KR100938777B1 - 다중 아민기를 갖는 펩티드 핵산과 이를 이용하는 핵산검출 장치 - Google Patents

다중 아민기를 갖는 펩티드 핵산과 이를 이용하는 핵산검출 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다중 아민기를 갖는 펩티드 핵산(PNA)과 이의 합성법 및 이의 활용에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 PNA의 아민 말단(N-terminal)에 다중 아민기를 갖는 링커를 중합하여 다중 아민기를 갖는 PNA를 합성하고, 상기 다중 아민기를 갖는 PNA를 이용하여 고체 표면에 효과적으로 PNA를 고정시키는 것을 특징으로 한다. 다중 아민기를 갖는 PNA는 아민기가 1개인 보통의 PNA 탐침에 비해 타겟 핵산 염기 서열을 검출하는 신호의 민감도와 특이성을 향상시킨다. 이렇게 고정된 PNA는 PNA 마이크로어레이, PNA 칩, PNA 전계 효과 트랜지스터, 임피던스 검출기 등 타겟 핵산 염기 서열 검출 장치 및 유전자 진단 키트에 이용될 수 있다.
펩티드 핵산, peptide nucleic acid, PNA, PNA 칩, PNA 고정화, 다중아민 링커

Description

다중 아민기를 갖는 펩티드 핵산과 이를 이용하는 핵산 검출 장치{Peptide Nucleic Acids Conjugated with Multi-Amine Linkers and Nucleic Acid Detecting Device Using the Same}
본 발명은 말단에 다중 아민기를 갖는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid, 이하 ‘PNA’라 함) 탐침(probe)과, 이를 고체 표면에 고정하는 방법, 그리고 고체 표면에 고정된 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 염기 서열 검출 장치 및 유전자 진단 키트에 관한 것이다.
펩티드 핵산은 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 처음 보고되었다 (Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, “Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide”, Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500). PNA는 화학적인 방법으로 합성되고 자연계에서는 발견되지 않는다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 겹가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹가닥은 DNA/DNA 겹가닥보다, PNA/RNA 겹가닥은 DNA/RNA 겹가닥보다 안정하다. 펩티드 핵산의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기(nucleobase)는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산 분해효소(Nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 겹가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 PNA는 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다.
염기 서열이 알려진 탐침(probe)을 이용하여 균일 용액에서 핵산 염기 서열을 인식하거나 검출하는 경우 보통 한 번에 하나의 서열만을 인식할 수 있을 뿐, 색깔이 다른 형광 염료를 쓰는 경우 수 개 이상의 서열을 동시에 검출하는 것은 어렵다. 그에 비해 고체 표면에 고정한 탐침을 이용하면 그보다 훨씬 많은 수의 탐침을 이용하여 특정 핵산 염기 서열의 존재 여부를 동시에 검사할 수 있다. 수십만개 이상의 탐침을 2차원으로 배열한 DNA 마이크로어레이가 이미 상용화되어 있다. DNA 탐침 대신 PNA 탐침을 사용한 PNA 마이크로어레이 또는 PNA 칩도 알려져 있다 (Brandt O, Hoheisel JD, “Peptide nucleic acids on microarrays and other biosensors”, Trends Biotechnology 2004, Vol. 22, pp617-622). 2차원의 위치 정 보 대신 구분할 수 있는 수 ㎛ 크기의 마이크로구슬(microbead 또는 microsphere) 표면에 PNA 탐침을 고정시켜 다수의 탐침에 대한 검사를 동시에 하는 방법도 알려져 있다 (Rockenbauer E, Petersen KH, Vogel U, Bolund L,
Figure 112007090018537-pat00001
, Nielsen KV,
Figure 112007090018537-pat00002
, “SNP genotyping using microsphere-linked PNA and flow cytometric detection”, Cytometry Part A 2005, Vol. 64A, pp80-86). 형광을 이용하여 탐침에 상보적인 핵산 염기 서열이 혼성화되었는지를 알아내는 방법이 널리 쓰이지만 실리콘 반도체 또는 실리콘 나노선(nanowire)에 고정한 PNA를 이용한 전계 효과 트랜지스터를 써서 핵산 염기 서열을 전기적인 방법으로 검출하는 방법도 알려져 있다 [F. Uslu et al. “Labelfree fully electronic nucleic acid detection system based on a field-effect transistor device”, Biosensors and Bioelectronics 2004, Vol. 19, pp1723-1731; J. Hahm and C. M. Lieber, “Direct ultrasensitive electrical detection of DNA and DNA sequence variations using nanowire nanosensors”, Nano Letters 2004, Vol. 4, pp51-54]. 임피던스 변화로 핵산 염기 서열을 검출하는 장치도 보고되었다 [A. Macanovic et al. “Impedance-based detection of DNA sequences using a silicon transducer with PNA as the probe layer”, Nucleic Acids Research 2004, Vol.32, e20].
타겟 핵산이 혼성화하기 전과 후에는 탐침의 질량이 변화하므로 이에 따르는 기계적인 변화를 이용해서도 핵산 염기 서열을 검출할 수 있다. DNA 또는 RNA가 결합하기 전과 결합한 후는 마이크로외팔보(microcantilever) 또는 표면 음 파(surface acoustic wave, SAW) 센서의 진동 주파수가 다르기 때문에 이를 검출할 수 있다. PNA를 사용하는 마이크로외팔보와 SAW 센서가 보고되었다 [S. Manalis and T. Burg, US Patent 7,282,329 “Suspended microchannel detectors”; P. Warthoe and S. Iben, US Patent Application Publication 2004/0072208 A1 “Surface acoustic wave sensors and method for detecting target analytes”].
