은　에폭시기를　가지는　에스터이고, Ｒ^３는　수소　또는 알킬기이고, Ｘ는　점성이 큰 아크릴레이트계　화합물이다.
제 4항에 있어서, 상기 점성이 큰 아크릴레이트 모노머는 DPHA(dipentaerythrithol hydroxy pentaacrylate), 9-EGDA(9-ethyleneglycol diacrylate), PETA(pentaerythritol tri,tetraacrylate), 폴리에틸렌글리콜 400 디아크릴레이트(polyethyleneglycol 400 diacrylate), 트리프로필렌글리콜 디아크릴레이트(tripropyleneglycol diacrylate), 트리메틸올 프로판 트리아크릴레이트(trimethylol propane triacrylate) 및 디펜타에리스리톨 헥사크릴레이트(dipentaerythritol hexacrylate)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PNA 칩.
제 3항에 있어서, 상기 에폭시기를 갖는 중합체는 하기 화학식 2를 가지는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 아크릴레이트 유도체의 공중합체인 것을 특징으로 하는 PNA 칩:

<화학식 2>

－［ＣＲ^３Ｒ^３－ＣＲ^１Ｒ^３－ＣＲ^３Ｒ^３－ＣＲ^２Ｒ^３］_ｎ－

상기식에서,　Ｒ^１은　에폭시기를　가지는　에스터이고, Ｒ^２는 알킬에스터이고, Ｒ^３는　수소　또는　알킬기이다.
제 6항에 있어서, 상기 플라스틱 기질과 접착가능한 아크릴레이트 유도체는 메틸메타아크릴레이트(MMA), 에틸아크릴레이트, 에틸메타아크릴레이트(EMA), n-프로필아크릴레이트, n-프로필메타아크릴레이트, 아이소프로필아크릴레이트 및 아이소프로필메타아크릴레이트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PNA 칩.
제 1항에 있어서, 상기 에폭시기를 갖는 중합체에서 에폭시기의 함량은 20~30%인 것을 특징으로 하는 PNA 칩.
제 1항에 있어서, 상기 탐침 PNA의 아민 말단에 아민 작용기를 가지며 에테르가 있거나 없는 탄소수 5-8개의 카르복실산이 링커로 추가된 것을 특징으로 하는 PNA 칩.
a) 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 PNA 칩에 반응 시료를 적용하는 단계;

b) 비특이적 반응을 제거하기 위해 세척하는 단계; 및

c) PNA/DNA 하이브리드 형성에 의해 방출될 수 있는 형광 시그널을 검출하는 단계를 포함하는 마이코박테리아 유전자형을 검출하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 반응 시료는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 DNA 염기 서열을 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 증폭된 표적 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 프라이머는 바이오틴 또는 로다민이 부착된 것을 특징으로 하는 방법.