이렇게 여러 PNA 탐침을 상대로 동시에 염기 서열을 검사하는 장치나 방법에서는 PNA를 고체표면에 고정할 필요가 있다. 고정화하는 방법으로는 물리적 결합보다 안정한 화학적 공유 결합을 이용하는 경우가 많다. 일반적으로 PNA 칩, DNA 칩, 단백질 칩 등의 바이오 칩에서는 알데히드(aldehyde)-아민, 카복실 산(carboxylic acid)-아민, 에폭사이드(epoxide)-아민 반응에 의해 생성되는 공유결합을 이용하는 고정화 방법이 널리 이용된다 (Microarray surfaces, M. Sechena, Microarray analysis, A John Wiley & Sons, Inc., Publication, pp95-120). 유리 표면에 고정화하는 경우에는 일반적으로 알데히드나 아민 그리고 에폭시 기를 가지고 있는 유기실란 (organosilane) 물질을 실릴화 (silylation) 과정을 통하여 유리 표면에 기능성 작용기가 표출되게 만들고, PNA 의 N-말단의 아민(amine)기를 상기 표출된 기능성 작용기와 반응시켜 공유결합을 형성한다.
반응성이 높은 작용기(functional group)를 사용하여 탐침의 고정화 효율을 높일 수 있다. DNA나 PNA 탐침의 말단에 하이드라지드(hydrazide) 등과 같은 고활성의 작용기을 사용할 수 있다 (S. Raddatz et . al ., “Hydrazide oligonucleotides: new chemical modification for chip array attachment and conjugation”, Nucleic Acids Research, 2002, Vol.30, pp4793-4802). 이 방법으로 같은 표면에서라도 DNA나 PNA가 보다 잘 반응할 수 있게 하여 고정화 효율을 늘려 민감도가 높은 바이오 칩을 형성할 수 있다. 표면의 반응성을 높여서 탐침의 고정화 효율을 높일 수도 있다. 이 방법은 고체 표면에 고정된 단순 아민이나 알데히드 작용기에 고활성의 링커를 화학 결합시켜 활성화 에스터(activated ester)나 이소티오시아네이트(isothiocyanate)와 같은 물질이 표출되게 만들어 DNA나 PNA 탐침과 반응시킨다. 그러나 상기 탐침의 끝이나, 표면에 도입한 고활성의 작용기는, 반응성이 쉽게 감소하고 보관이 어려운 문제가 있다.
본 발명은 다중 아민기를 갖는 단량체가 수 회 중합된 다중 아민기를 갖는 PNA 탐침 및 그의 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.
또한 본 발명은 상기 다중 아민기를 갖는 PNA 탐침을 기능화된 표면에 고효율로 고정하는 방법을 제공하는데에 다른 목적이 있다.
또한 본 발명은 상기 다중 아민기를 갖는 PNA 탐침을 기능화된 유리기판 뿐만 아니라 기능화된 플라스틱 기판, 실리카, 실리콘 반도체, 자성분자, 나이론, 고분자화합물, 박막, 셀룰로스 또는 니트로셀룰로스의 고형물질의 표면에 고정하여 제작된 핵산 염기 서열 검출 장치 및 유전자 진단 키트를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)을 사용하여 다중 아민기를 갖는 PNA와 이의 합성법 및 이의 활용에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 PNA의 아민 말단(N-terminal)에 다중 아민기를 갖는 단량체로 이루어진 링커를 수 회 중합하여 다중 아민기를 갖는 PNA를 합성하고, 상기 다중 아민기를 갖는 PNA를 이용하여 표면에 친전자성 작용기를 갖는 고형물질에 대한 고정화 효율을 향상시켜 PNA 탐침이 검출하는 타겟 핵산 또는 유전자의 검출 신호 세기 및 민감도를 개선하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 다중 아민기를 갖는 PNA를 이용하여 제작된 민감도와 특이성이 개선된 핵산 염기 서열 검출 장치 및 유전자 진단 키트를 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
1991년 덴마크의 Buchardt, Nielsen, Egholm, Berg 등이 최초로 보고한 N-(2-아미노에틸)글리신(N-(2-aminoethyl)glycine)이 아미드(amide) 결합으로 연결된 하기 구조의 PNA를 본 발명에 이용할 수 있다.
Figure 112007090018537-pat00003
N-(2-아미노에틸)글리신(N-(2-aminoethyl)glycine)이 중합된 기본 골격의 PNA가 가장 흔히 사용되지만 아래 구조의 PNA도 알려져 있고 [P.E. Nielsen and M. Egholm “An Introduction to PNA”in P.E. Nielsen (Ed.) “Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications” 2nd Ed. Page 9 (Horizon Bioscience, 2004)] 이러한 PNA도 본 발명에 이용될 수 있다.
Figure 112007090018537-pat00004
핵산 염기 서열 또는 유전자를 검출하기 위해 고체 표면에 고정되는 PNA 탐침은 핵산 염기를 8 내지 30개 포함하는 것이 바람직하다. PNA 염기 서열이 고체 표면에 너무 가깝게 고정되면 타겟 유전자와의 혼성화가 방해를 받을 수 있으므로 PNA 염기 서열을 고체 표면으로부터 거리를 두고 고정하기 위해 고체 표면과 PNA 염기 서열 사이에 스페이서(spacer)를 삽입할 수 있다. 예를 들면, PNA 염기 서열의 아민 말단에 다음과 같은 스페이서를 아미드 결합으로 1개 또는 여러 개 연결하여 사용한다.
Figure 112007090018537-pat00005
본 발명의 다중 아민기를 갖는 PNA는 하기 일반식 1로 표현된다.
[일반식 1]
Figure 112007090018537-pat00006
[상기 식에서, Z는 핵산 염기 8 내지 30개의 PNA 올리고머이며, 상기 PNA 올리고머의 아민(N) 말단에 A가 결합되는 것으로,
A는 화학결합이거나,
Figure 112007090018537-pat00007
이며;
D는 탄소수 8 내지 200의 알킬렌이고, 상기 알킬렌의 탄소는 질소, 산소 또는 카보닐로 하나 이상 치환될 수 있고;
L1, L2 및 L3는 서로 독립적으로 화학결합이거나 탄소수 1 내지 10의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 하나 이상의 산소(O)로 더 치환될 수 있고;
X는 CH 또는 N이고;
m은 2 ~ 10의 정수이며;
n은 0 또는 1 이다.]
본 발명에서는 상기 일반식 1에 나타낸 바와 같이, PNA 올리고머의 아민 말단에 스페이서로
Figure 112007090018537-pat00008
[D는 탄소수 8 내지 200의 알킬렌이고, 상기 알킬렌의 탄소는 질소, 산소 또는 카보닐로 하나 이상 치환될 수 있다]를 결합시켜 PNA 염기 서열을 고체 표면으로부터 거리를 두어 고정할 수 있는 스페이서로 이용하며, 하기 구조로 예시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Figure 112007090018537-pat00009
바람직하게는 상기 일반식 1의 다중 아민기를 갖는 PNA에서 L1, L2 및 L3는 서로 독립적으로 화학결합이거나 -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- 또는 -CH2CH2CH2CH2-이고, X는 CH 또는 N이며, m은 2~7의 정수이며, n은 0 또는 1이다. 상기 일반식 1에서
Figure 112007090018537-pat00010
를 제외한 나머지 부분에 대해 구체적으로 예를 들면 하기 화학식 1-1 내지 화학식 1-4로 표시되는 다중 아민기를 포함하고 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1-1]
Figure 112007090018537-pat00011
[화학식 1-2]
Figure 112007090018537-pat00012
[화학식 1-3]
Figure 112007090018537-pat00013
[화학식 1-4]
Figure 112007090018537-pat00014
화학식 1-1, 1-2, 1-3은 아민 작용기를 4개 포함하고 화학식 1-4는 아민 작용기를 8개 포함한다. 화학식 1-2, 1-3은 4개의 아민 작용기가 분지한 곳으로부터 모두 같은 거리만큼 떨어져 있는 대칭적 다중 아민기를 가지고 있는 반면, 화학식 1-1는 아민 작용기 4개가 분지한 곳으로부터의 거리가 같지 않은 비대칭적 다중 아민기를 가지고 있다.
본 발명의 상기 일반식 1의 다중 아민기를 갖는 PNA는 하기 일반식 2의 PNA 올리고머 유도체에 하기 일반식 3으로 표시되는 다중 아민기를 갖는 단량체를 순차적으로 2 내지 10회 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 한다.
[일반식 2]
Figure 112007090018537-pat00015
[일반식 3]
Figure 112007090018537-pat00016
[상기 식에서, Z 및 A는 상기 일반식 1에서의 정의와 동일하고;
L1, L2 및 L3는 서로 독립적으로 화학결합이거나 탄소수 1 내지 10의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 하나 이상의 산소(O)로 더 치환될 수 있고;
X는 CH 또는 N이고;
Y는 아민 보호기이며;
n은 0 또는 1 이다.]
상기 일반식 3으로 표시되는 다중 아민기를 갖는 단량체를 PNA 올리고머에 순차적으로 결합시키는 화학반응시 다중 아민기를 갖는 단량체의 아민기를 보호하기 위하여 통상의 아민 보호기를 사용할 수 있다. 이러한 보호기에는 9-플루오레닐메틸 카바메이트(9-fluorenylmethyl carbamate, Fmoc), t-부톡시카보닐(t-butoxycarbonyl, Boc), 트리틸(Trityl), 벤질, 클로로아세틸, 벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, 포밀, 트리플루오로아세틸, p-톨루엔술포닐, 벤젠술포닐, 메탄술포닐, p-니트로벤질옥시카보닐 및 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐 등이 있다.
바람직하게는 상기 일반식 3의 다중 아민기를 갖는 단량체에서 L1, L2 및 L3는 서로 독립적으로 화학결합이거나 -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- 또는 -CH2CH2CH2CH2-이고, X는 CH 또는 N이며, n은 0 또는 1이다. 구체적으로 예를 들면 Fmoc 작용기로 보호된 하기 화학식 3-1 내지 화학식 3-3의 단량체를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 3-1]
Figure 112007090018537-pat00017
[화학식 3-2]
Figure 112007090018537-pat00018
[화학식 3-3]
Figure 112007090018537-pat00019
또한 본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 대한민국 등록특허 10-0464261의 방법에 따라 Benzothiazolesulfonyl(Bts)기로 보호된 PNA 단량체로부터 합성될 수 있으며, 또한 Fmoc 또는 t-Boc으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성될 수도 있다[P.E. Nielsen (Ed.) “Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications”2nd Ed. (Horizon Bioscience, 2004)]. PNA 합성 방법에 따라 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 일반식 1의 다중 아민기를 갖는 PNA는 도 1에 나타낸 바와 같이, PNA 단량체를 이용하여 합성된 PNA 올리고머의 아민 말단 또는 PNA 올리고머에 연결된 스페이서의 아민 말단에 1개의 카복실기와 2개 이상의 분지된 아민기를 가진 단량체 화합물을 2회 이상 순차적으로 결합시켜 합성되며, 상기 PNA의 아민 말단에 아민기가 4개 이상 형성되어 있는 것을 특징으로 한다.
도 1에 본 발명에 따른 다중 아민 링커가 중합된 PNA의 합성과정을 도식화하였다. 합성과정은 PNA 올리고머의 아민기에 결합되어 있는 보호기를 제거하는 탈보호 (deprotection) 과정, 다중 아민기를 갖는 단량체를 PNA에 결합시키는 중합 (coupling or conjugation) 과정, 반응하지 않은 아민기의 활성을 제거하는 캡핑 (capping) 과정의 총 3단계로 이루어진다.
첫 번째 탈보호 (deprotection) 과정은 PNA 의 아민 말단 잔기를 보호하고 있는 Fmoc, Boc 또는 Trityl 등의 아민 보호기를 일반적인 방법에 의해 제거하는 과정이다. 보호기에 따라 Fmoc의 경우 10 ~ 20% 피페리딘의 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF) 용액을 이용하며, Boc 또는 Trityl의 경우 TFA (trifluoroacetic acid)의 DMF 또는 디클로로메탄 용액이 이용된다. 상기 아민 보호기를 제거함으로서 아민 말단 잔기가 활성화되어 여기에 다중 아민기를 갖는 단량체가 결합할 수 있게 된다.
두 번째 중합 (coupling) 과정은 다중 아민기를 갖는 단량체를 PNA의 N-말단에 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 과정이다. 상기 다중 아민기를 갖는 단량체와 PNA의 중합 과정은 일반적으로 펩티드 합성에 사용되는 커플링 제제를 이용하여 진행될 수 있다. 커플링 제제에는 DIC (diisopropylcarbodiimide), DCC (dicyclohexylcarbodiimide), HATU, HOAt, HODhbt (L. A. Carpino et . al ., J. Am. Chem . Soc., 1993, 115, 4397-4398), HAPyU, TAPipU (A. Ehrlich et . al ., Tetrahedron Lett., 1993, 4781-4784), HBTU (V. Dourtoglou et . al ., Synthesis, 1984, 572-574), TBTU, TPTU, TSTU, TNTU (R. Knorr et . al., Tetrahedron Lett., 1989, 1927-1930), TOTU, BOP (B. Castro et . al., Tetrahedron Lett., 1975, 1219-1222), PyBOP (J. Coste et . al., Tetrahedron Lett., 1990, 205-208), BroP (J. Coste et . al ., Tetrahedron Lett., 1990, 669-672), PyBroP (J. Coste et . al., Tetrahedron Lett., 1991, 1967-1970) 등이 있으며, 이에 의해 제한되는 것은 아니다.
세번째 캡핑 (capping) 과정은 커플링 과정에서 다중 아민기를 갖는 단량체와 반응하지 않은 아민기를 무수아세트산 (acetic anhydride)를 이용하여 캡핑 (capping)하여 불필요한 반응이 일어나지 않도록 하는 과정이다. 상기한 세 과정을 반복적으로 수행하면 아민의 수는 반복된 반응 수에 따라 증가하게 된다. 단량체의 결합반응 회수를 m이라 할 때 말단의 아민 개수는 2m 으로 증가된다.
상기와 같이 3 단계의 과정 통해 제작한 PNA-다중 아민기 중합체는 마지막으로 아민 보호기를 제거한 후 고체상에서 분리된다. 분리된 PNA-다중 아민기 중합체를 고체 표면에 고정하여 핵산 염기 서열 또는 유전자 검출에 이용한다. PNA-다중 아민기 중합체를 정제하여 사용할 수도 있다.
말단의 아민기를 이용하여 고체 표면에 고정화하는 일반적인 방법을 이용하여 본 발명의 다중 아민기를 갖는 PNA를 기능화된 고체 표면에 고정화시킨다.
상기 고형물질은 실리카, 실리콘 반도체, 자성분자, 나이론(nylon), 폴리디메틸실록세인(poly(dimethyl siloxane), PDMS)의 고분자 화합물, 셀룰로스 또는 니트로셀룰로스가 바람직하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 고형물질의 표면은 알데히드 기, 카르복실 산 기, 에폭시 기, 이소티오시아네이트 기, N-하이드록시숙신이미딜 기 또는 활성화 에스터 기의 작용기로 기능화되어 있으며, PNA의 아민과 고체 표면의 작용기 간의 결합반응에 있어 상기 다중 아민기를 갖는 PNA를 이용함으로서 PNA 고정화 효율을 높일 수 있다. 상기 다중 아민기를 갖는 단량체의 반응 수가 높을수록 고정화 효율이 증가하게 되며 단량체의 반응 수가 2 내지 10회인 것이 바람직하고 더욱 바람직하게는 2 내지 7회이다.
본 발명의 다중 아민기를 갖는 PNA를 기능화된 고형물질의 표면에 고정하여 핵산 염기 서열을 검출하는 장치 또는 유전자 진단 키트를 제작할 수 있다. 이러한 장치에는 다수의 PNA 탐침을 2차원으로 배열한 PNA 마이크로어레이, PNA 칩, 수 ㎛ 크기의 마이크로구슬 표면에 PNA 탐침을 고정시켜 사용하는 방법, 실리콘 반도체 또는 실리콘 나노선(nanowire)에 고정한 PNA를 이용한 전계 효과 트랜지스터, 임피던스 검출기, 마이크로외팔보, 표면음파센서 등이 있으나, 본 발명이 이것들로 제한되는 것은 아니다.
상기에서 살펴본 것과 같이, 본 발명에 따른 다중 아민기를 갖는 PNA는 기능성 분자인 PNA의 아민 말단(N-terminal)에 다중 아민기를 갖는 단량체가 중합된 링 커를 가지고 있어 고체 표면에 효과적으로 PNA를 고정화시킬 수 있고, 이를 이용한 핵산 염기 서열 검출 장치 및 유전자 진단 키트에서 타겟 핵산의 검출 신호 세기, 민감도, 특이성을 개선할 수 있다.
다중 아민기를 갖는 PNA는 기능화된 유리기판 뿐만 아니라 기능화된 플라스틱 기판, 마이크로구슬, 멤브레인, 반도체 기판 등에 고정화되어 광범위하게 응용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예 1] N,N-비스-[3-(9H-플루오렌-9-일-메톡시카보닐아미노)-프로필]-숙신남산(N,N-Bis-[3-(9H-fluoren-9-yl-methoxycarbonylamino)-propyl]-succinamic acid, 화학식 3-3의 단량체 화합물)의 합성
도 2에서 나타난 바과 같이, 비스(3-아미노프로필)아민(bis(3-aminopropyl)amine)을 디클로로메탄(methylene chloride, MC)에 녹인 후 트리에틸아민(TEA)을 비스트리아미노프로필아민의 2몰 당량을 첨가했다. 이후 4℃로 냉각하고. Fmoc-N-하이드록시 숙신이미딜 에스터를 1.5 몰 당량으로 MC에 녹여 30분간 천천히 첨가했다. 여기에 1 N HCl을 가하고 50분간 교반했다. 이때 생성되는 흰색 고 형물질을 여과하여 분리한 후 흰색 고형물질을 MC로 세척하여 불순물을 제거함과 동시에 탈수했다. 상기 얻어진 고체를 공기를 가하여 건조했다.
건조된 고체를 MC와 TEA를 이용하여 녹인 후 무수 숙신산(succinic anhydride)을 같은 1.2 몰비로 첨가한 후 30분간 교반하여 반응시켰다. 1 N HCl을 첨가하여 세척하고 유기층을 얻어내고 유기층을 황산마그네슘 (MgSO4)를 이용하여 탈수한 후 MC와 메탄올의 10/1 혼합용매를 사용하여 컬럼 크로마토그라피 방법으로 분리하여 표제의 화합물을 80%의 수율로 합성하였다.
1H NMR (CDCl3, 300MHz) δ 7.74 (d, 4H), 7.58(t, 4H), 7.41-7.26 (m, 8H), 4.4-4.18 (m, 6H), 3.30-3.05 (m, 4H), 2.75-2.55 (m, 4H), 1.85-1.65 (m, 4H)
[실시예 2-10] 다중 아민기를 갖는 PNA 탐침(probe)의 합성
PNA 올리고머의 일반적 합성방법
PNA 올리고머는 대한민국 등록특허 10-0464261의 방법에 따라 Bts기로 보호된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 고체상 합성법(solid phase synthesis)으로 합성되었으며, N-말단에 스페이서(spacer)로 8-amino-3,6-dioxa-octanoic acid (이하 eg linker 라 함)를 2회 반복 사용하였으며 eg linker의 단량체로는 Fmoc을 아민 보호기로 사용한 8-(9H-fluoren-9-yl-methoxycarbonylamino)-3,6-dioxa-octanoic acid 를 사용하였다. PNA가 레진에 부착된 상태로 다음 반응에 이용되었다.
다중 아민기를 갖는 PNA 탐침( probe )의 일반적 합성 방법
a) 상기에서 제조된 레진에 부착된 PNA를 10% 피페리딘(piperidine)의 DMF 용액으로 20분간 처리하여 N-말단의 Fmoc 보호기를 제거한 후 DMF 로 세번 세척한다
b) 1당량의 Bis Fmoc 단량체 (화학식 3-1, 화학식 3-2 또는 실시예 1에서 제조된 화학식 3-3의 화합물), 1당량의 HOBt (N-hydroxybenzotriazole), 2당량의 DIC (diisopropylcarbodiimide)과 DMF를 가하고 1시간 동안 흔들어준 후 DMF 로 세번 세척한다.
c) 5% 무수아세트산 (acetic anhydride)와 6% 루티딘 (Lutidin)이 함유된 DMF를 첨가한 후 상온에서 5분간 흔들어준 후 DMF 로 세번 세척한다.
d) 상기 a)에서 c)의 과정을 원하는 만큼 반복하고 최종적으로 a)과정을 반복하여 Fmoc 보호기를 제거한다.
e) PNA 가 부착된 레진을 m-cresol/TFA (1/4 v/v) 용액으로 2시간 처리하여 PNA를 레진으로부터 떼어내고 에테르(ether)를 처리하여 석출시킨 후 HPLC로 정제하여 실시예 2~10의 다중 아민기를 갖는 PNA 화합물을 합성하였다.
[표 1]
Figure 112007090018537-pat00020
Figure 112007090018537-pat00021
[실시예 11-13] PNA 어레이의 제작
PNA 어레이 제작방법
a) 정제된 올리고머를 500 mM 염화나트륨이 함유되어있는 100 mM 카보네이트 버퍼 (pH 10)에 희석한다.
b) 에폭시기로 기능화 된 유리판에 핀 방식으로 스폿팅(spotting) 한다.
c) 75% 습도가 유지되는 상온에서 4시간 동안 정치한다.
d) DMF에 넣고 15분간 초음파세척을 한다.
e) 0.1 M 무수 숙신산이 함유된 DMF에 넣고 40℃에서 2시간 동안 보관한다.
f) DMF, 3차 증류수 순으로 15분간 초음파세척한다.
g) 0.1 M 에탄올아민이 들어있는 100 mM 트리스버퍼 (Tris-HCl)를 넣고 40C에서 2시간 동안 보관한다.
h) 유리기판을 3차 증류수로 15분간 초음파세척 과정을 두 번 반복한다.
i) 끓는 물에서 5분간 처리한 후 3차 증류수를 이용하여 5분간 세척한다.
상기한 PNA 에레이 제작방법을 이용하여 하기와 같이 실시예 11~13의 PNA 어 레이를 제작하였다.
실시예 11에서는 표 1의 실시예 2~4의 탐침들을 고정화 농도 50, 75, 100 uM의 농도로 희석하여 고정화하였다.
실시예 12에서는 표 1의 실시예 2, 실시예 3, 실시예 5, 실시예 6의 탐침들을 이용하여 PNA 어레이를 제작하였다.
실시예 13에서는 표 1의 실시예 7~10의 탐침을 이용하여 PNA 어레이를 제작하였다. 자체 제작한 에폭시 작용기가 표출된 슬라이드(슬라이드 1)와 알데히드 기가 표출된 상용의 A사 슬라이드(슬라이드 2), 에폭시 기가 표출된 상용의 슬라이드(슬라이드 3), 아민 슬라이드에 부탄디올 다이글리시딜에테르(butandiol diglycidylether)를 처리한 상용의 B사 슬라이드(슬라이드 4), 아민 슬라이드에 1,4-페닐렌 다이이소티오시아네이트(1,4-phenylene diisothiocyanate)를 처리한 상용의 C사 슬라이드(슬라이드 5), 활성화된 에스터 기가 표출된 상용의 D사의 슬라이드(슬라이드 6)를 사용하였다.
Figure 112007090018537-pat00022
[실시예 14-15] DNA 올리고머와 혼성화된 PNA 어레이의 고정화 효율 측정
상기된 실시예 11에서 제작된 PNA 어레이에 탐침의 고정화 정도를 비교하기 위해 하기 표 2와 같이 5'-말단에 Cy3 형광물질을 표지한 DNA 올리고머를 혼성화하여 형광 세기를 비교하였다.
[표 2]
Figure 112007090018537-pat00023
합성 DNA 올리고머의 혼성화 반응 방법
a) 100 ㎕의 혼성화 용액 (hybridization solution)이 들어갈 수 있도록 제작된 실리콘 고무 실링 매트(silicon rubber sealing mat)를 PNA 어레이에 밀착시킨다.
b) 타겟 DNA 올리고머를 150 mM 의 염화나트륨이 포함된 100 mM 트리스버퍼 (Tris-buffer, pH 7.6)에 희석한다.
c) PNA 어레이의 밀착된 실리콘 고무 실링 매트에 형성된 반응기(well)에 타겟 DNA 올리고머가 희석된 버퍼 100 ㎕를 첨가한다.
d) 40℃에서 2시간동안 혼성화 반응을 시킨다.
e) 유리기판 위의 실리콘 고무 실링 매트를 제거한 후 10 mM 인산버퍼 (phosphate buffer)를 이용하여 5분간 2회 세척한다.
f) 슬라이드를 건조한다.
g) 형광스케너를 이용하여 형광세기를 측정한다.
실시예 14에서는 상기 실시예 11에서 제작한 PNA 어레이에 상기 혼성화 반응 방법을 이용하여 타겟 DNA 올리고머 1 및 타겟 DNA 올리고머 2를 혼성화한 후 형광 세기를 도 3a 내지 도 3c에 나타내었다.
도 3a에 표지화된 타겟 DNA 올리고머 1과 상기 실시예 11의 PNA 어레이를 혼성화한 결과를 나타내었다. 상보적인 염기 서열인 PNA 4-1, 4-2 탐침에서 나오는 형광 세기가 그렇지 않은 PNA 4-3, 4-4 탐침에서 나오는 신호보다 컸다. 또한 상보적인 염기 서열인 PNA 3-1, 3-2 탐침에서 나오는 형광 세기가 그렇지 않은 PNA 3-3, 3-4 탐침에서 나오는 신호보다 컸다. 그리고 PNA 탐침의 염기 서열이 같은 경우 PNA 2-1, 3-1, 4-1 탐침의 순서로 형광 신호의 크기가 더 컸다. PNA 2-2, 3-2, 4-2 탐침의 경우도 같은 순서로 형광 신호의 크기가 더 컸다. 이 순서는 고정화하기 전 PNA 탐침 말단의 아민기 수(차례로 1, 4, 8)의 순서와 같으므로 말단 아민기의 수가 많을수록 검출 신호가 증가하는 것을 알 수 있다.
표지화된 타겟 DNA 올리고머 2와 상기 실시예 11의 PNA 어레이를 혼성화한 결과를 나타낸 도 3b에서도 같은 결론을 얻을 수 있다. 상보적인 염기 서열인 PNA 4-3, 4-4 탐침에서 나오는 형광 세기가 그렇지 않은 PNA 4-1, 4-2 탐침에서 나오는 신호보다 크고, PNA 3-3, 3-4 탐침에서 나오는 형광 세기가 PNA 3-1, 3-2 탐침에서 나오는 신호보다 컸다. 그리고 PNA 탐침의 염기 서열이 같은 경우 PNA 2-3, 3-3, 4-3 탐침의 순서로 형광 신호의 크기가 더 컸다. PNA 2-4, 3-4, 4-4 탐침의 경우도 같은 순서로 형광 신호의 크기가 더 컸다. 이 순서는 고정화하기 전 PNA 탐침 말단의 아민기 수(차례로 1, 4, 8)의 순서와 같으므로 말단 아민기의 수가 많을수록 검출 신호가 증가하는 것을 알 수 있다.
도 3c의 PNA 어레이를 스캔한 이미지에서도 PNA 2-1, 3-1, 4-1 탐침의 순서로, PNA 2-3, 3-3, 4-3의 순서로 형광 신호가 더 큰 것을 알 수 있다.
실시예 15에서는 상기 실시예 12의 PNA 어레이에 상기 혼성화 반응 방법을 이용하여 타겟 DNA 올리고머 2를 혼성화한 결과를 도 4a와 4b에 나타내었다.
도 4a에 표지화된 타겟 DNA 올리고머 2과 상기 실시예 12의 PNA 어레이를 혼성화한 후 측정한 형광 세기를 나타내었다. 상보적인 염기 서열인 PNA 2-3, 2-4 탐침에서 나오는 형광 세기가 그렇지 않은 PNA 2-1, 2-2 탐침에서 나오는 신호보다 크고, 상보적인 염기 서열인 PNA 3-3, 3-4 탐침에서 나오는 형광 세기가 그렇지 않은 PNA 3-1, 3-2 탐침에서 나오는 신호보다 크고, 상보적인 염기 서열인 PNA 5-3, 5-4 탐침에서 나오는 형광 세기가 그렇지 않은 PNA 5-1, 5-2 탐침에서 나오는 신호보다 크고, 상보적인 염기 서열인 PNA 6-3, 6-4 탐침에서 나오는 형광 세기가 그렇지 않은 PNA 6-1, 6-2 탐침에서 나오는 신호보다 크게 나타났다.
또한 고정화하기 전 PNA 탐침 말단의 아민기 수가 4개인 PNA 3-3, 3-4, 5-3, 5-4, 6-3, 6-4 탐침에서 나오는 형광 세기가 모두 PNA 탐침 말단의 아민기 수가 1 개인 PNA 2-3, 2-4 탐침에서 나오는 형광 세기보다 크게 나타났다.
도 4b에 표지화된 타겟 DNA 올리고머 2과 상기 실시예 12의 PNA 어레이를 혼성화한 후 측정한 형광 신호에서 염기서열 일치/불일치 신호 비율(perfect match/mismatch signal ratio, P/M 비율)을 나타내었다. PNA 탐침 말단의 아민기 수가 1개인 경우에는 P/M 비율이 7~8의 값을 보인다 (PNA 2-3/PNA 2-1, PNA 2-4/PNA 2-2). 하지만 PNA 탐침 말단의 아민기 수가 4개인 경우에는 P/M 비율이 모두 10을 초과하여 최대 35의 값을 보였다. 이로부터 다중 아민기를 사용하면 검출 신호의 세기가 커질 뿐만 아니라 특이성도 증가한다는 것을 알 수 있다.
PNA 3-1 탐침과 PNA 5-1 탐침은 PNA 염기 서열이 같고 다중 아민기 말단 부분이 다르다. 아민 기의 수는 4개로 같지만 분지한 곳으로부터 아민 기까지의 거리가 PNA 5-1 탐침에서는 같은 반면, PNA 3-1 탐침에서는 같지 않다. 마찬가지로 PNA 3-3 탐침과 5-3 탐침은 PNA 염기 서열이 같지만, PNA 5-3 탐침은 분지한 곳으로부터 4개의 아민까지의 거리가 같은 반면 PNA 3-3 탐침에서는 다르다. 도 5에 PNA 3-1, 5-1 탐침을 상보적인 염기 서열인 DNA 올리고머 1의 서로 다른 농도에서 혼성화한 결과와 PNA 3-3, 5-3 탐침을 상보적인 염기 서열인 DNA 올리고머 2의 서로 다른 농도에서 혼성화한 결과를 보였다. 분지한 곳으로부터 아민기까지의 거리가 같은 대칭적 다중 아민 링커를 사용한 PNA 5-1, 5-3 탐침의 경우가, 분지한 곳으로부터 아민기까지의 거리가 다른 비대칭적 다중 아민 링커를 사용한 PNA 3-1, 3-3 탐침보다 신호 세기가 더 큼을 알 수 있다 (도 5).
[실시예 16] 대장균 중합효소연쇄반응 산물을 이용한 PNA-DNA 혼성화 반응
대장균 (E. coli)의 16S rDNA 유전자를 주형으로 사용하여 DNA를 증폭시켰다. DNA 추출 키트 (Qiagen)를 이용하여 대장균의 DNA를 추출했으며, 하기 표 3과 같은 염기서열의, 합성한 DNA 올리고머를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 개시자(primer)로 사용하였다. 그리고 하기 표 4와 같은 조성의 PCR 액을 제조한 후, 하기 표 5와 같은 과정으로 PCR을 진행하였다.
[표 3] PCR 개시자
Figure 112007090018537-pat00024
[표 4] PCR 액
Figure 112007090018537-pat00025
[표 5] PCR 증폭 과정
Figure 112007090018537-pat00026
PCR 산물을 이용한 PNA - DNA 혼성화 반응 방법
상기 PCR 산물 5 ㎕를 분취하여 94℃에서, 5 분간 처리하고. 500 mM의 염화나트륨이 포함된 50 mM 인산버퍼를 혼합하였다. 여기에 1 mg/mL 의 Cy5-스트렙타비딘(Streptavidin)을 0.6 ㎕ 첨가하였다. 이것을 잘 섞은 후 실시예 13에서 자체 제작한 에폭시 슬라이드를 사용하여 제작한 PNA 어레이에 첨가하였다. 이것을 40℃에서 2시간 동안 혼성화 반응을 수행하였다. 이후 10 mM 인산버퍼를 이용하여 5분간 2회 세척한 후 건조하였다.
상기된 방법으로 PNA-DNA 혼성화 반응을 수행한 슬라이드를 형광스캐너를 이용하여 각 슬라이드에 고정화된 탐침에서 발생하는 형광강도를 비교하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
PNA 7-1, 8-1, 9-1, 10-1 탐침에서 15 핵산 염기의 서열은 같고 말단의 아민기 부분에 있어 차이가 있다. PNA 7-1은 말단의 아민 기가 1개이고 PNA 8-1, 9-1, 10-1 탐침은 말단에 아민기가 4개씩 달려 있다. PNA 7-2, 8-2, 9-2, 10-2 탐침에서 15 염기의 서열은 서로 같고 PNA 7-1, 8-1, 9-1, 10-1 탐침의 PNA 염기 서열과는 중앙의 1개 염기만이 틀리다.
말단에 아민기가 4개 달린 PNA 8-1, 9-1, 10-1 탐침의 신호 세기는 말단에 아민기가 1개 달린 PNA 7-1 탐침의 신호 세기보다 훨씬 크다. 그리고 15개의 염기 중 중앙의 1개가 다른 PNA 8-2, 9-2, 10-2 탐침은 형광 신호를 거의 보이지 않으므로 아민기가 4개 달린 PNA 8-1, 9-1, 10-1 탐침의 신호는 매우 특이적이다 (도 6a).
상기 다중아민링커가 중합된 PNA는 에폭시 기뿐만이 아니라 다른 여러 가지 반응기가 표출된 슬라이드에도 효과적이다. 도 6b을 보면 에폭시 슬라이드(슬라이드 1, 3)와 아민 슬라이드를 부탄디올 다이글리시딜에테르로 처리한 슬라이드(슬라이드 4)의 경우는 다중 아민 링커가 중합된 PNA가 단일 아민을 가진 PNA보다 훨씬 더 검출 신호가 강한 것을 알 수 있다. 활성화된 에스터 기가 표출된 슬라이드(슬라이드 6)에서도 다중 아민 링커가 중합된 PNA가 단일 아민을 가진 PNA보다 검출 신호가 더 강하였다. 알데히드 슬라이드(슬라이드 2)와 아민슬라이드를 1,4-페닐렌 다이이소티오시아네이트로 처리한 슬라이드(슬라이드 5)의 경우에는 다중아민링커가 중합된 PNA와 단일아민을 가지고 있는 PNA가 비슷한 검출 신호 세기를 보였다.
도 1 - 다중 아민기를 갖는 단량체와 PNA의 중합방법의 모식도 (R : 레진 (resin))
도 2 - 실시예 1의 다중 아민기를 갖는 단량체(화학식 3-1)의 합성 과정
도 3 - 링커의 아민기의 수에 따른 고정화 효율을 PNA 어레이를 이용하여 비교
도 4 - 다중아민링커의 고정화 효율과 P/M 비율을 PNA 어레이를 이용하여 비교
도 5 - 대칭적 다중 아민 링커와 비대칭적 다중 아민 링커의 신호세기를 PNA 어레이를 이용하여 비교
도 6 - 슬라이드 표면에 따른 고정화정도를 PNA 어레이를 이용하여 비교 (슬라이드 1 : 에폭시 슬라이드, 슬라이드 2 : 알데히드 슬라이드 (A 사), 슬라이드 3 : 에폭시 슬라이드 (A 사), 슬라이드 4 : 부탄디올 다이글리시딜 에테르 코팅한 아민 슬라이드 (B 사), 슬라이드 5 : 1,4-페닐렌 다이이소티오시아네이트 코팅한 아민 슬라이드 (C 사), 슬라이드 6 : 활성화 에스터 코팅 슬라이드 (D 사); 고정화 탐침 : PNA 7-1, PNA 8-1, PNA 9-1, PNA 10-1)

Claims (13)

  1. 하기 일반식 1로 표시되는 다중 아민기를 갖는 펩티드 핵산.
    [일반식 1]
    Figure 112009042099210-pat00027
    [상기 식에서, Z는 핵산 염기 8 내지 30개의 펩티드 핵산 올리고머이며, 상기 펩티드 핵산 올리고머의 아민(N) 말단에 A가 결합되는 것으로,
    A는 결합이거나,
    Figure 112009042099210-pat00028
    이며;
    D는 탄소수 8 내지 200의 알킬렌이고, 상기 알킬렌의 탄소는 질소, 산소 또는 카보닐로 하나 이상 치환될 수 있고;
    L1, L2 및 L3는 서로 독립적으로 결합이거나 탄소수 1 내지 10의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 하나 이상의 산소(O)로 더 치환될 수 있고;
    X는 CH 또는 N이고;
    m은 2 ~ 10의 정수이며;
    n은 0 또는 1 이다.]
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 일반식 1에서 L1은 결합이고, L2 및 L3는 서로 독립적으로 -CH2CH2CH2CH2-이고, X는 CH이고, m은 2 ~7 의 정수이며, n은 0인 것을 특징으로 하는 다중 아민기를 갖는 펩티드 핵산.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 일반식 1에서 L1은 -CH2-이고, L2 및 L3는 서로 독립적으로 -CH2CH2CH2-이고, X는 N이고, m은 2 또는 3이며, n은 0인 것을 특징으로 하는 다중 아민기를 갖는 펩티드 핵산.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 일반식 1에서 L1은 -CH2CH2-이고, L2 및 L3는 -CH2CH2CH2-이고, X는 N이고, m은 2 또는 3이며, n은 1인 것을 특징으로 하는 다중 아민기를 갖는 펩티드 핵산.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 일반식 1에서 A는 하기 구조로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다중 아민기를 갖는 펩티드 핵산.
    Figure 112007090018537-pat00029
  6. 하기 일반식 2의 펩티드 핵산 올리고머 유도체에 하기 일반식 3으로 표시되는 다중 아민기를 갖는 단량체를 순차적으로 반응시켜 일반식 1의 다중 아민기가 중합된 펩티드 핵산을 제조하는 것을 특징으로 하는 다중 아민기를 갖는 펩티드 핵산의 제조방법.
    [일반식 1]
    Figure 112009042099210-pat00030
    [일반식 2]
    Figure 112009042099210-pat00031
    [일반식 3]
    Figure 112009042099210-pat00032
    [상기 식에서, Z는 핵산 염기 8 내지 30개의 펩티드 핵산 올리고머이며, 상기 펩티드 핵산 올리고머의 아민(N) 말단에 A가 결합되는 것으로,
    A는 결합이거나,
    Figure 112009042099210-pat00033
    이며;
    D는 탄소수 8 내지 200의 알킬렌이고, 상기 알킬렌의 탄소는 질소, 산소 또는 카보닐로 하나 이상 치환될 수 있고;
    L1, L2 및 L3는 서로 독립적으로 결합이거나 탄소수 1 내지 10의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 하나 이상의 산소(O)로 더 치환될 수 있고;
    X는 CH 또는 N이고;
    Y는 아민 보호기이고;
    m은 2 ~ 10의 정수이며;
    n은 0 또는 1 이다.]
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 일반식 2에서 아민보호기인 Y는 플루오레닐메틸 카바메이트(Fmoc), t-부톡시카보닐(Boc), 트리틸(Trityl), 벤질, 클로로아세틸, 벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, 포밀, 트리플루오로아세틸, p-톨루엔술포닐, 벤젠술포닐, 메탄술포닐, p-니트로벤질옥시카보닐 또는 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐인 것을 특징으로 하는 다중아민기를 갖는 펩티드 핵산의 제조방법.
  8. 제 1항 내지 제 5항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 다중아민기가 중합된 펩티드 핵산을 알데히드 기, 카르복실산 기, 에폭시 기, 이소티오시아네이트 기, N-하이드록시숙신이미딜 기 또는 활성화 에스터기(NHS)가 표출된 고체 표면에 고정 화하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 고체는 유리기판, 플라스틱 기판, 실리카, 실리콘 반도체, 자성분자, 나이론(nylon), 폴리디메틸실록세인(poly(dimethyl siloxane), PDMS)의 고분자 화합물, 셀룰로스 또는 니트로셀룰로스인 것을 특징으로 하는 고정화하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 5항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 다중아민기가 중합된 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 염기 서열 검출 장치.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 핵산 염기 서열 검출 장치는 펩티드 핵산 마이크로어레이, 펩티드 핵산 칩, 펩티드 핵산 전계 효과 트랜지스터, 임피던스 검출기, 마이크로외팔보, 또는 표면음파센서로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 염기 서열 검출 장치.
  12. 제 1항 내지 제 5항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 다중아민기가 중합된 펩티드 핵산을 포함하는 유전자 진단용 키트.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 다중아민기가 중합된 펩티드 핵산은 알데히드 기, 카르복실산 기, 에폭시 기, 이소티오시아네이트 기, N-하이드록시숙신이미딜 기 또는 활성화 에스터기(NHS)가 표출된 고체 표면에 고정화된 유전자 진단용 키트.
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